楊川 秦藝丹 胡潛 李強

（大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連 116023）

抗遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）單克隆抗體的制備及雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

楊川 秦藝丹 胡潛 李強

（大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連 116023）

以遲緩愛德華菌株2CDM001為抗原，利用雜交瘤技術(shù)制備了遲緩愛德華菌的單抗8D11、8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5、18H9。在特異性方面，單抗8H4和2F4特異性較差，與美人魚弧菌ATCC33539、鮰愛德華菌ATCC33202等參考菌株均出現(xiàn)不同程度的交叉反應，而其余9株單抗特異性強，與實驗中用到的除遲緩愛德華菌外的參考菌株均不結(jié)合；但與遲緩愛德華菌分離株的檢測結(jié)果表明，僅有20D3和8H4可與所有分離株結(jié)合，其余單抗不能與實驗中所有遲緩愛德華菌發(fā)生反應。由于單抗8H4與美人魚弧菌ATCC33539有交叉反應，因此選單抗20D3和兔源多抗建立遲緩愛德華菌的雙抗夾心ELISA檢測方法，該方法特異性強，靈敏度達到5×107CFU/mL。本研究擴充了遲緩愛德華菌單克隆抗體庫，為遲緩愛德華菌單克隆抗體的進一步應用提供更多參考數(shù)據(jù)和可選擇的材料。

遲緩愛德華菌；單克隆抗體；雙抗夾心ELISA

遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）是革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、愛德華菌屬（Edwardsiella），是愛德華菌病的病原菌，最初是1962年從日本鰻魚中分離［1］。該菌普遍存在于海水和淡水環(huán)境中，可以感染日本鰻鱺、真鯛、黃鰤、斑點叉尾鮰及大菱鲆等多種重要經(jīng)濟魚類，也給牙鲆養(yǎng)殖造成嚴重的經(jīng)濟損失［2］。遲緩愛德華菌的宿主范圍很廣，除了魚類是其最常見的宿主，同時還可以感染爬行類、兩棲類、水生鳥類、海洋哺乳類以及其它陸生哺乳類，也可以導致人類胃腸疾病、皮膚軟組織和膽管感染、菌血癥、腹膜炎、腦膜炎等，而且是一種人畜共患菌［3］。

目前針對遲緩愛德華菌的檢測方法主要是通過傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)，進行細菌形態(tài)學和各項生理生化指標的鑒定。此外還有分子生物學鑒定方法［4］以及免疫學鑒定方法，包括間接ELISA法［5］、Dot-ELISA法［6］、競爭ELISA法［7］等。但是這些檢測方法由于需要專業(yè)檢測技能、昂貴的設備以及較長的檢測時間等原因而在實際應用中受到很大的限制。以免疫層析原理建立起來的快速檢測試紙條，具有檢測快速、操作簡單的特點。免疫層析試紙條的技術(shù)核心是雙抗夾心ELISA，雙抗夾心ELISA是在間接ELISA方法基礎(chǔ) 上發(fā)展起來的一種常用免疫檢測技術(shù)，該方法靈敏度高、特異性強，已被廣泛應用于人類醫(yī)學［8，9］、畜牧業(yè)［10］、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)［11，12］、食品安全［13］等領(lǐng)域。本實驗通過研制抗遲緩愛德華菌單克隆抗體，并進行雙抗體夾心ELISA檢測參數(shù)的優(yōu)化，旨在為遲緩愛德華菌膠體金快速檢測試紙條的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基 RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（HYCLONE公司）；HAT（GIBCO公司）；聚乙二醇（PEG2000，MERCK公司）；弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑（Thermo公司）；堿性磷酸酶（AP）標記的羊抗小鼠IgG（SIGMA公司）；6-8周齡SPF級雌性Balb/C小白鼠（大連醫(yī)科大學SPF實驗動物中心）；抗遲緩愛德華菌2CDM001兔源多克隆抗體由本實驗室制備，純化后的兔多抗效價為1∶320000。

