施瑩，林玲，闞佳音，劉海燕，馬增偉，李雙宇.齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾　6000；.齊齊哈爾醫(yī)學院病理學院微形態(tài)實驗中心，黑龍江齊齊哈爾　6000

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MiR200對腎癌細胞纖維化影響的相關性分析

施瑩1，林玲1，闞佳音1，劉海燕2，馬增偉1，李雙宇1
1.齊齊哈爾醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學院病理學院微形態(tài)實驗中心，黑龍江齊齊哈爾161000

［摘要］目的研究MiR200對腎癌細胞纖維化的影響機制，為鑒定治療靶標提供理論依據(jù)。方法整群選取2013年1月—2015年1月該院收治的51例腎癌患者病例資料，于實驗室，建立腎癌細胞株模型，采用癌旁正常組織作為對照，應用細胞侵襲實驗和Westermblot法檢測靶基因蛋白表達方法進行試驗。結果MiR-200組在SN12-PM6和786-0平均穿膜細胞的個數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MiR-200組ZEB1蛋白表達下降，而在E-cadberin蛋白表達上升，經(jīng)相關系數(shù)比較，MiR-200的表達與E-cadberin成正相關（r=0.824）而ZEB1成負相關（r=-0.762）。結論MiR-200能夠調節(jié)皮脂纖維化的侵襲，降低ZEB1蛋白表達，從而E-cadberin蛋白表達上升。

［關鍵詞］MiR200；腎癌細胞；ZEB1；E-cadberin

隨著人類基因組學的不斷發(fā)展和重視，微小RNA已經(jīng)越來越受到人們的重視，其功能和控制人類基因至少三分之一編碼蛋白基因的表達。MicroRNA（miRNA）則是由長度19～25個核苷酸構成的非編碼小分子RNA［1］。該研究于2013年1月—2015年1月整群選取入住該院腎癌患者51例病理資料為研究對象，就miRNA在腫瘤纖維化中發(fā)揮的作用的相關性進行研究，為腎癌的發(fā)展提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

整群選取于2013年1月—2015年1月該院腎癌住院患者51例病理資料為研究對象，其中男性28例，女性23例，年齡43～78歲，平均年齡（62.63±4.89）歲，其中，中早期患者（局部進展性）39例，晚期患者（轉移型腎癌）12例。所有患者均經(jīng)病理學檢查診斷為腎癌患者［3］，并未合并糖尿病等其他臟器功能障礙患者。并取得患者知情同意，經(jīng)該院倫理委員會批準此項研究。

1.2細胞株

該研究選取腎癌組織和癌旁正常組織均來自該院腎臟外科手術切除樣本。選取其癌細胞株786-O和 A498。腎癌細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基采用1％青-鏈霉素和10％胎牛血清構成，至于37℃中5％CO2和相對濕度90％環(huán)境下培養(yǎng)箱中保存，保障良好的細胞貼壁狀態(tài)，根據(jù)細胞生長的情況進行2～4 d傳代一次。

1.3方法

1.3.1細胞侵襲實驗（1）包被基底膜：該研究采用培養(yǎng)液和50 mg/L Matrigel按體積8：1進行稀釋配置，包被位于Transwell小室的室面上，采用4℃進行風干。（2）水化基底膜：在小室中吸出殘余的液體，以孔為單位，每孔加入50 uL具有10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液。保持溫度為37℃，持續(xù)時間為30 min。待細胞脫離血清處于饑餓狀態(tài)12～24 h后在制備細胞懸液。（3）胰酶消化細胞，在消化終止后離心，去掉培養(yǎng)液，采用PBS進行洗滌，2次，再次使用BSA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使之重懸，使細胞濃度控制在1×105/mL。取細胞懸液100 uL，加入Transwell小室中，在24孔板下室加入由10％胎牛血清構成的培養(yǎng)液500 uL，培養(yǎng)24 h。（4）細胞計數(shù)：先用棉簽擦凈上室內(nèi)的細胞，采用0.1％的結晶紫染色，通過顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，計數(shù)其平均數(shù)。

