奧旭東 薩如拉 王杰 王會敏 于海泉

（內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心，呼和浩特 010021）

牛早期胚胎發(fā)育中AID基因的表達(dá)及其調(diào)節(jié)區(qū)DNA甲基化的動態(tài)變化

奧旭東 薩如拉 王杰 王會敏 于海泉

（內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心，呼和浩特 010021）

以具有DNA主動去甲基化作用的活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶（Activation-induced cytidine deaminase，AID，亦稱為AICDA）基因為研究對象，檢測其在牛卵母細(xì)胞及體外受精胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)變化及其調(diào)節(jié)方式，揭示細(xì)胞重編程分子機制。應(yīng)用Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）和免疫熒光化學(xué)等方法分析DNA甲基化對牛早期胚胎發(fā)育中AID基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，AID基因在牛早期胚胎發(fā)育中受DNA甲基化的調(diào)控，AID基因的T-DMR（tissue-dependent and differentially methylated region）位于其轉(zhuǎn)錄起始位點-88 bp - -431 bp。在牛卵母細(xì)胞成熟過程中，T-DMR第2和第3號CpG位點的DNA甲基化明顯去除，而其他位點都未發(fā)生變化。卵母細(xì)胞在成熟過程中AID基因的積累與DNA甲基化狀態(tài)變化相關(guān)。在牛體外受精胚發(fā)育早期的各階段，盡管AID基因的表達(dá)不同，但AID基因T-DMR除第2和第3號CpG位點一直都維持去甲基化狀態(tài)外，其他位點始終維持甲基化狀態(tài)。推測其表達(dá)的變化可能是胚胎基因組激活有關(guān)。以上研究表明，AID基因T-DMR的低甲基化與其表達(dá)存在一定的相關(guān)性。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，從卵母細(xì)胞成熟期到桑椹胚期，AID蛋白都是均勻分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。而囊胚時期大量AID蛋白集中于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，這可能對于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多能性的維持起重要作用。綜上所述，牛卵母細(xì)胞成熟中積累的AID作用于受精過程，其啟動子區(qū)的DNA去甲基化與AID基因的表達(dá)有關(guān)，胚胎基因組激活后AID基因的表達(dá)可能與胚胎發(fā)育有關(guān)。

AID基因；牛體外受精胚胎；DNA甲基化

哺乳動物染色體構(gòu)象在受精過程中發(fā)生劇烈變化。高度凝縮的精子染色質(zhì)在卵母細(xì)胞中解凝縮，與卵母細(xì)胞染色質(zhì)融合，形成合子基因組，并激活其轉(zhuǎn)錄，最終獲得發(fā)育的全能性［1，2］。在植入前胚胎的發(fā)育過程中，基因組經(jīng)整體范圍內(nèi)DNA去甲基化，父本基因組迅速主動的去甲基化，母本基因組則被動去甲基化，隨后，在母型合子轉(zhuǎn)變期重新被甲基化［3］。父本基因組的迅速去甲基化過程涉及到DNA的主動去甲基化機制［4］。雖然已報道了很多哺乳動物中的DNA主動去甲基化現(xiàn)象，但是還沒有明確是什么物質(zhì)具有DNA去甲基化的作用［5-7］。并且關(guān)于DNA主動去甲基化的機制也并不清楚［7-18］。

AID是一種胞苷脫氨酶，它能介導(dǎo)5mC脫氨基成為T，從而發(fā)生堿基對的錯配，這樣產(chǎn)生的錯配可以被堿基切除修復(fù)（BER）機制所識別［19］。早期的研究主要集中于其在B淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生抗體多樣性的作用［19-22］。最近，在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)同時過表達(dá)AID和MBD4可以降低其基因組DNA甲基化程度［23］。小鼠中的研究表明AID基因主要表達(dá)于多能性的組織［24］，其蛋白與成纖維細(xì)胞中沉默的甲基化的OCT4和NANOG啟動子結(jié)合，而不與去甲基化的啟動子結(jié)合［25］。并且AID基因缺陷小鼠的原始生殖細(xì)胞（PGC）的基因組整體范圍內(nèi)的DNA甲基化程度比正常小鼠要高2-3倍［26］。這些研究都證明AID蛋白在高等哺乳動物中具有DNA去甲基化的作用，并成為了新的研究熱點。