1.1.2 菌株與細胞株 本實驗中用到的參考菌株共12株，分別為殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida（MT004）、美人魚弧菌 Vibrio damsela（ATCC33539）、副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus（KCTC2471）、創(chuàng)傷弧菌 Vibrio vulnificus（ATCC2126）、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus（KCCM40513）、 鰻 弧 菌Vibrio anguillarum（KCTC2711）、鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluri（ATCC33202）、海豚鏈球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、 燦 爛 弧 菌 Vibrio splendidus（ATCC33125）、 希 瓦 氏 菌 Shewanella oneidensis（KCCM41821）、哈維弧菌Vibrio harveyi（ACTT14126）和遲緩愛德華菌Edwardsiella tarda（ATCC15947），遲緩愛德華菌分離株共6株（2CDI901、2CDA101、2CDX001、2CDM001、2CDM002、2CDM003），其中2CDM001為本實驗中使用的免疫菌株，該菌株由遼寧地區(qū)患病大菱鲆分離得到。SP2/0小鼠骨髓瘤細胞為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的制備 參考文獻［14］，用滅活的遲緩愛德華菌2CDM001作為抗原，分4次免疫6周齡的Balb/C小鼠。采用細胞融合技術(shù)將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，再通過間接ELISA、IFA等方法進行篩選，有限稀釋法進行3次克隆。

1.2.2 單克隆抗體特性分析

1.2.2.1 特異性分析 為了增強實驗的準確性，本實驗分別用了間接ELISA和IFA兩種方法對單抗20D3進行特異性分析［15］。利用間接ELISA方法，選擇1.1.2中所述12株參考菌株以及包括2CDM001菌株在內(nèi)的6株遲緩愛德華菌分離菌株進行單抗特異性檢測。菌株于28℃下培養(yǎng)24 h，用無菌PBS調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108CFU/mL，分別包被96孔聚苯乙烯酶標板。一抗為單克隆抗體，取SP2/0培養(yǎng)上清作為陰性對照。

利用間接IFA方法［16］，用PBS調(diào)整各菌株的濃度至5×108CFU/mL制作滴片，以單抗細胞20D3上清為一抗，SP2/0細胞上清為陰性對照，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為顯色二抗。

1.2.2.2 效價的測定 利用間接ELISA技術(shù)，通過棋盤滴定法檢測單克隆抗體的效價，單克隆抗體以2倍比（21-210）進行系列稀釋；包被抗原遲緩愛德華菌2CDM001以10倍比進行稀釋（5×108-5×105CFU/mL），能保持陽性的最大稀釋倍數(shù)即為該單抗的效價。

1.2.3 雙抗夾心ELISA方法的建立

1.2.3.1 雙抗體夾心ELISA操作流程 以抗遲緩愛德華菌2CDM001的多克隆抗體作為包被抗體，單克隆抗體20D3為檢測單抗，AP標記的羊抗鼠IgG為顯色抗體，建立檢測遲緩愛德華菌2CDM001的雙抗夾心ELISA方法［17］。

1.2.3.2 抗體最佳工作濃度的確定 用碳酸鹽緩沖液（15 mmol/L Na2CO3，35 mmol NaHCO3，pH9.6）將多克隆抗體從1∶50至1∶6 400進行2倍比系列稀釋，包被96孔酶標板，使用PBS將單克隆抗體從原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32進行2倍比系列稀釋，遲緩愛德華菌2CDM001濃度為5×108CFU/mL，參照上述1.2.3.1，采用棋盤滴定法確定多克隆抗體及單克隆抗體最佳工作濃度。

1.2.3.3 特異性試驗 利用12株參考菌株及6株遲緩愛德華菌分離株進行特異性檢測，濃度均為5×108CFU/mL。多克隆抗體及單克隆抗體均采用最佳工作濃度，參照上述1.2.3.1的雙抗夾心ELISA操作流程進行特異性分析試驗。

1.2.3.4 敏感性試驗 將遲緩愛德華菌2CDM001用PBS進行10倍系列稀釋，多克隆抗體及單克隆抗體采用最佳工作濃度，參照上述1.2.3.1。

表1 交叉反應結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株

經(jīng)過篩選和3次克隆后，共獲得11株穩(wěn)定分泌抗遲緩愛德華菌2CDM001的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為8D11、8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5和18H9。

2.2 單克隆抗體效價及特異性

經(jīng)間接ELISA法檢測，11株單克隆抗體8D11、8H4、2F4、18C12、16E2、20D3、19G2、5F7、4E6、7C5、18H9效價分別為1∶512、1∶256、1∶256、1∶256、1∶512、1∶64、1∶1024、1∶32、1∶256、1∶256、1∶512。

在特異性方面，單抗8H4和2F4特異性較差，與多種參考菌株均出現(xiàn)不同程度的交叉反應，而其余9株單抗特異性強，與參考菌株均不結(jié)合；但與遲緩愛德華菌分離株的檢測結(jié)果（表1）表明，僅有20D3和8H4可與所有分離株結(jié)合，但單抗8H4與美人魚弧菌交叉反應，因此選擇單抗20D3建立雙抗體夾心ELISA。其余單抗均不能與實驗中所有遲緩愛德華菌發(fā)生反應。