1.3.2Westermblot法檢測靶基因蛋白表達（1）抗體：該研究抗體由Rabbbit polyclonal ZEB1、Rabbbit polyclonal E -cadherin、Rabbbit polyclonal β-Actin和Horseradish peroxidase -conjugate secondary goat anti -rabbit組成。（2）配置1XTris-甘氨酸電泳緩沖液，由18.8 g甘氨酸，3.03 g Tris，1 g SDS構成，使之蒸餾水溶解，配置成1 000 mL保存；配置轉膜緩沖液，由2.9 g甘氨酸，5.8 g Tris，在使用前添加200 mL甲醇，依然配置1 000 mL，配置10XTBS緩沖液，由24.2 g Tris，80 gNa-Cl，配置1 000 mL，和1XTBS緩沖液，1XTBS緩沖液由10XTBS緩沖液稀釋得到，所有緩沖液均室溫保存。（3）采用6孔板進行細胞蛋白樣品提取，每孔加入含有蛋白酶抑制劑和PMSF的蛋白裂解液150 uL，在冰上進行，上搖床震蕩20 min，刮下細胞，放置在1.5 mLEP中，然后進行超聲處理，在4℃環(huán)境下離心12 000 rpm，5 min后進行分裝至于-80℃保存。（4）BCA法測定蛋白樣品濃度：該操作方法嚴格按照試劑盒說明操作。然后經(jīng)免疫反應和ECL化學發(fā)光和凝膠圖像儀進行分析結果。

1.4統(tǒng)計方法

運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行錄入、分析數(shù)據(jù)。計量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗進行統(tǒng)計推斷，計數(shù)資料采用（n，％）表示，組間比較采用Χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1MiR-200抑制腎癌細胞侵襲能力分析

該結果通過Matrigel凝膠測量，觀察兩組24 h細胞穿透該凝膠的能力判斷抑制癌細胞侵襲能力。MiR-200組在SN12-PM6和786-0平均穿膜細胞的個數(shù)分別為42和35，經(jīng)Χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，均小于對照組，說明通過拮抗MiR-200可顯著抑制腎癌細胞的侵襲能力。見表1。

表1　兩組細胞侵襲能力比較

2.2MiR-200調控ZEB1和E-cadberin表達情況比較

根據(jù)Wwsternblot結果顯示，MiR-200組ZEB1蛋白表達下降，而在E-cadberin蛋白表達上升，詳見表2。經(jīng)相關系數(shù)比較，MiR-200的表達與E-cadberin成正相關（r=0.824）而ZEB1成負相關（r=-0.762）。

表2　MiR-200調控各指標表達情況（Relative levels of miRNA）

3　討論

臨床資料顯示［4］，20％～30％在患有腎癌時已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉移，直接導致治療效果不佳，直接影響患者生存質量。上皮-間質轉化（EMT）是導致了轉移的重要依據(jù)，它是通過上皮細胞特定的形態(tài)學增生繁殖的過程，加快了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，通過組織重建的生理現(xiàn)象，直接導致了組織纖維化的病理過程，從而進一步加速了腫瘤的侵襲。Honeyman研究表明［6］，E-鈣黏蛋白（E-cadberin）是細胞間的粘附分子，對細胞間的連接，阻止細胞侵襲起到了至關重要的作用，它的表達水平下降直接導致粘附能力下降，使細胞間連接受到阻礙，從而促進了腫瘤細胞的侵襲。這與該研究得到結論一致。該研究也為證實E-cadberin在腎癌細胞中也有表達，表達量分別為0.99和1.07，得到了一致的結果。該研究顯示，MiR-200在腎癌中也是通過ZEB1起到了EMT作用，從而促使其癌細胞的侵襲，通過檢測，MiR-200組ZEB1蛋白表達下降，而在E-cadberin蛋白表達上升，并且在相關性檢驗中，MiR-200的表達與E-cadberin成正相關而與ZEB1成負相關（r=-0.762），說明MiR-200可以抑制ZEB1的表達從而提高E-cadberin的表達，MiR-200的含量越低E-cadberin的含量也越低，細胞的侵襲能力也越強。這些結果都和相關其他研究得到了類似的研究結果，目前研究中，都證實MiR-200與E-cadberin表達具有關聯(lián)，其研究計算相關系數(shù)為r= 0.736，該研究根據(jù)數(shù)據(jù)得知其具有正相關關系（r= 0.824），而存在于中間變量即為ZEB1的表達，ZEB1的表達在這中間起到了橋梁的作用，這些都有助于鑒定未來有意義的治療靶向，為抑制腎癌轉移提供科學依據(jù)。

