張艷艷齊紅郭慶梅孫稚穎周鳳琴李圣波

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355；2. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250001；3. 山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司，臨沂 266071）

利用蘋果EST-SSR分析木瓜屬種質(zhì)遺傳多樣性

張艷艷1齊紅2郭慶梅1孫稚穎1周鳳琴1李圣波3

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355；2. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250001；3. 山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司，臨沂 266071）

利用蘋果屬的EST-SSR標(biāo)記對33份木瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，以分析引物在木瓜屬中的通用性。篩選出15對引物進(jìn)行PCR擴增，其中9對引物顯示多態(tài)性，共擴增出71條帶，其中多態(tài)性條帶59條，多態(tài)性條帶比率83.10%，并且可成功區(qū)分不同種。PIC多態(tài)性信息含量平均值為0.45，Nei’s 基因多樣性（H）、Shannon指數(shù)（I）的平均值分別為0.45、0.71。根據(jù) EST-SSR 數(shù)據(jù)的UPGMA聚類分析將材料分為五大類，木瓜屬的不同基原樣本各聚為一支，能很好地將5個種植物區(qū)分，顯示出單系性。研究結(jié)果表明，蘋果屬的EST-SSR標(biāo)記在木瓜屬上具有高度的可轉(zhuǎn)移性，可應(yīng)用于木瓜屬植物的資源評價及遺傳關(guān)系研究。

EST-SSR；木瓜屬；通用性

EST-SSR又稱表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星（EST-based microsatellite），是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種新的標(biāo)記方法。EST-SSR標(biāo)記是指在已知的EST序列中，篩選出含有SSR的序列，根據(jù)簡單重復(fù)序列兩端的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增，由于植物上不同物種間微衛(wèi)星重復(fù)單元的堿基組成和拷貝數(shù)不同而顯現(xiàn)出多態(tài)性［1］。由于EST-SSR側(cè)翼序列在物種之間高度保守，EST-SSR標(biāo)記可在不同物種之間通用［2］。EST-SSR 具有開發(fā)過程簡單、成本低、能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異等優(yōu)點，所以成為微衛(wèi)星標(biāo)記的引物重要的來源。因此，EST-SSR分子標(biāo)記的方法可以作為一種既簡便又高效的進(jìn)行木瓜屬植物親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的判斷和進(jìn)行品種鑒定的工具。木瓜屬（Chaenomeles）為薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）植物，本屬全世界有5個種，分別為木瓜（C. sinensis）、皺皮木瓜（C. speciosa）、毛葉木瓜（C. cathayensis）、西藏木瓜（C. thibetica）及日本木瓜（C. japonica）。木瓜是一種名貴的藥食兩用藥材，具有舒筋活絡(luò)和胃化濕之功效［3］。木瓜屬植物親緣關(guān)系復(fù)雜，同物異名和同名異物現(xiàn)象十分普遍。因此，開發(fā)出一種快速有效的方法對木瓜品種進(jìn)行鑒定分類十分必要。

《中國藥典》2010年版規(guī)定藥用木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實，味酸、性溫，歸肝、脾經(jīng)，具舒筋活絡(luò)和胃化濕等功效。木瓜在部分省區(qū)以光皮木瓜或榠楂入藥；毛葉木瓜分布較廣，產(chǎn)量高，據(jù)報道為市場皺皮木瓜的主要來源；西藏木瓜多野生，僅在西藏、云南等部分地區(qū)有分布和使用；而日本木瓜曾在部分地區(qū)當(dāng)作木瓜，現(xiàn)未見繼續(xù)使用。木瓜種質(zhì)變異與分化嚴(yán)重，形成了很多的農(nóng)家品種，隨之藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量也發(fā)生明顯的差異。目前需要對種質(zhì)樣品間的遺傳多樣性進(jìn)行分析，探索木瓜不同種質(zhì)樣品間遺傳多樣性與形態(tài)學(xué)特征之間的對應(yīng)關(guān)系。由于目前木瓜屬基因水平研究還處于起步階段，木瓜屬的EST庫尚未建立，從其近緣植物開發(fā)引物是進(jìn)行研究的有效途徑。本研究從蘋果屬中篩選出適合木瓜屬遺傳分析的ESR-SSR引物，進(jìn)行基因組DNA擴增，從分子水平上分析其遺傳關(guān)系，旨在探討蘋果屬ESR-SSR引物用于木瓜屬的可行性，以期簡便高效的對木瓜屬植物進(jìn)行品種鑒定，判斷親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年4 月在山東亞特生物有限公司木瓜種植基地采集33份木瓜屬種質(zhì)資源，其中西藏木瓜樣品編號XZ01-05、毛葉木瓜MY01-03、皺皮木瓜ZP01-19、日本木瓜RB01-03、光皮GP01-03，采摘各植株的幼嫩葉片，硅膠干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR 引物查找 蘋果屬EST序列來源于PlantGDB（http://www.plantgdb.org/）和NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST），檢索到并且下載了339 058條，查詢截止時間為 2014年11月2日。