牛AID基因位于5號染色體，全長4 329 bp（ENSBTAG00000018849），有4個外顯子，mRNA全長597 bp（ENSBTAT00000025096），編碼198個氨基酸的蛋白。目前關(guān)于AID基因的研究都局限于斑馬魚［23］、小鼠［24-26］等模式動物中，而在牛上的研究只是檢測了其在GV期和MII期卵母細(xì)胞的表達(dá)而沒有對其功能作進(jìn)一步的討論［27］。并且在研究的時間段上，目前研究都局限于原始生殖細(xì)胞發(fā)生和受精后較短的時間，還未見哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中AID蛋白作用的研究報道。本研究首先通過分析AID基因在牛組織中的表達(dá)和其啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)確定AID基因的T-DMR，然后利用體外受精技術(shù)分析在不同發(fā)育階段（卵母細(xì)胞和胚胎）AID基因的表達(dá)變化及其調(diào)節(jié)方式，以期揭示胚胎細(xì)胞重編程分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 取成年牛的新鮮心臟、腎臟、肝臟、睪丸組織，切成1 cm3的小塊，在滅菌的生理鹽水中沖洗三遍，投入液氮中，長期保存在-80℃冰箱中。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒、T載體購自Promega；RNAiso Reagent、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNase Inhibitor、Random Primer（9 mer）、無酶水（DEPC H2O）和凝膠回收試劑盒購自大連寶生物有限公司；除特別提到的化學(xué)試劑，其余均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 成年牛組織中AID基因的表達(dá)分析 根據(jù)Enseml網(wǎng)站中公布的牛AID mRNA序列（ENSBTAT-00000025096），設(shè)計Real-time PCR引物。正向引物：5'-CGGCTGGAGGAGCAAAAGACCGAAAG-3'；反向引物：5'-GAGCCACGTCCCTGTCGTCGTCTTC-3'，產(chǎn)物長度192 bp。陽性對照GAPDH使用Leutenegger等［28］設(shè)計的引物。按照寶生物RNAiso Reagent試劑的說明提取牛心臟、腎臟、肝臟和睪丸組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7300 Real-time PCR儀進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s，98℃ 5 s，60℃ 31 s，共檢測40個循環(huán)。Real-time PCR結(jié)果通過2-ΔΔCT方法分析得出。AID基因的表達(dá)量使用GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。

1.2.2 AID基因的DNA序列甲基化分析 使用Promega DNA提取試劑盒提取成年牛心臟、腎臟、肝臟和睪丸組織的基因組DNA。分別取5 μg DNA，經(jīng)Xba I酶切11 h后提純。加入10 mol/L的NaOH至終濃度為0.3 mol/L，37℃變性15 min。加入終濃度為10 mmol/L氫醌和2.5 mol/L的NaHSO3（pH5.0），55℃避光20 h。加入10 mol/L NaOH至終濃度為0.3 mol/L，37℃脫硫15 min。使用3 mol/L醋酸銨沉淀DNA，20 μL TE（pH8.0）回溶。按以下反應(yīng)條件進(jìn)行 3次 PCR：94℃ 4 min；94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃ 10 min，共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化挑選克隆。每組實驗至少挑選10個克隆送大連寶生物公司測序。

表1 牛AID基因甲基化PCR引物序列

1.2.3 卵母細(xì)胞、體外受精胚胎的獲得 牛卵巢取自于當(dāng)?shù)赝涝讏?，?8 # 注射器抽取卵巢表面的3-8 mm的卵泡。挑選顆粒細(xì)胞包裹較完整的卵母細(xì)胞，用 M199+10% FBS（HyClone）+0.02 IU/mL FSH+1 IU/mL LH+0.01 μg/mL E2和 0.06 mg/mL penicillin & 0.05 mg/mL streptomycin在 5% CO2，100% 濕 度，38.5℃培養(yǎng)18-24 h后成熟。37℃水浴中解凍公牛冷凍精液，受精A液（BO液+10 mmol/L Caffeine）離心洗滌（3 000 r/min）兩次。離心后，靜置2 min，待精子上浮后小心吸取，加入等體積的受精B液（BO液+3 mg/mL BSA+8 μL/mL肝素）制成精子懸浮液。將精子懸浮液做成100 μL受精小滴，每滴放入30-40枚成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精。7 h后，將去除卵丘的受精卵轉(zhuǎn)入發(fā)育培養(yǎng)液（CRI）中。分別收集GV期、MII期卵母細(xì)胞、2-、4-、8-細(xì)胞胚胎、桑椹胚和囊胚保存于液氮中。

