李清亮,　周月涵,　丁　健,　段作營,　金　堅,　李華鐘

1. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2. 江南大學 藥學院，江蘇無錫 214122

畢赤酵母GS115表達HSA-GCSFm的誘導工藝研究

李清亮1,周月涵1,丁健1,段作營1,金堅2,李華鐘1

1. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2. 江南大學 藥學院，江蘇無錫 214122

摘要：本文探討了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混誘導對重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm表達HSA-GCSFm的影響。結果顯示：甲醇供應充足條件下HSA-GCSFm表達水平僅為37 mg·L-1，而甲醇添加受限條件下HSA-GCSFm表達水平可達到239 mg·L-1；甲醇添加受限并添加胰蛋白胨條件下，HSA-GCSFm表達水平可以提高到266 mg·L-1；在此基礎上，流加山梨醇作為輔助碳源，表達水平可大幅提高至424 mg·L-1。通過對各誘導條件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配進行分析后發(fā)現(xiàn)，將甲醇限制在低濃度同時添加胰蛋白胨與山梨醇，可以改善細胞代謝活性，增加細胞用于HSA-GCSFm合成的碳流分配量，降低胞外蛋白酶活性，從而提高了HSA-GCSFm的表達水平并緩解了HSA-GCSFm的降解。因此，該誘導工藝適于畢赤酵母高效表達HSA-GCSFm。

關鍵詞：畢赤酵母； HSA-GCSFm； 甲醇流加策略； 胰蛋白胨； 山梨醇

粒細胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)由174個氨基酸殘基組成，分子量為19.6 kDa，是一種由單核細胞和纖維組織母細胞產生的糖蛋白[1, 2]。G-CSF作用于骨髓中性粒細胞系造血前體細胞，促進其增殖、分化，促進中性粒細胞的成熟和釋放，在臨床上可用于治療因放化療而引起的中性粒細胞減少與再生障礙性貧血[3-5]。但是，G-CSF分子量較小，易被腎小球過濾，導致其在體內半衰期短。為了解決這一難題，本研究室將G-CSF突變體(GCSFm)與人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA，66 kDa)進行基因融合并在畢赤酵母GS115中成功表達。融合蛋白HSA-GCSFm(86 kDa左右)兼具HSA抗原性及G-CSF活性，且突變型融合蛋白活性高出野生型融合蛋白30倍，具有良好的應用前景[6]。

典型的畢赤酵母發(fā)酵過程包括細胞生長期和甲醇誘導期兩個階段。為了進一步提高HSA-GCSFm產量，有必要從以下幾個方面對其誘導表達工藝進行深入研究。首先，甲醇既作為誘導劑又作為碳源，其添加量對HSA-GCSFm表達水平有很大影響[7]。在誘導過程中確定最優(yōu)的甲醇添加量對于HSA-GCSFm的高效表達十分重要。此外，畢赤酵母表達的重組蛋白易被降解，不但影響目標蛋白蛋白的產量還給后續(xù)的純化帶來困難[8]。因此在誘導表達過程中抑制其降解，也是提高HSA-GCSFm表達水平的有效途徑之一。有文獻報道，在甲醇誘導階段添加輔助碳源山梨醇也同樣可以提高目標蛋白表達水平[9]。因此，本研究從以上三個方面出發(fā)，將甲醇流加、抑制HSA-GCSFm降解以及山梨醇共混流加相結合，以尋求適用于HSA-GCSFm高效表達的最佳誘導工藝。

1材料與方法

1.1實驗菌株

重組畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115(pPIC9K-HSA-GCSFm)，由江南大學藥學院分子藥理學實驗室構建[6]。

1.2主要試劑與儀器設備

酵母浸粉、胰蛋白胨均由英國Oxiod公司生產，尿微量白蛋白檢測試劑盒由上海名典生物工程公司生產，蛋白酶分析試劑盒由美國Invitrogen公司生產，其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

