楊嘉玉，韋　莉，王　菁，侯　磊，全　榮，朱珊珊，閻　旭，李子璇，劉　超，劉　爵

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技學(xué)院，北京昌平102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100097）

YANG Jia-yu1，2，WEI Li2，WANG Jing2，HOU Lei2，QUAN Rong2，ZHU Shan-shan2，YAN Xu2，LI Zi-xuan2，LIU Chao1，2，LIU Jue2（1.Animal Science and Techolagy College，Beijing University Of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

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豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達(dá)與間接ELISA方法建立

楊嘉玉1，2，韋莉2，王菁2，侯磊2，全榮2，朱珊珊2，閻旭2，李子璇2，劉超1，2，劉爵2

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科技學(xué)院，北京昌平102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100097）

摘要：為了檢測豬群中豬流行性腹瀉（PED）抗體水平，用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建含有PEDV N基因的重組桿狀病毒rBac-PEDV N并在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)。用純化的重組N蛋白作為包被抗原，建立了檢測PEDV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法。與Western Blot的符合率為91.3%，說明該方法適用于PED的臨床診斷。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；N蛋白；Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)；間接ELISA

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性高度接觸性豬腸道傳染病，主要臨床特征表現(xiàn)為水樣腹瀉、脫水、嘔吐和哺乳仔豬高度致死。由于變異毒株的出現(xiàn)，使得流行強度增大，病情更為復(fù)雜，引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注，但目前尚無商品化病毒血清檢測試劑盒。PEDV編碼的N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，而且在同種病毒之間具有高度的保守性[1]。同時，N蛋白還具有較強的抗原性，可以誘導(dǎo)宿主的細(xì)胞免疫和體液免疫，在病毒感染早期，豬體能迅速產(chǎn)生抗N蛋白抗體。鑒于N蛋白的特點，本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PEDV N蛋白，并用純化的N蛋白作為包被抗原，建立檢測血清樣品的PEDV間接ELISA方法，用于PEDV急性或感染早期的快速診斷具有很好的應(yīng)用前景[2-4]。

1　材料與方法

1.1主要材料豬流行性腹瀉糞樣、PEDV陽性及陰性血清、大腸桿菌宿主菌DH10Bac、Sf9昆蟲細(xì)胞和載體pFastBacHTA由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶BamH I、Xhol I、T4 DNA連接酶，購自NEB公司；RNeasy Mini Kit、Gel Extraction Kit、Plas?mid Mini Kit，購自QIAGEN公司；CellfectinⅡRe?agent和ProBond Purification System試劑盒，購自Invitrogen公司；HRP標(biāo)記的兔抗鼠及兔抗豬IgG、FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG，購自Sigma公司。

1.2重組N蛋白的表達(dá)與純化用RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV N基因與pFastBacHTA載體連接，獲得桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA-PEDVN。隨后，將其轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，獲得桿狀病毒重組質(zhì)粒Bacmid-PEDVN。將其轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，通過IFA鑒定，獲得表達(dá)N蛋白的重組桿狀病毒并命名為rBac-PEDVN。將rBac-PEDVN連續(xù)感染昆蟲細(xì)胞并純化重組N蛋白，隨后經(jīng)SDSPAGE和Western Blot對純化蛋白進(jìn)行分析。

1.3間接ELISA方法反應(yīng)條件的優(yōu)化及cut-off值的確定以純化的N蛋白作為包被抗原，用棋盤法確定蛋白最佳包被濃度和陰、陽性血清最佳稀釋度，同時對包被條件、封閉條件、血清作用時間、酶標(biāo)二抗工作條件及底物作用時間進(jìn)行逐一優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。按最佳反應(yīng)條件，對50份PEDV陰性血清進(jìn)行檢測，測得A450值。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，計算平均數(shù)（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），確定cut-off值。

1.4特異性試驗用建立的方法，對PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、TGEV陽性血清進(jìn)行檢測，確定包被抗原與其他常見豬傳染病的陽性血清是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.5敏感性試驗將10份PEDV陽性血清從1∶200開始進(jìn)行倍比稀釋至1∶3 200進(jìn)行檢測，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，對各A450值進(jìn)行判斷。

1.6重復(fù)性試驗取8份陽性血清和2份陰性血清，用同一批次純化的N蛋白包被ELISA板進(jìn)行檢測，再用不同批次純化的N蛋白包被ELISA板進(jìn)行檢測，計算批內(nèi)批間變異系數(shù)。

1.7比較性試驗取PEDV陽性血清32份和陰性血清48份，同時用已建立的間接ELISA方法和Western Blot方法進(jìn)行檢測，計算該間接ELISA方法的符合率。

1.8臨床應(yīng)用用建立的間接ELISA方法對采集的586份臨床血清樣品進(jìn)行快速檢測。

2　結(jié)果

2.1重組N蛋白的表達(dá)與純化通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功獲得在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)N蛋白的重組桿狀病毒，利用anti-His-tag單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，rBac-PEDVN感染的Sf9細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光（見中插彩版圖1-a），而對照Sf9細(xì)胞內(nèi)無特異性綠色熒光出現(xiàn)（見中插彩版圖1-b），將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果顯示，在分子量61 kD處出現(xiàn)單一條帶且與預(yù)期目的條帶大小相符（圖2），同時，利用anti-His-tag單克隆抗體和PEDV陽性血清進(jìn)行Western Blot檢測，在目的位置均出現(xiàn)特異性的條帶（圖3 A1，B2），而陰性對照無條帶顯現(xiàn)（圖3 A2，B1）。