1.2.4 免疫熒光染色和激光共聚焦檢測 PBS（-）+2% BSA清洗收集到的卵母細(xì)胞、受精卵和體外受精胚胎。4%多聚甲醛室溫固定30 min，1% Triton X-100通透1 h。10%山羊血清+2% BSA的PBS（-）室溫封閉1 h。然后用PBS（-）+2% BSA按1∶100稀釋AID蛋白一抗（Upstate）4℃孵育過夜。PBS（-）+2% BSA清洗3遍后，用1∶500的FITC標(biāo)記二抗（Sigma）避光染色2 h。10 μg/mL DAPI染細(xì)胞核，PBS（-）+2% BSA清洗3遍后，使用Nikon激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測。所有試驗，Nikon激光共聚焦顯微鏡都使用相同的設(shè)置。

1.2.5 統(tǒng)計方法 本研究所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次以上。所有試驗數(shù)據(jù)都使用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。Real-time PCR試驗結(jié)果使用單因素分析，DNA甲基化狀態(tài)使用卡方檢驗。P＜0.05確定為差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AID基因在成年牛組織中的表達(dá)變化

如圖1所示，AID基因在心臟、腎臟、肝臟和睪丸4種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量都較低。其表達(dá)水平在不同組織之間呈現(xiàn)不同的狀態(tài)，其中心臟和肝臟較低，腎臟水平稍高，睪丸組織表達(dá)量最高，并明顯高于其他3種組織（P＜0.05）。

圖1 AID基因在牛不同組織的表達(dá)變化

2.2 AID基因啟動子區(qū)甲基化在成年牛組織的變化

AID基因的轉(zhuǎn)錄起始位點以上3 600 bp的區(qū)域內(nèi)共有24個CpG位點，沒有CpG島。根據(jù)其序列設(shè)計兩段BSP引物，分別位于AID基因的-88 bp--431 bp和-1416 bp--1548 bp，共包含11個CpG位點，其中-1416 bp--1548 bp包含有4個CpG位點，-88 bp--431 bp包含有7個CpG位點。分別提取心臟、肝臟、腎臟和睪丸組織的基因組DNA，并經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，使用引物AID BSP 1和AID BSP 2分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后照相觀察。結(jié)果顯示，引物AID BSP 1的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小一致（圖2）；AID BSP 2的PCR產(chǎn)物大小也與預(yù)期片段大小一致（圖3）。

圖2 牛AID BSP 1甲基化PCR結(jié)果

圖3 牛AID BSP 2甲基化PCR電泳結(jié)果

比較測序結(jié)果與原始序列后，發(fā)現(xiàn)AID基因5'調(diào)控區(qū)的11個CpG位點在4種組織中都具有較高的甲基化程度。心臟、睪丸、肝臟、腎臟的DNA甲基化比率分別為81.82%、78.18%、79.09%和78.18%（圖4-A），且各組織之間沒有明顯的差異（P＞0.05）。單獨分析-88 bp--431 bp這一區(qū)段發(fā)現(xiàn)其甲基化比率分別為心臟90.0%，睪丸77.1%，肝臟91.4%和腎臟87.1%，各組織之間沒有明顯的差異（圖4-C）。在-1416 bp--1548 bp這一區(qū)段心臟為65.0%，睪丸為80.0%，肝臟為57.5%，腎臟為65.0%，各組織之間也無明顯差異（圖4-B）。綜合分析AID基因在不同組織中的表達(dá)量和其在各個區(qū)段上的DNA甲基化程度發(fā)現(xiàn)，-88 bp--431 bp這一區(qū)段的DNA甲基化與牛AID基因的組織特異性表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)?；谄湓贏ID基因的表達(dá)的重要調(diào)節(jié)作用，可以確定這一區(qū)段就是AID基因的T-DMR。

