鐘姝霞 鄧杰 衛(wèi)春會 羅惠波 萬世旅 黃治國

（四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，自貢 643000）

不同窖齡窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與理化指標(biāo)的相關(guān)分析

鐘姝霞 鄧杰 衛(wèi)春會 羅惠波 萬世旅 黃治國

（四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，自貢 643000）

旨在研究不同窖齡窖泥中主要微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和窖泥理化指標(biāo)（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）的變化規(guī)律，并進(jìn)行了相關(guān)性分析。采用凱氏定氮等方法對理化指標(biāo)進(jìn)行測定，通過DGGE技術(shù)研究微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合SPSS軟件對其相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，隨著窖齡的增加，窖泥的pH基本沒有變化，總酸呈緩慢下降的趨勢，總氮先上升后下降，腐殖酸和有效磷都緩慢增加；細(xì)菌和古菌的多樣性指數(shù)分別在1.62-2.58和1.79-2.33之間，并都隨著窖齡的增加而逐漸增加；細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與腐殖酸、總酸、有效磷的相關(guān)系數(shù)分別為0.972（P＜0.01）、-0.987（P＜0.01）、0.878（P＜0.05），古菌的菌落結(jié)構(gòu)與腐殖酸、總酸、有效磷的相關(guān)系數(shù)分別為0.986（P＜0.01）、-0.954（P＜0.05）、0.901（P＜0.05），其他指標(biāo)的相關(guān)性不顯著；選取細(xì)菌中11個優(yōu)勢條帶割膠測序發(fā)現(xiàn)大多數(shù)都為桿菌，選取了古菌4個優(yōu)勢條帶割膠測序發(fā)現(xiàn)均為產(chǎn)甲烷菌。窖泥的理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)隨窖齡的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，而部分理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)有極強(qiáng)的相關(guān)性，這些指標(biāo)對窖泥微生物馴化有極大的關(guān)系。

窖泥；PCR-DGGE；群落結(jié)構(gòu)；相關(guān)性分析

濃香型白酒的生產(chǎn)是以窖池作為容器，以黃水為介導(dǎo)，酒醅、大曲、窖泥中的復(fù)雜微生物區(qū)系統(tǒng)進(jìn)行著更迭和復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝［1］。窖池中的微生物群落和物理因子相互作用、彼此影響共同構(gòu)成了窖池特殊的微生物群落結(jié)構(gòu)［2］。在發(fā)酵過程中，隨著窖泥窖齡的增長，窖內(nèi)理化指標(biāo)呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化，同時窖泥微生物經(jīng)過長期的馴化，其中優(yōu)勢菌群呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)，形成獨有的微生物群落，進(jìn)而使窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的改變，并且在此過程中形成的豐富的代謝產(chǎn)物構(gòu)成了濃香型白酒酒體，使其具有獨特的風(fēng)味特征［3］。

目前除了傳統(tǒng)方法如分離、純化、鏡檢、理化特性研究外，諸多基因工程、生物化學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)等方法被引入微生物群落研究中來。近年來PCR-DGGE［4，5］技術(shù)的運用愈加成熟［6-10］，如俠小虎等［11］對利用PCR-DGGE技術(shù)研究窖泥微生物的電泳條件進(jìn)行優(yōu)化和探討，陶勇等［12］采用PCRDGGE技術(shù)研究了窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替及其與環(huán)境因子的相關(guān)性。在白酒窖內(nèi)微生物研究中，該技術(shù)準(zhǔn)確、直觀、檢測速度快，較好地反映樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)，但總體來說，利用PCR-DGGE系統(tǒng)研究窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)與其理化指標(biāo)的相關(guān)性研究相對較少。本研究以不同窖齡的窖泥為樣本，借助連續(xù)流動化學(xué)分析儀和PCR-DGGE基因指紋分析技術(shù)，利用SPSS軟件將不同窖齡窖泥的微生物多樣性與其理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，得到其規(guī)律，并利用這些規(guī)律對菌落中優(yōu)勢菌進(jìn)行選擇，擇優(yōu)選取條帶進(jìn)行測序研究，以了解不同窖齡窖泥微生物群落的變化趨勢和特殊菌群的存在狀態(tài)，以期給白酒生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，利于中國濃香型白酒的長遠(yuǎn)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 窖泥樣品分別采自瀘州、宜賓和邛崍地區(qū)，包括5年、30年、50年、100年和200年。于窖壁下層（距窖底50 cm）和窖底（窖池底部）分別取樣混合，迅速置于冰盒運回，-20℃保藏。