綜上所述，隨著對microRNA的研究機制越來越系統(tǒng)化和科學化，人們對其的認識也會越來越多，目前很多學者正在研究使用藥物抑制腫瘤增生纖維化，從而抑制腫瘤細胞侵襲和轉移，而miRNA在腫瘤中扮演著重要的作用，因此如何在MiR-200在腫瘤中低表達的水平得到補充，補充的MiR-200是否也可以抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲，需要進一步的體內(nèi)研究實驗才能證實，該研究立足于腎癌機制研究，將有助于了解腎癌細胞侵襲轉移的過程，為未來研究提供了理論基礎。

［參考文獻］

［1］Beyer TA，Narimatsu M，Weiss A，et al. The TGFbeta superfamily in stem cell biology and early mammalian embryonic development［J］. BiochimBiophysActa，2013，1830（2）：2268-2279.

［3］那彥群，孫光，葉章群，等.2014版中國泌尿外科疾病診斷治療指南［Z］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

［4］Li M，Krishnaveni MS，Li C，et al. Epithelium -specific deletion of TGF-beta receptor type II protects mice from bleomycin -induced pulmonary fibrosis［J］. J Clin Invest，2011，121（1）：277-287.

［6］Honeyman L，Bazett M，Tomko TG，et al. MicroRNA profiling implicates the insulin -like growth factor pathway in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］. Fibrogenesis Tissue Repair，2013，6（1）：16.

［7］Abdel A M，Wassef M A，Ahmed H H，et al. The role of bone marrow derived-mesenchymal stem cells in attenuation of kidney function in rats with diabetic nephropathy［J］. DiabetolMetab Syndr，2014，6（1）：34.

［8］Pieraccioli，M，Imbastari，F(xiàn)，Antonov，A，et al.Activation of miR200 by c-Myb depends on ZEB1 expression and miR200 promoter methylation［J］.Cell cycle，2013，12（14）：2351-2359.

Correlation Analysis of Effect of MiR200 on Renal Carcinoma Cell Fibrosis

SHI Ying1，LIN Ling1，KAN Jia-yin1，LIU Hai-yan2，MA Zeng-wei1，LI Shuang-yu1
1.Department of Nephrology，Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China；2.Micro Morphology Experimental Center，Institute of Pathology of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China

［Abstract］Objective To research the effect mechanism of MiR200 on renal carcinoma cell fibrosis and provide theoretical basis for identification and treatment of target. Methods The data of 51 cases of patients with renal carcinoma treated in the central laboratory of Qiqihar medical school were selected，the renal cell carcinoma strain model was built，the adjacent normal tissue was used for contrast，the target gene and protein expression was detected by cell invasiveness experiment and Westermblot method，and the correlation between the invasion ability of renal carcinoma cell of MiR-200 and ZEB1，E-cadberin and MiR-200 was analyzed. Results The difference in the average penetrating cell number of SN12-PM6 and 786-0 in the MiR-200 group had statistical significance，P＜0.05，the ZEB1 protein expression in the MiR-200 group decreased，but the E-cadberin protein expression in the MiR-200 group increased，and the correlation coefficient comparison showed that the miR-200 expression was positively correlated with E-cadberin，（r=0.824）but was negatively correlated with ZEB1，（r=-0.762）. Conclusion MiR-200 can adjust the invasion of sebum fibrosis and reduce the ZEB1 protein expression thus increasing the E-cadberin protein expression.

［Key words］MiR200；Renal carcinoma cell；ZEB1；E-cadberin

［中圖分類號］R737.11

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）05（b）-0084-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.084

［基金項目］齊齊哈爾市科學技術計劃項目任務（FSGG201422）。

［作者簡介］施瑩（1975.6-），女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腎臟疾病。

收稿日期：（2016-02-17）