為了更好地分析AID基因T-DMR對AID基因表達(dá)的影響，本研究單獨分析了AID基因T-DMR的每一個CpG位點的DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果（圖5）顯示，睪丸組織AID基因T-DMR中7個CpG位點都發(fā)生了一定的DNA去甲基化，而其他3種組織卻只是在一些個別位點發(fā)生了DNA去甲基化。

2.3 牛早期胚胎發(fā)育過程中AID基因的甲基化狀態(tài)的動態(tài)變化

本研究通過Real-time PCR的方法分別檢測了GV期卵母細(xì)胞、MII期卵母細(xì)胞、2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚中AID基因的表達(dá)。結(jié)果（圖6）顯示，卵母細(xì)胞成熟過程中AID基因在逐漸的積累，到MII期卵母細(xì)胞達(dá)到頂峰。隨著精子入卵，受精卵開始細(xì)胞分裂，AID基因的表達(dá)量急劇下降，直到8-cell時期也即母型合子轉(zhuǎn)變時期AID基因的表達(dá)量開始逐漸升高，直到囊胚期。

為了確定AID在牛早期胚胎發(fā)育過程中的作用，本研究使用AID蛋白的特異性抗體，利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法，檢測了牛卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育過程中AID蛋白的動態(tài)變化。結(jié)果（圖7）顯示，從卵母細(xì)胞成熟到早期胚胎發(fā)育過程中的2-cell和4-cell階段，AID蛋白的含量是逐漸降低的。從8-cell開始即母型合子轉(zhuǎn)變時期，AID蛋白的表達(dá)量開始逐步上升。從卵母細(xì)胞成熟期到桑椹胚期，AID蛋白都是均勻分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；而到了囊胚期大量的AID蛋白集中于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。

隨后本研究檢測了AID基因T-DMR在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果（圖8）表明，GV期卵母細(xì)胞中AID基因T-DMR甲基化比率為82.86%，而在MII期及隨后的早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化都未發(fā)生變化。

圖4 牛心臟、睪丸、肝臟、腎臟中AID基因DNA甲基化水平的變化

3 討論

DNA甲基化是主要的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳修飾方式之一［2］?；騿幼訁^(qū)的DNA被甲基化后可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄。例如，多能性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的識別靶序列CACGTG被甲基化后，F(xiàn)oxA1蛋白就不與其啟動子結(jié)合轉(zhuǎn)而結(jié)合于基因遠(yuǎn)端調(diào)控序列［29］，最終導(dǎo)致c-Myc基因轉(zhuǎn)錄的失活。哺乳動物基因組存在大量的T-DMR，T-DMR包含有單個細(xì)胞或特定組織類型的DNA甲基化信息，決定基因的組織特異性和階段特異性表達(dá)［30，31］。

在成年牛的不同組織中，T-DMR區(qū)的DNA都存在相當(dāng)高的甲基化水平。但是每一種組織中都有其自己的甲基化模式從而調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，總體上遵循一般的規(guī)律，即DNA甲基化程度高的基因表達(dá)量就低，相反甲基化程度低的基因表達(dá)量高［32］。研究結(jié)果表明AID基因在心臟、腎臟、肝臟、睪丸4種組織中均有表達(dá)但是其轉(zhuǎn)錄水平不同。睪丸組織明顯高于其他3種組織。分析4種組織DNA甲基化水平，在-88 bp--431 bp睪丸的DNA甲基化程度較其他3種組織低。因此推斷其為AID基因的T-DMR，而T-DMR的DNA甲基化水平與其表達(dá)有密切的聯(lián)系。同時本研究發(fā)現(xiàn)AID基因在心臟、肝臟和腎臟中雖然都有少數(shù)的個別CpG位點發(fā)生了DNA去甲基化，但其組織中AID基因的表達(dá)沒有明顯升高，可以推斷AID基因的表達(dá)的調(diào)控是由于AID基因T-DMR區(qū)的所有CpG位點的DNA甲基化狀態(tài)共同作用的結(jié)果，而并非由于某個單獨的CpG位點的甲基化所決定。DNA甲基化可能是通過改變了染色質(zhì)的構(gòu)象［33，34］，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)的結(jié)合［35］。AID基因這4種組織中的甲基化模式不具有顯著性差異，但是其表達(dá)水平卻存在差異，這就說明在體內(nèi)還有其它機制共同作用于AID的表達(dá)。其相關(guān)機制和相互關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