1.1.2 主要試劑 酒石酸鈉、阿拉伯膠、氯仿、碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、溴甲基酚綠、氯化銨、氯化鉀、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉，以上均為分析純；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000TMDNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；瓊脂糖、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺（Solarbio）；引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。

1.1.3 主要儀器 連續(xù)流動化學(xué)分析儀（Micro-CFA，美 國Astoria Pacific International）；PCR儀（ 美 國Bio-Rad公司My cycle）；DGGE電泳儀（美國 Bio-Rad公司Dcode）；高速冷凍離心機(jī)（德國 Hettich 公司 UNIVERSAL 32R）；凝膠成像系統(tǒng)（美國 SIM公司 Bio-Best200E）；半自動凱氏定氮儀（丹麥福斯集團(tuán)公司 FOSS2200）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京北方利輝試驗儀器設(shè)備有限公司 DHG-9070A）；紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司 UV-2400）；通用型恒壓恒流電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；gel caster及PowerPac Basic Power Supply（美國 Bio-Rad公司）；可調(diào)式混勻儀（美國賽洛捷克MX-S）。

1.2 方法

1.2.1 理化指標(biāo)的測定方法 有效磷采用連續(xù)流動分析儀測定；總氮采用凱氏定氮法檢測；腐殖酸在波長420 nm下采用直接提取比色法測定；用pH計測定pH值；以酚酞為指示劑，采用滴定的方法測定總酸。

1.2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測方法

1.2.2.1 樣品總DNA提取和檢測 采用SDS-酚抽提法［13］和DNA純化試劑盒相結(jié)合的方法提取、純化窖泥中微生物總宏基因組，再利用核酸儀檢測純化后的窖泥DNA溶液的濃度和純度。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 細(xì)菌擴(kuò)增選用通用引物968GCF-1401R，擴(kuò)增出470 bp左右的片段，采用50 μL體系，其PCR反應(yīng)程序為：Touch Down PCR：94℃ 4 min；94℃ 10 s，64℃ 20 s，72℃ 40 s，每兩個循環(huán)溫度降1℃20個循環(huán)；54℃ 15個循環(huán)；72℃ 10 min。

古菌擴(kuò)增先使用上游引物ARCH46F與下游引物ARCH1017R進(jìn)行擴(kuò)增，再以其PCR產(chǎn)物為模板，使用上游引物PARCH344F與下游引物UNIV522R進(jìn)行嵌套式PCR擴(kuò)增，兩輪均采用50 μL體系。第一輪程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃-53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，20個循環(huán)；94℃ 1 min，52℃ 1.5 min，72℃ 1 min，5個循環(huán)；72℃ 10 min。第二輪程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃-53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，20個循環(huán)；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，5個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 6×loading buffer混勻，取3 μL DL2000TMDNA Marker做對照。1%瓊脂糖凝膠140 V電泳25 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。

1.2.2.4 DGGE技術(shù) 對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍為50%-70%。在120 V、60℃條件下電泳12.5 h，用銀染液染色30 min，拍照保存DGGE圖譜。