圖3　Western Blot檢測純化的目的蛋白

2.2PEDV N蛋白間接ELISA方法相關(guān)條件的確定最佳條件判斷標(biāo)準(zhǔn)為：陽性血清A450值接近于1，陰性血清A450值較小，且陽性與陰性A450的P/N值最大的孔所對應(yīng)的反應(yīng)條件。通過棋盤法獲得以80 ng/孔純化的N蛋白包被酶標(biāo)板4℃過夜；PBST緩沖液洗滌3次，3 min/次；5%脫脂奶封閉1 h；洗滌后，血清樣本1∶200稀釋作用1 h；洗滌后，二抗1∶5 000稀釋作用30 min；洗滌后，TMB顯色液作用10 min，讀取A450數(shù)值為ELISA方法反應(yīng)的最佳條件。50份PEDV陰性血清樣品經(jīng)間接ELISA方法測定后，計算得陰性血清A450的平均值X為0.1096，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.0255，則cut-off值為0.186。因此，當(dāng)樣本A450值大于或等于0.186時，判為陽性，反之陰性。

2.3特異性試驗結(jié)果用間接ELISA方法對5種常見豬傳染病的陽性血清進(jìn)行檢測，A450值均小于0.186，呈陰性反應(yīng)（圖4），表明PEDV N蛋白不與其他豬傳染病陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

圖4　特異性試驗結(jié)果

2.4敏感性試驗結(jié)果檢測10份稀釋的陽性血清，當(dāng)血清稀釋至1 600時，A450值均大于0.186，呈陽性反應(yīng)（圖5），證明所建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性。

圖5　敏感性試驗結(jié)果

2.5重復(fù)性試驗結(jié)果批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗結(jié)果表明，批內(nèi)變異系數(shù)為2.18%～4.276%，批間變異系數(shù)為1.35%～6.41%，均小于10%，表明所建立的ELISA方法變異系數(shù)均在可接受的范圍內(nèi)，試驗具有可重復(fù)性。

2.6比較性試驗結(jié)果用建立的間接ELISA方法與Western Blot方法分別平行測定32份PEDV陽性血清和48份陰性血清，對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示間接ELISA方法和Western Blot方法的符合率為91.3%（表1）。

表1　兩種生物學(xué)方法敏感性和特異性的比較

2.7臨床血清樣品的檢測用已建立的ELISA方法檢測從不同地方采集的586份豬血清，結(jié)果血清陽性率在47%～100%之間，總體陽性率為92%。

3　討論

鑒于PEDV給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失，建立快速、準(zhǔn)確的診斷方法頗為急需。Hofmann 和Wyler[5]首次應(yīng)用全病毒包被的ELISA方法對PEDV感染情況進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查。然而，該病毒適應(yīng)細(xì)胞難不利大量制備診斷抗原，并且細(xì)胞毒中細(xì)胞成分會對抗體檢測產(chǎn)生非特異性干擾，影響檢測的特異性[6]。Hou等[7]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PEDVN蛋白，并用重組的N蛋白建立了檢測PEDV血清抗體的ELISA方法。本試驗所采用的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可對外源基因產(chǎn)物進(jìn)行各種翻譯后修飾，較原核表達(dá)系統(tǒng)更容易獲得具有正確結(jié)構(gòu)和修飾的活性蛋白[8-10]。所以，利用該系統(tǒng)表達(dá)的重組PEDV N蛋白更接近天然蛋白。

間接ELISA方法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度，為純化出高純度的蛋白，我們通過確定最佳接毒劑量、接毒時間、增加洗滌次數(shù)、改變洗脫液的pH值等方法來解決。通過一系列的條件優(yōu)化確定了ELISA的反應(yīng)條件并初步成功應(yīng)用于臨床血清樣品的檢測，為PEDV的診斷研究奠定了基礎(chǔ)。

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Development of an indirect ELSA based on recombinant porcineepidemic diarrhea virus nucleocapsid protein by Bac-to-Bac baculovirus expression system

YANG Jia-yu1，2，WEI Li2，WANG Jing2，HOU Lei2，QUAN Rong2，ZHU Shan-shan2，YAN Xu2，LI Zi-xuan2，LIU Chao1，2，LIU Jue2
（1.Animal Science and Techolagy College，Beijing University Of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

Abstract：To determine the level of antibody against PEDV in swine，the recombinant baculovirus rBac-N containing PEDV N gene was constructed and the expressed N protein in insect cell was obtained by Bac-to-Bac baculovirus expression system .An indirect ELISA method was developed to detect anti-PEDV antibody using the purified N protein as coating antigen .The coinci?dence rate was 91.3% when comparing with Western blot，and it could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis.

Key words：PEDV；nucleocapsid（N）protein；Bac-to-Bac baculovirus expression；ELISA Corresponding author：LIU Jue

中圖分類號：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0021-03

收稿日期：2016-01-08

基金項目：北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX-20161503）

作者簡介：楊嘉玉（1990-），女，碩士生，主要從事畜禽疾病診斷與防治，E-mail：yangjiayu1211@163.com

通訊作者：劉爵，E-mail：liujue@263.net