圖5 AID基因T-DMR單個CpG位點甲基化情況分析

圖6 AID基因在牛卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段胚胎中的表達(dá)

圖7 AID在不同發(fā)育階段牛卵母細(xì)胞和胚胎中的動態(tài)變化

哺乳動物受精后首先發(fā)生整體的去甲基化過程，發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)也在特定時間被開關(guān)，這種整體的去甲基化狀態(tài)與母型合子轉(zhuǎn)變中胚胎基因組的激活有關(guān)，整體的去甲基化狀態(tài)發(fā)生和持續(xù)的時間因動物種類不同而異。體細(xì)胞核移植胚也出現(xiàn)同樣過程［36］。本研究確定了AID基因的T-DMR（-88 bp--431 bp），這一段DNA的甲基化和其表達(dá)水平成緊密相關(guān)。在卵母細(xì)胞成熟過程中，T-DMR區(qū)的第2和第3號CpG位點的DNA甲基化發(fā)生了一個明顯的去除過程，而其他位點都未發(fā)生變化。卵母細(xì)胞在成熟過程中AID基因的積累就與這樣的DNA甲基化狀態(tài)的變化相關(guān)。而在早期胚胎發(fā)育過程中，AID基因的T-DMR區(qū)除了第2和第3號CpG位點的DNA甲基化一直都維持去甲基化狀態(tài)其他位點都是甲基化的狀態(tài)。相關(guān)研究證實，受精后幾小時內(nèi)，魚精蛋白被組蛋白替換，父源染色質(zhì)去凝縮，DNA發(fā)生去甲基化［37，38］。在短時間內(nèi)，父源染色質(zhì)利用卵母細(xì)胞在成熟過程積累的物質(zhì)發(fā)生DNA去甲基化［27］。AID基因表達(dá)也具有類似的變化規(guī)律，提示AID對于父源染色質(zhì)DNA的主動去甲基化具有一定的作用。在受精后，AID基因的表達(dá)持續(xù)下降直到8-cell時期表達(dá)量才開始上升，這可能是與母型合子轉(zhuǎn)變中胚胎基因組的激活有關(guān)，也說明了AID對于胚胎發(fā)育及其干細(xì)胞多能性的維持具有重要的作用。在牛早期胚胎發(fā)育過程中，雖然AID基因DNA甲基化都未發(fā)生變化，但是其基因表達(dá)卻有明顯的改變，這就提示AID基因在這一過程中的階段特異性表達(dá)可能是受到其他表觀遺傳方面或是轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，從卵母細(xì)胞成熟期到桑椹胚期，AID蛋白都是均勻分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。而囊胚時期大量的AID蛋白集中于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，這可能對于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多能性的維持起重要作用。

圖8 牛卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中AID基因DNA甲基化水平的變化

4 結(jié)論

卵母細(xì)胞成熟中積累的AID作用于受精過程，其啟動子區(qū)的DNA去甲基化與AID基因的表達(dá)有關(guān)。胚胎基因組激活后AID基因的表達(dá)可能與胚胎發(fā)育有關(guān)。

［1］Tamada H, Thuan NV, Reed P, et al. Chromatin decondensation and nuclear reprogramming by nucleoplasmin［J］. Mol Cell Biol, 2006, 26：1259-1271.

［2］Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development［J］. Nature Reviews Genetics, 2002, 3：662-673.

［3］Kass SU, Pruss D, Wolffe AP. How does DNA methylation repress transcription?［J］. Trends in Genetics, 1997, 13：444-449.

［4］Reik W, Dean W, Walter Jr. Epigenetic reprogramming in mammalian development［J］. Science, 2001, 293：1089-1093.