經(jīng)熒光顯微鏡觀察，遲緩愛德華菌參考菌株ATCC15947（圖1-A）和免疫菌株2CDM001（圖1-B）均出現(xiàn)強烈的熒光信號，陰性對照（圖1-C）和其它參考菌株均未出現(xiàn)熒光信號。同時對比遲緩愛德華2CDM001在相同放大倍數(shù)、自然透射光條件下的形態(tài)（圖1-D），與圖1-A和圖1-B中的熒光發(fā)光體形態(tài)一致。IFA實驗結(jié)果佐證了間接ELISA特異性分析結(jié)果的準確性。

圖1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

2.3 雙抗體夾心ELISA法抗體最佳工作濃度確定

多抗最適包被濃度和單抗最適工作濃度如表2所示。通過盡可能提高多抗包被量以增加對抗原的捕捉能力，參照ELISA方法中抗原包被濃度的篩選辦法［11］，當產(chǎn)生的OD405值接近1.0時的抗原濃度作為最佳包被濃度，經(jīng)試驗測定多抗的最佳包被濃度為1∶1600倍稀釋，單克隆抗體最佳稀釋度為原液。

表2 多抗最適包被濃度及單克隆抗體最佳工作濃度

2.4 雙抗體夾心ELISA方法的特異性檢測

應用遲緩愛德華菌2CDM001雙抗夾心ELISA檢測技術(shù)對多種菌株的檢測發(fā)現(xiàn)（表3），該方法可以特異性檢測實驗中用到的所有遲緩愛德華菌菌株（1株參考菌株，6株分離菌株），與殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida（MT004）、美人魚弧菌Vibrio damsela（ATCC33539）、副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus（KCTC2471）、 創(chuàng) 傷 弧 菌 Vibrio vulnificus（ATCC2126）、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus（KCCM-40513）、鰻弧菌Vibrio anguillarum（KCTC2711）、鮰愛德華菌Edwardsiella ictaluri（ATCC33202）、海豚鏈球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、燦爛弧菌Vibrio splendidus（ATCC33125）、希瓦氏菌Shewanella oneidensis（KCCM41821）、哈維弧菌Vibrio harveyi（ACTT14126）11株參考菌株均無交叉反應。

表3 雙抗體夾心ELISA法的特異性檢測

2.5 雙抗體夾心ELISA方法的靈敏度檢測

雙抗體夾心ELISA檢測遲緩愛德華菌2CDM001敏感性試驗結(jié)果見表4。以PBS作為菌懸液介質(zhì)，可檢測的最低菌液濃度為5×107CFU/mL。

表4 雙抗體夾心ELISA檢測敏感性結(jié)果

3 討 論

為了能夠快速檢測遲緩愛德華菌，有效的預防和控制愛德華菌病，對該病早期快速診斷是非常重要的。江云等［18］篩選出了檢測致病性遲緩愛德華菌的毒力基因，建立了致病性遲緩愛德華菌PCR檢測體系。蘭建新［5］、白方方等［19］用遲緩愛德華菌多克隆抗體建立了遲緩愛德華菌的間接ELISA檢測方法。朱壯春等［20］建立了Dot-IGS快速檢測遲緩愛德華菌的方法。但這些方法都需要一定的檢測技術(shù)、設備以及較長的檢測時間。

對于快速便捷地檢測遲緩愛德華菌，較為理想的方法是利用雙抗夾心法研制出一種免疫學診斷試紙條。單克隆抗體的制備是研發(fā)試紙條過程中必不可少的前期工作［21］，遲緩愛德華菌單克隆抗體的制備在國內(nèi)已有報道，但與本實驗的方法略有不同。吳斌［22］和金曉航［23］在免疫Balb /c小鼠時，直接注射滅活的菌懸液，未用任何佐劑；本實驗在免疫小鼠時，初次免疫用到了弗氏完全佐劑，后3次加強免疫用了弗氏不完全佐劑。到本試驗通過大量篩選，獲得了一株具有很強特異性的雜交瘤細胞株20D3。該單抗與試驗中的所有遲緩愛德華菌株均產(chǎn)生陽性反應，與實驗中其他菌株均不結(jié)合，具有良好的特異性。本實驗中單抗特異性的檢測使用的均為純化的菌株，對于混合菌株的檢測效果后續(xù)實驗會進行評估。