蛋白電泳設備(美國Bio-Rad公司)，生化培養(yǎng)箱(上海安亭科學儀器廠)，恒溫搖床(江蘇強樂實驗設備有限公司)，分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo公司)，尾氣分析儀(LKM2000A，韓國LOKAS公司)，GC112A氣象色譜儀(上海精密科學儀器有限公司)，F(xiàn)c-2002甲醇電極(華東理工大學)。

1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖 20 g，酵母浸粉 10 g，胰蛋白胨 20 g。用于重組畢赤酵母種子培養(yǎng)。

初始培養(yǎng)基(3.5 L)：甘油 70 g，(NH4)2SO416.8 g，MgSO43.5 g，CaSO40.35 g，K2SO43.5 g，KOH 70 g，磷酸70 mL，PTM135 mL，pH 6.0。

甘油流加培養(yǎng)基(2 L)：甘油 1000 g，(NH4)2SO41 g，MgSO40.06 g，KH2PO40.5 g，組氨酸 4.0 g，PTM120 mL，pH 6.0。

甲醇補料培養(yǎng)基(1 L)：甲醇 500 mL，MgSO40.03 g，(NH4)2SO40.5 g，PTM110 mL，pH 6.0。

山梨醇補料培養(yǎng)基(1 L)：山梨醇 500 g。

PTM1(1 L)：MnSO4·H2O 3.0 g，CuSO4·5H2O 6.0 g，Na2MoO4·2H2O 0.2 g，CoCl2·6H2O 0.5 g，ZnCl220.04 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.05 g，生物素0.4 g，濃H2SO45 mL，NaI 80 μg，H3BO30.02 g。

1.4分析方法

1.4.1菌體密度的測定

以ddH2O調零點，將發(fā)酵液進行適當稀釋，使稀釋液在600 nm的吸光度處于0.1～0.7范圍內，細胞密度(OD600)=分光光度計讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.4.2發(fā)酵狀態(tài)在線測量

利用尾氣分析儀測定發(fā)酵尾氣中的O2和CO2分壓，將數(shù)據(jù)記錄于工業(yè)控制計算機中，按文獻[10]所報道的公式在線計算攝氧速率(oxygen uptake rate，OUR)和CO2釋放速率(carbon dioxide evolution rate，CER)。利用電子天平在線記錄甲醇流加瓶的質量損失，并據(jù)此計算甲醇的實際添加量，以及特定發(fā)酵時刻和時間間隔內的甲醇平均消耗速率。

1.4.3HSA-GCSFm濃度測定

利用尿微量蛋白檢測試劑盒測定樣品中HSA的含量，根據(jù)公式C(HSA-GCSFm)=1.30×C(HSA)來計算融合蛋白的濃度，其中1.30代表HSA-GCSFm與HSA的相對分子質量之比。

1.4.4甲醇濃度與山梨醇濃度檢測方法

甲醇濃度采用氣相色譜儀測定，色譜條件見文獻所述[10]。

山梨醇濃度采用高效液相色譜法測定選用示差折光檢測器 (RID)，采用Aglient氨基柱(250×4.6 mm)，進樣量20 μL，柱溫控制在30 ℃；流動相包含70%乙腈和30%超純水，流速設定在1.0 mL·min-1。

1.4.5蛋白酶活性測定

參照參考文獻[11]進行。

1.4.6SDS-PAGE蛋白電泳

參照參考文獻[12]進行。

1.5培養(yǎng)方法

1.5.1畢赤酵母的高密度培養(yǎng)方法

在7 L發(fā)酵罐進行畢赤酵母細胞高密度培養(yǎng)，初始裝液量為3.5 L，接種量為20%，通氣量為1 vvm，溫度設定為30 ℃，整個過程通過流加氨水控制pH為6.0，調節(jié)攪拌轉速來調節(jié)溶氧在20%以上，當溶氧濃度(DO)反彈時，啟動DO-Stat流加程序進行甘油流加培養(yǎng)基的流加，當通空氣無法控制DO時向發(fā)酵罐內通入純氧。當發(fā)酵液OD600超過450以上時，終止流加甘油培養(yǎng)基，饑餓2 h待殘留的甘油以及其他中間代謝產物耗盡后，添加甲醇誘導HSA-GCSFm表達。