1.2.2.5 測序 選取目標(biāo)條帶，利用丙烯酰胺凝膠回收劑盒回收目的條帶DNA，對回收的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物選用無GC夾子引物，擴(kuò)增條件同1.2.2.2。選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit對擴(kuò)增DNA進(jìn)行純化，隨后將DNA片段連接到T載體上，利用大腸桿菌 E. coli DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化。各樣品挑選克隆得到的白色菌落3個送至上海英濰捷基測序，引物為344f-522r。測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行比對，確定對應(yīng)條帶種屬信息。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 通過Quantity One分析軟件對DGGE圖譜進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析得到Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，可反映出群落種類和均勻度。通過SPSS分析窖泥中理化因子（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）和微生物多樣性之間的相關(guān)性，分析物理因子對微生物群落的影響。

2 結(jié)果

2.1 理化指標(biāo)檢測結(jié)果

本實驗研究了不同窖齡的窖泥中pH、總氮、腐殖酸、總酸和有效磷的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著窖齡的增加，總氮呈先上升后下降的趨勢（圖1），這是由于在封閉的環(huán)境中窖泥中的無機(jī)類氮在不斷的利用過程中并不能得到對等的補充；窖泥中腐殖質(zhì)含量是作為窖泥老熟程度的重要指標(biāo)之一，而腐植酸是腐殖質(zhì)中最為重要的組成成分，隨著窖齡的增加，腐殖酸含量有著緩慢增加的趨勢（圖1），窖泥年份不同，腐植酸結(jié)構(gòu)與含量也會出現(xiàn)不同的分布；有效磷的含量隨窖齡增加，并無明顯規(guī)律，除50年窖齡較低，百年窖齡的含量明顯高于其他3個窖齡，其中含量最高的為100年窖齡的老窖（圖2）；pH在5-7之間呈中性偏酸，隨著窖齡的增加，pH基本沒有變化，保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)（圖3），弱酸性的pH值是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，有利于己酸和乙酸乙酯的生成；而總酸與pH值呈反相關(guān)關(guān)系，總酸隨窖齡的增加，呈緩慢下降的趨勢（圖4），窖泥中若乳酸含量過高會導(dǎo)致己酸乙酯含量下降，加快窖泥老化速度。

圖1 總酸、總氮和腐殖酸含量的變化曲線

圖2 有效磷含量的變化曲線

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果

核酸蛋白儀測定 DNA濃度的結(jié)果表示所提取DNA 的A260/A280值均在為 1.8-2.0 之間。用相應(yīng)的引物對窖泥中細(xì)菌16S rDNA和古菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得470 bp和180 bp左右的片段（圖5），符合引物設(shè)計的片段。

圖3 pH的變化曲線

圖4 總酸的變化曲線

圖5 窖泥細(xì)菌（A）和古菌16S rDNA（B）PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖6 窖泥細(xì)菌（A）和古菌（B）DGGE電泳條帶位置比較圖

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分析，結(jié)果（圖6）表明，細(xì)菌的豐度值在9-22之間，隨著窖齡的增加其豐度值也有所增加；第5、8、10號條帶在所有樣品中均有檢出，且優(yōu)勢度較高，均在2%以上，表明這些條帶所代表的細(xì)菌類群在窖池微生物中占有絕對優(yōu)勢；進(jìn)一步分析可知細(xì)菌多樣性指數(shù)在1.62-2.58之間，并隨著窖齡的增加而逐漸增大，窖池內(nèi)細(xì)菌類微生物體系逐漸達(dá)到穩(wěn)定。古菌的豐度值在13-17之間，隨窖齡的增加呈逐漸增大的趨勢；其多樣性指數(shù)在1.79-2.33之間，隨窖齡的增加而緩慢增大，變化趨勢較小，表明窖池內(nèi)古菌類微生物體系已趨于穩(wěn)定（圖7）。同時，這一系列數(shù)據(jù)也表明隨著窖池窖泥在不斷延續(xù)的發(fā)酵過程中慢慢馴化，其微生物群落結(jié)構(gòu)也逐漸豐富而達(dá)到動態(tài)的平衡。