雙抗體夾心ELISA法是研制遲緩愛德華菌膠體金試紙條的技術(shù)核心，該方法的特異性和靈敏度關(guān)系到試紙條研發(fā)的成敗。在特異性的檢測中，本實驗建立的雙抗夾心ELISA方法對實驗中所有遲緩愛德華菌株都產(chǎn)生陽性反應，而對試驗所用的其它參考菌株均無交叉反應。在靈敏度的檢測中，該雙抗夾心法檢測下限只有5×107CFU/mL。而吳秋仙等［17］以黃海希瓦氏菌AP629為抗原、兔源多抗以及鼠源單抗建立了黃海希瓦氏菌AP629雙抗夾心ELISA檢測方法，對于以PBS和海參體壁勻漿上清液為介質(zhì)的菌懸液，該方法檢出限分別為104CFU/mL和106CFU/mL。馬衛(wèi)靜等［24］以阪崎桿菌LPS為抗原、單克隆抗體2A7為捕獲抗體、1A11-HRP為檢測抗體建立阪崎桿菌雙抗體夾心ELISA檢測方法，對純培養(yǎng)液的檢測限在103-105CFU/mL。劉紅亮等［25］以E.coli O157∶H7為免疫原，采用改良過碘酸鈉法制備的辣根過氧化物酶（HRP）酶標抗體，建立檢測E.coli O157∶H7的雙抗夾心ELSA方法，該方法對純培養(yǎng)菌液的檢出下限為3×104CFU/mL。相比之下，本研究建立的雙抗夾心ELISA方法靈敏度偏低，這可能與雜交瘤細胞分泌抗體的能力以及上清液中抗體的濃度有關(guān)，下一步我們將通過小鼠腹腔注射雜交瘤的辦法，避免外界環(huán)境對雜交瘤的干擾，進一步提高雜交瘤分泌抗體的能力。

4 結(jié)論

本研究以滅活菌株2CDM001為抗原，利用雜交瘤技術(shù)及間接ELISA、IFA等篩選方法，獲得一株能與實驗中所有遲緩愛德華菌發(fā)生反應，而不與實驗中其它參考菌株發(fā)生反應的單抗20D3。以單抗20D3和兔源多抗建立遲緩愛德華菌2CDM001的雙抗夾心ELISA檢測方法，該方法可以檢測實驗中所有的遲緩愛德華菌，與實驗中其它參考菌株不發(fā)生交叉反應，對以PBS為介質(zhì)的2CDM001菌懸液的檢測靈敏度達到5×107CFU/mL。

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（責任編輯 李楠）

Production of Monoclonal Antibodies Against Edwardsiella tarda，and Establishment of Double-antibody Sandwich ELISA Method

YANG Chuan QIN Yi-dan HU Qian LI Qiang
（Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea（Ministry of Agriculture），Dalian Ocean University，Dalian 116023）

Using Edwardsiella tarda 2CDM001 as antigen and hybridoma technique，we prepared the monoclonal antibodies（mAbs）8D11，8H4，2F4，18C12，16E2，20D3，19G2，5F7，4E6，7C5 and 18H9 against E. tarda. Among these mAbs，8H4 and 2F4 had the poor specificity，presented varied cross reactions with control strains such as Vibrio damsela（ATCC33539）and Vibrio damsela（ATCC33539）. The other 9 mAbs had favorable specificity and no cross reactions with control strains except E. tarda used in the experiment. The result of detecting E. tarda isolates showed that only 20D3 and 8H4 reacted with all the E. tarda isolates，and the rest of mAbs did not reacted with all the E. tarda isolates. Due to the cross reaction of 8H4 with V. damsela（ATCC33539），thus 20D3 was selected to establish a double-antibody sandwich ELISA for E. tarda with rabbit polyclonal antibody. The double-antibody sandwich ELISA possessed the strong specificity，and of which the limited detecting concentration reached 5 × 107CFU /mL. In conclusion，this study expanded the mAbs library for E. tarda，and also provided more reference data and alternative materials for further application of E. tarda mAbs.

Edwardsiella tarda；monoclonal antibodies；double-antibody sandwich ELISA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.029

2016-01-04

海洋公益性行業(yè)科研專項（201405003）

楊川，男，碩士研究生，研究方向：水生動物醫(yī)學；E-mail：804290352@qq.com

李強，男，博士，教授，研究方向：水生動物醫(yī)學；E-mail：liqiang@dlou.edu.cn