1.5.2甲醇流加策略

策略Ⅰ：誘導溫度為25 ℃，根據(jù)甲醇電極的示數(shù)自動調節(jié)流加速率使甲醇濃度維持在5 g/L左右。甲醇供應充足條件下耗氧劇烈，因此誘導過程全程通純氧將DO控制在10%左右。

策略Ⅱ：誘導溫度設定為25 ℃，全程通空氣誘導，不使用純氧。將DO設定為10%，按照下列公式修正甲醇流加速率：

其中：F表示甲醇流加速率(F≥ 0)；F*代表基準甲醇流加速率，本次實驗中F*=0.7 mL·min-1；控制參數(shù)Kc在實驗中設定為0.01。

1.6碳消耗速率的計算

甲醇消耗速率Rmeth(t)(g·L-1·h-1)與山梨醇消耗速率Rsor(t)(g·L-1·h-1)通過公式(1)與(2)計算。式中cmeth(t)與csor(t)為離線測定的甲醇質量濃度與山梨醇質量濃度，單位為g·L-1；N為2次取樣之間的時間間隔，單位為h；V為發(fā)酵體積，單位為L；mmeth(t)與msor(t)為t～(t+N)h之間甲醇的流加量與山梨醇的流加量，單位為g。碳消耗速率Rc(t)(mol·L-1·h-1)由公式(3)計算得到。其中32.04和182.17分別是甲醇和山梨醇的摩爾質量，單位為g·mol-1。

(1)

(2)

(3)

1.7碳流分配計算

假設一部分碳源進入異化途徑，被完全氧化為CO2，同時伴隨大量ATP生成，為細胞生命活動和蛋白質合成提供能量。其余碳源全部用于合成目標蛋白。采用本研究中所提出策略進行誘導的發(fā)酵批次中，流向能量代謝途徑以及蛋白合成途徑的碳流量可以通過計算得到。首先，t1～t2時間段內碳消耗總量Ctotal(mol·L-1)可由公式(4)計算

(4)

其次，t1～t2流向能量代謝途徑的碳消耗量Cenergy及流向蛋白合成途徑的碳流量Csynthesis可由公式(5)、(6)計算

(5)

(6)

2結果與討論

2.1甲醇濃度對HSA-GCSFm表達水平的影響

甲醇濃度是畢赤酵母表達外源蛋白過程中的關鍵環(huán)境因素。因此分別采用前述的甲醇流加策略Ⅰ和策略Ⅱ控制甲醇流加和發(fā)酵液中甲醇濃度，以比較甲醇添加充足和甲醇添加受限條件對HSA-GCSFm表達量的影響，結果如圖1a所示。

(a)

(b)

a：甲醇濃度變化及HSA-GCSFm表達曲線，■：HSA-GCSFm濃度，▲：甲醇濃度，實心：甲醇流加策略Ⅰ，空心：甲醇流加策略Ⅱ；b：誘導階段不同時間發(fā)酵上清液中HSA-GCSFm的SDS-PAGE鑒定，圖中1～12對應誘導時間分別為4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h；M：Protein Marker

圖1甲醇濃度變化及HSA-GCSFm表達狀況

從圖中可以看出，在誘導期的絕大部分時間內，采用策略Ⅰ的發(fā)酵，其甲醇濃度維持在4 g·L-1～6 g·L-1，而采用策略Ⅱ的發(fā)酵，其甲醇濃度則一直低于1 g·L-1。而目標蛋白表達結果顯示，采用策略Ⅰ的發(fā)酵批次，HSA-GCSFm的表達量僅為37 mg·L-1；而將甲醇濃度限制在較低水平，則HSA-GCSFm的表達量可以達到239 mg·L-1(圖1a)。由此可見，誘導階段甲醇受限條件更有利于HSA-GCSFm的表達。因此，之后的試驗均采用甲醇流加策略II，將甲醇添加控制在受限水平。