［5］Jones PA, Liang G. Rethinking how DNA methylation patterns are maintained［J］. Nature Reviews Genetics, 2009, 10：805-811.

［6］Zhu JK. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases［J］. Annu Rev Genet, 2009, 43：143-166.

［7］Cortellino S, Xu J, Sannai M, et al. Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by linked deamination-base excision repair［J］. Cell, 2011, 146：67-79.

［8］Ito S, D’Alessio AC, Taranova OV, et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification［J］. Nature, 2010, 466：1129-1133.

［9］Wossidlo M, Arand J, Sebastiano V, et al. Dynamic link of DNA demethylation, DNA strand breaks and repair in mouse zygotes［J］. The EMBO Journal, 2010, 29：1877-1888.

［10］Okada Y, Yamagata K, Hong K, et al. A role for the elongator complex in zygotic paternal genome demethylation［J］. Nature, 2010, 463：554-558.

［11］Chen T, Li E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases［J］. Current Topics in Developmental Biology, 2004, 60：55-89.

［12］Schmitz KM, Schmitt N, Hoffmann-Rohrer U, et al. TAF12 recruits Gadd45a and the nucleotide excision repair complex to the promoter of rRNA genes leading to active DNA demethylation［J］. Molecular Cell, 2009, 33：344-353.

［13］Wu SC, Zhang Y. Active DNA demethylation：many roads lead to Rome［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2010, 11：607-620.

［14］Cannon SV, Cummings A, Teebor GW. 5-Hydroxymethylcytosine DNA glycosylase activity in mammalian tissue［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1988, 151：1173-1179.

［15］Kantarjian H, Oki Y, Garcia-Manero G, et al. Results of a randomized study of 3 schedules of low-dose decitabine in higherrisk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia［J］. Blood, 2007, 109：52-57.

［16］Yang AS, Doshi KD, Choi SW, et al. DNA methylation changes after 5-aza-2’-deoxycytidine therapy in patients with leukemia［J］. Cancer Res, 2006, 66：5495-5503.

［17］Mund C, Hackanson B, Stresemann C, et al. Characterization of DNA demethylation effects induced by 5-Aza-2’-deoxycytidine in patients with myelodysplastic syndrome［J］. Cancer Res, 2005, 65：7086-7090.

［18］Issa JPJ, Kantarjian HM, Kirkpatrick P. Azacitidine［J］. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4：275-276.

［19］Conticello SG, Langlois MA, Yang Z, et al. DNA deamination in immunity：AID in the context of its APOBEC relatives［J］. Advances in Immunology, 2007, 94：37-73.

［20］Maul RW, et al. Chapter six-AID and somatic hypermutation［J］. Advances in Immunology, 2010, 105：159-191.

［21］Muramatsu M, Kinoshita K, Fagarasan S, et al. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase（AID）, a potential RNA editing enzyme［J］. Cell, 20 00, 102：553-563.

［22］Liu M, Schatz DG. Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation［J］. Trends in Immunology, 2009, 30： 173-181.

［23］Rai K, Huggins IJ, James SR, et al. DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a gly cosylase, and Gadd45［J］. Cell, 2008, 135：1201-1212.

［24］Morgan H, Dean W, Coker H, et al. Activation-induced cyti dine deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed in pluripotent tissues［J］. Biological Chemistry, 2004, 279：52353-5260.

［25］Bhutani N, Brady JJ, Damian M, et al. Reprogramming towards pluripotency requires AID-d ependent DNA demethylation［J］. Nature, 2010, 463：1042-1047.

［26］Popp C, Dean W, Feng S, et al. Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency［J］. Nature, 2010, 463：1101-1105.

［27］Pagé-Larivière F, Sirard MA. Spatiotemporal expression of DNA demethylation enzymes and histone demethylases in bovine emb ryos［J］. Cellular Reprogramming, 2014, 16：40-53.

［28］Leutenegger CM, Alluwaimi AM, Smith WL, et al. Quantitation of bovine cytokine mRNA in milk cells of healthy cattle by realtime TaqMan polymerase chain reaction［J］. Vet Immunol Immunopathol, 2000, 77：275-287.

［29］Lupien M, Eeckhoute J, Meyer CA, et al. FoxA1 translates epigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific transcription［J］. Cell, 2008, 132：958-970.