圖7 窖泥細(xì)菌和古菌多樣性指數(shù)的變化規(guī)律

2.3 測序結(jié)果

從細(xì)菌DGGE電泳圖譜選取了11個優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對，其相似率大于97%，比對結(jié)果顯示11個條帶所代表的細(xì)菌大多數(shù)分為兩類，一類為Clostridiales，另一類為Bacillales，它們同屬為厚壁菌門（Firmicutes），其中包括了常見的芽孢桿菌、梭菌等。7號條帶為Uncultured bacterium，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），結(jié)果表明，13號與10號條帶序列和Lactobacillus acetotolerans strain相似菌株聚為一個種族，同源性為83%。8號條帶序列和Bacillus subtilis聚為一類，同源性為88%。14號條帶序列和Clostridium sartagoforme聚為一類，同源性為100%。10號條帶序列和Lactobacillus acetotolerans聚為一個種族，同源性為97%。

從古菌DGGE電泳圖譜選取了4個優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，其測序結(jié)果比對后，相似率基本上大于97%，比對結(jié)果顯示4個條帶所代表的古菌都是產(chǎn)甲烷菌，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），可發(fā)現(xiàn)13號條帶序列和Methanosarcina siciliae strain相似菌株聚為一個族群，同源性為95%。15號條帶序列與Methanoculleus bourgensis strain相似菌株聚為一個種族，同源性為98%，這類產(chǎn)甲烷菌在濃香型白酒窖池窖泥中所占比例為4.2%。14號條帶序列和11號條帶序列與Methanospirillum hungatei聚為一類，同源性分別為97%和99%。

圖8 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的古菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.4 理化指標(biāo)和微生物群落的相關(guān)性

通過SPSS軟件對窖泥理化指標(biāo)和微生物多樣性進(jìn)行了方差分析，找出這些因素之間的相互關(guān)系，結(jié)果（表1）顯示，細(xì)菌多樣性與總酸呈極顯著的負(fù)相關(guān)，而與腐殖酸呈極顯著的正相關(guān)。這是由于腐植酸是窖池窖泥中微生物極易利用的一類營養(yǎng)物質(zhì)，而且腐植酸對于窖池窖泥的老熟有著重要影響，因此腐植酸是窖池內(nèi)環(huán)境因素中影響窖池內(nèi)微生物發(fā)展最為重要的一個。同時，細(xì)菌多樣性與有效磷也有顯著的相關(guān)性，這說明了營養(yǎng)物質(zhì)對微生物的影響在任何環(huán)境中都是顯著的。對于古菌，僅與腐殖酸呈極顯著的正相關(guān)，與有效磷、總酸呈顯著的相關(guān)性，其他的指標(biāo)相關(guān)性不顯著。

3 討論

窖池作為濃香型白酒發(fā)酵的容器，對優(yōu)質(zhì)白酒生產(chǎn)有著重要的作用。本實驗研究了濃香型白酒窖池不同窖齡窖泥中主要微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和窖泥理化指標(biāo)（pH、總氮、腐殖酸、有效磷和總酸）的變化規(guī)律，掌握了它們之間相互作用的關(guān)系。其中細(xì)菌和古菌的多樣性指數(shù)的變化規(guī)律與腐殖酸一致，隨著窖齡的增加而增大，與總酸的變化規(guī)律相反，這是由于腐殖化程度的高低對窖泥老熟程度有一定的影響［14］，腐殖酸中含有的維生素B1、B2、B6等營養(yǎng)物質(zhì)，有益于微生物的生長、繁衍。老化的窖泥中活菌數(shù)明顯下降［15，16］，如己酸菌的數(shù)量在400萬個/g以下，放線菌在35萬個/g以下，其與旺盛窖泥中活菌數(shù)相差近10倍，功能菌數(shù)量不足，比例不協(xié)調(diào)。在總酸中乳酸占有較大的比重，其含量會隨著總酸含量的增大而增大，而乳酸含量過高時會抑制己酸菌的生長，影響己酸乙酯的產(chǎn)量，加快窖泥的老化速度，從而影響微生物的生長。這說明隨著窖池窖泥的不斷延續(xù)的發(fā)酵過程中，窖泥的理化指標(biāo)不斷的變化，對微生物的生長有重大影響，同時微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，也影響窖池窖泥的發(fā)酵過程。