2.2添加胰蛋白胨及山梨醇對HSA-GCSFm發(fā)酵的影響

蛋白胨含有豐富的有機氮化合物、氨基酸等營養(yǎng)物質，不僅可用做畢赤酵母旳氮源維持其正常生理代謝，還可以作為外源蛋白的競爭性底物與蛋白酶結合來緩解外源蛋白的降解[13]。有文獻報道：將BMMY中的蛋白胨去除則測不出目的蛋白，總蛋白含量也大量減少，并得出氮源的缺乏是造成目標蛋白降解的重要原因[14]。畢赤酵母生長進入穩(wěn)定期后，由于發(fā)酵液中代謝產物積累、氮源營養(yǎng)物質逐漸耗盡而形成不利于細胞生存的環(huán)境，進而對外源蛋白的表達產生不利影響。為提高菌體的代謝活力與HSA-GCSFm表達水平，在仍然利用甲醇流加策略Ⅱ控制甲醇濃度的基礎上，在誘導階段每12 h添加35 g胰蛋白胨，并通過OUR與SDS-PAGE圖譜來考察重組畢赤酵母代謝活力與HSA-GCSFm表達狀況的變化，結果見圖2與圖3。

注：采用甲醇流加策略Ⅰ時以純氧供氧，氧氣分壓超出尾氣分析儀的量程而無法計算OUR

圖2不同批次發(fā)酵的OUR的變化

從圖2可以看出，添加胰蛋白胨的批次與對照批次相比， OUR獲得顯著的提升并趨于穩(wěn)定。有文獻報道，誘導階段高而穩(wěn)定的OUR是畢赤酵母高效表達外源蛋白的關鍵因素[15]。由圖3可知，在誘導階段添加胰蛋白胨后， HSA-GCSFm表達水平獲得顯著提高，在誘導48 h后表達量達到了266 mg·L-1(圖3a)，比對照批次提高了11.3%，而且66 kDa降解片段有所減少，但是45 kDa降解片段無明顯減少(圖3c)。

(a)

(b)

(c)

(d)

a：不同批次的HSA-GCSFm的表達曲線，■：對照，●：采用甲醇誘導策略Ⅱ、添加胰蛋白胨，▲；采用甲醇誘導策略Ⅱ、添加胰蛋白胨與山梨醇；b：對照批次發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析；c：采用甲醇誘導策略Ⅱ、添加胰蛋白胨批次發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析；d：采用甲醇誘導策略Ⅱ、添加胰蛋白胨與山梨醇批次發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析；1～12對應誘導時間分別為4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h，M：Protein Marker

圖3不同批次的HSA-GCSFm的表達情況

在誘導過程中添加輔助碳源是提高目標蛋白表達水平的有效途徑之一。輔助碳源能夠為蛋白合成途徑提供額外的ATP，減輕甲醇的供能壓力，從而緩解甲醇異化途徑代謝中間物甲醛和甲酸對細胞的毒害作用[16]。為進一步提高HSA-GCSFm的表達水平，本研究在使用甲醇流加策略Ⅱ限制甲醇濃度和添加胰蛋白胨的基礎上，按照固定體積比流加山梨醇補料培養(yǎng)基(甲醇培養(yǎng)基∶山梨醇培養(yǎng)基=4∶1)，以期獲得HSA-GCSFm高效表達，結果見圖3a與圖3d。

從圖3a中可以看出，HSA-GCSFm表達量在誘導32 h后達到了424 mg·L-1，較只采用流加策略II的對照批次提高了93.6%，較只添加胰蛋白胨的發(fā)酵批次也提高了59.4%，并且目標蛋白降解獲得有效的控制(圖3d)。同時誘導階段具有水平較高且較穩(wěn)定的OUR(圖2)。

2.3采用甲醇流加策略Ⅱ各批次的胞外蛋白酶活性

誘導階段形成的不利于細胞的環(huán)境會促進蛋白酶的活化與分泌，還會引起菌體自溶而釋放胞內蛋白酶，進而導致外源蛋白的水解[17]。在本研究中，通過采用甲醇流加策略Ⅱ并添加胰蛋白胨與山梨醇能有效地控制HSA-GSCFm的降解。為進一步探求其抑制降解的原因，分別測定了對照批次、添加胰蛋白胨批次、添加胰蛋白胨與山梨醇的各批次的胞外蛋白酶活性，其結果如圖4所示。