［30］Shiota K, Kogo Y, Ohg ane J, et al. Epigenetic marks by DNA methylation specific to stem, germ and somatic cells in mice［J］. Genes to Cells, 2002, 7：961-969.

［31］Wan J, Oliver VF, Zhu H, et al. Integrative analysis of tissuespecific methylation and alternative splicing identifies conserved transcription factor binding motifs［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41：8503-8514.

［32］S iegfried Z, Cedar H. DNA methylation：A molecular lock［J］. Current Biology, 1997, 7：305-307.

［33］Weinberg MS, Villeneuve LM, Ehsani A, et al. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells［J］. RNA, 2006, 12：256-262.

［34］Santoro R, Grummt I. Epigenetic mechanism of rRNA gene silencing：temporal order of NoRC-mediated histone modification, chromatin remodeling, and DNA methylation［J］. Mol Cell Biol, 2005, 25：2539-2546.

［35］Lehnertz B, Ueda Y, Alwin AHA. Derijck, et al. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin［J］. Curr Biol, 2003, 13：1192-1200.

［36］Papp B, Plath K. Epigenetics of reprogramming to induced pluripotency［J］. Cell, 2013, 152：1324-1343.

［37］McLay DW, et al. Remodelling the paternal chromatin at fertilization in mammals［J］. Reproduction, 2003, 125：625-633.

［38］Rivera RM, Ross JW. Epigenetics in fertilization and preimplantation embryo development［J］. Prog Biophys Mol Biol, 2013, 113：423-432.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression of AID and Dynamic Changes of Its DNA Methylation in Regulation Region During Bovine Early Embryonic Development

AO Xu-dong SA Ru-la WANG Jie WANG Hui-min YU Hai-quan
（Research Center for Laboratory Animal Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

DNA methylation plays an important role in mammalian fertilization. The chromosome has undergone complex reconstruction and ultimately obtained totipotent during fertilization. Using activation-induced cytidine deaminase protein（AID，also known as AICDA with DNA active demethylation function，as research target，the expression changes of AID and its regulation mechanisms at different development stages of oocyte and in-vitro fertilization（IVF）embryo were detected for exploring the cell reprogramming mechanism. Real-time PCR，BSP（Bisulfite Sequencing PCR），and immunofluorescence chemistry were used to analyze the effects of DNA methylation on the AID expression during bovine early embryonic development. The results showed that AID gene was regulated by DNA methylation in the bovine early embryonic development. Combining the expression of AID gene in the different tissues and DNA methylation status of its promoter region，the tissuedependent and differentially methylated region（T-DMR）of AID gene was located at the transcriptional start site -88 bp--431 bp. During the maturing process of bovine oocyte，No. 2 and 3 CpG sites in the T-DMR region were obviously demethylated，whereas the other sites were not changed，and AID gene was correlated with the DNA methylation. At the different stages of early IVF embryo，though the expression of AID gene varied，only No. 2 and 3 CpG sites in the T-DMR region of AID were in the status of demethylation，while other sites were inmethylation continuously，the changes of the expression probably was related to the embryonic genome activation. The above results revealed that low methylation of T-DMR in AID gene was correlated with its expression. Immunofluorescence detection discovered that AID proteins were uniformly distributed in the nucleus and cytoplasm from the oocyte maturation stage to morula stage. And a large number of AID protein concentrated in the inner cell mass at the blastocyst stage，which played the important role in the maintenance of pluripotency of the inner cell mass. In summary，accumulated AID during oocyte maturation presents an effect on fertilization，the DNA methylation in the promoter region is closely related to its expression，and the expression of AID gene，after activation of the embryonic genome，may be associated with embryo development.

AID gene；bovine in vitro fertilization；DNA methylation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.034

2015-10-13

國家自然科學(xué)基金項目（31460311），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金課題項目（2012ZD04）

奧旭東，男，博士，研究方向：哺乳動物生殖生物學(xué)；E-mail：aoxudong_123@126.com

于海泉，男，博士，研究員，研究方向：哺乳動物生殖生物學(xué)；E-mail：haiquan_yu@yahoo.com