圖9 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖

表1 窖泥理化指標(biāo)與微生物多樣性的相關(guān)性

經(jīng)對優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠測序，本研究所得到的6株菌株，通過鑒定發(fā)現(xiàn)它們聚為5個類群，分別為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）。其中，Methanosarcina siciliae strain菌株是發(fā)酵過程中最重要的產(chǎn)甲烷菌群，這類菌株可以通過乙酸營養(yǎng)途徑等多種途徑，利用乙酸、CO2、甲醇等產(chǎn)生甲烷［17，18］。同時，耐酸乳桿菌能在低pH環(huán)境中生長和存活［19］，可發(fā)酵果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖等，不能利用阿拉伯糖、蜜二糖、木糖等［20］，而弱酸性的pH值也是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件，Clostridiales多為厭氧或兼性厭氧菌，在發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸有較大作用［21-23］。在發(fā)酵過程中，窖泥中這些菌群的生長還離不開營養(yǎng)物質(zhì)的作用，如適當(dāng)加入一些營養(yǎng)物質(zhì)，有利于Bacillus subtili菌株的生長繁殖。由此可見，窖泥的各項理化指標(biāo)的變化規(guī)律對這些菌群的生長、繁衍都有著重要的影響。

4 結(jié)論

經(jīng)鑒定，窖泥中的優(yōu)勢菌群為甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），其相互作用影響著窖池窖泥的發(fā)酵過程和濃香型白酒酒體的風(fēng)味特征。

窖泥的理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)隨窖齡的變化呈一定規(guī)律，其中有效磷、總酸、腐殖酸都與微生物群落結(jié)構(gòu)有極大相關(guān)性，對微生物群落的演替有重要影響。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Correlations Between Microbial Community and Physicochemical Indexes in Pit Mud of Different Ages

ZHONG Shu-xia DENG Jie WEI Chun-hui LUO Hui-bo WAN Shi-lü HUANG Zhi-guo
（Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong 643000）

This experiment aims to study the diversity of major microbial community structure in pit mud of different ages and the variation pattern of pit mud’s physical and chemical index（pH，total nitrogen，humic acid，available phosphorus and total acid），and to analyze the correlations among them. The results of Kjeldahl determination showed that：with the increase of pit age，pH of pit mud did not change basically，total acid tended to decrease slowly，total nitrogen rose firstly and then dropped，humic acid and available phosphorus increased slowly. The diversity index of bacteria and archaea by DGGE ranged as 1.62-2.58 and 1.79-2.33，respectively，and gradually increased with the increasing of pit age. The correlation coefficient between bacteria’s community structure and humic acid was 0.972（P＜0.01），-0.987（P＜0.01）with total acid，and 0.878（P＜0.05）with available phosphorus. The correlation coefficient of archaea’s community structure and humic acid was 0.986（P＜0.01），-0.954（P＜0.05）with total acid，0.901（P＜0.05）with available phosphorus，and no significant correlation with other indexes. Regarding bacteria，selected 11 dominant bands for sequencing，and most of them were found to be bacillus generally. Regarding archaea，selected 4 dominant bands for sequencing，and most of them were found to be methanogen. The physiochemical indexes and microbial community structure in pit mud showed a certain regular pattern with the change of the pit age，and some physiochemical indexes were strongly correlated with microbial community structure，these physiochemical indexes greatly concerned with the microbe’s domestication.

pit mud；PCR-DGGE；microbial community；correlation analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.018

2015-07-29

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室開放基金課題（NJ2013-08），四川理工學(xué)院人才引進(jìn)項目（2014RC28）

鐘姝霞，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：31754209@qq.com

黃治國，男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：hzguo@suse.edu.cn