○：對照(采用甲醇流加策略Ⅱ，不添加胰蛋白胨與山梨醇)；▲：采用甲醇誘導策略Ⅱ，添加胰蛋白胨；◇：采用甲醇誘導策略Ⅱ，添加胰蛋白胨與山梨醇

圖4不同批次誘導階段蛋白酶活性的變化

結果顯示，對照批次蛋白酶活性>添加胰蛋白胨批次蛋白酶活性>添加胰蛋白胨與山梨醇批次蛋白酶活性；在誘導48 h放罐后，添加胰蛋白胨批次、添加胰蛋白胨與山梨醇批次的胞外蛋白酶活性與對照批次相比分別下降了17.9%、54.3%。這表明添加胰蛋白胨與山梨醇可以減少胞外蛋白酶的分泌，進而控制HSA-GCSFm的降解。

2.4采用甲醇流加策略Ⅱ各批次碳流分配比較

計算對照批次、添加胰蛋白胨批次、添加胰蛋白胨與山梨醇批次的誘導48 h的碳流分配，結果如圖5所示。

圖5　不同批次碳流分配分析

從圖5中可以看出，同時添加胰蛋白胨與山梨醇，碳消耗總量為5.45 mol·L-1，分別是只添加胰蛋白胨和對照批次的1.1和1.6倍，其中有55.1%流入蛋白合成途徑，高于對照批次和只添加胰蛋白胨的批次(分別為49.2%和46.2%)。同時添加胰蛋白胨與山梨醇，不僅改善了細胞的代謝活性，提高了細胞碳代謝速率，而且改變了細胞內碳代謝流向，更多的碳源用于HSA-GCSFm合成，使得該批次中HSA-GCSFm的表達水平明顯高于其他批次。

3結論

綜上所述，本研究建立了一套適用于畢赤酵母GS115表達HSA-GCSFm融合蛋白的誘導工藝。該工藝通過采用控制溶解氧濃度間接限制甲醇流加速率的甲醇流加策略，同時補加胰蛋白胨與山梨醇，增強了細胞代謝活性，提高了碳消耗總量和用于蛋白合成途徑的碳流分配量，同時降低了胞外蛋白酶活性，緩解了HSA-GCSFm的降解，從而保證了HSA-GCSFm的高效表達。

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Study on induction method ofPichiapastorisexpressing HSA-GCSFm

LI Qing-liang1, ZHOU Yue-han1, DING Jian1, DUAN Zuo-ying1, JIN Jian2, LI Hua-zhong1

1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi, 214122, Jiangsu, China；2. School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi, 214122, Jiangsu, China

AbstractThe effects of methanol feeding control, adding tryptone and methanol/sorbitol co-feeding induction on the expression of HSA-GCSFm in Pichia pastoris GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm were discussed. The results showed that the concentration of HSA-GCSFm was only 37 mg·L-1when supply of methanol was sufficient, but the concentration of HSA-GCSFm increased to 239 mg·L-1when methanol was supplied restrictedly. Adding tryptone with methanol supplied restrictedly could increase concentration of HSA-GCSFm to 266 mg·L-1; and feeding sorbitol as auxilary carbon source simultaneously, the concentration of HSA-GCSFm increased to 424 mg·L-1. After analyzing OUR, extracellular protease activity and carbon distribution, it could be concluded that restricting methanol concentration at low level and adding tryptone and sorbitiol properly could improve metabolic activity of cells and increase carbon flux in protein synthesis route and reduce activity of extracellular protease. Therefore, this induction method enhancing expression and inhibiting degration of HSA-GCSFm was optimal for Pichia pastoris to express HSA-GCSFm with high performance.

Key wordsPichia pastoris; HSA-GCSFm; methanol feeding strategy; sorbitol； tryptone

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.002

基金項目：國家自然科學基金項目(30970029); 江蘇省優(yōu)勢學科建設工程資助項目。

作者簡介：李清亮(1989～)，男，碩士。E-mail: xiaobanchao@sina.com。