采用EST-trimmer（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/ misa/download/est_trimmer.pl）軟件去除5'端或 3'端帶有 polyA 或 polyT尾巴的序列，并截去過短的低質(zhì)量序列片段。采用CAP3軟件對 EST 序列進(jìn)行聚類和拼接處理，以獲得無冗余和盡可能長的重疊序列（contig）。通過Perl語言的 MISA程序篩選SSR位點，篩選標(biāo)準(zhǔn)［4］為：序列長度不小于 100 bp且不大于700 bp，單核苷酸重復(fù)的次數(shù)≥10次，二核苷酸重復(fù)的次數(shù)≥6次，三到六核苷酸重復(fù)的次數(shù)≥5次。

1.2.2 EST-SSR引物設(shè)計 利用Primer 5.0 軟件對符合條件的EST-SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計。參數(shù)設(shè)置為：產(chǎn)物長度設(shè)為 100-350 bp，引物長度為18-22 bp，最佳為20 bp，GC含量40%-60%，引物退火溫度為50-60℃；盡量避免 Dimer 和二聚體出現(xiàn)，從軟件給出96分以上的引物中選取25對合成引物，引物由上海生工合成。

1.2.3 DNA的提取和PCR擴增 實驗材料均為硅膠干燥葉片，取樣約20 mg，液氮充分研磨，利用DNA 提取試劑盒提取DNA。PCR反應(yīng)體積為 20 μL，體系內(nèi)含：2×Taq master mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各1 μL（2.5 μmol/L）、DNA 模板1 μL（約30 ng）。PCR擴增程序為 ：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，適宜退火溫度45 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)；72℃延伸 7 min，4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測 擴增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測，條帶清晰并與預(yù)期片段大小相近的SSR產(chǎn)物表明擴增成功。具有清晰條帶的擴增產(chǎn)物通過6%聚丙烯酰胺凝膠分離，在120 V恒壓下電泳，電泳時間為 2 h，銀染后觀察并照相。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用數(shù)字1和0分別表示電泳條帶的有或無，在 Excel 中建立1和0矩陣。利用NTSYS-pcversion2.11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，品種間的相似系數(shù)按 Jaccard 公式計算，以非加權(quán)類平均法（unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA）進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)樹。利用Popgene32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算多態(tài)性條帶所占的比率（PPB%），觀測等位基因數(shù)（Number of putative alleles，na）、有效等位基因數(shù)（Number of effectivealleles，ne）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）和Shannon.s指數(shù)（I），SSR 位點的多態(tài)性信息量（PIC）按Smith等［5］的公式計算，即PIC=1-∑fi2，其中fi 為 i 位點的基因頻率。以評價蘋果屬植物 EST-SSR引物在木瓜屬 SSR標(biāo)記的可行性。

2 結(jié)果

2.1 EST-SSR引物的信息分析

對來自蘋果屬EST庫的339 058條單一基因序列經(jīng)拼接后，得到無冗余contigs 25 727條，采用MISA 腳本共搜索到含SSR 位點的EST序列3 228條，共搜索到SSR位點3 885個。在所有可用的EST-SSR 序列中，以二核苷酸為重復(fù)單元的序列最多，為2 534條，占 65.23%，二核苷酸重復(fù)類型中以AG/CT最為豐富，其次為AT/AT。

2.2 EST-SSR引物篩選結(jié)果

利用Primer 5.0 軟件設(shè)計EST-SSR引物，結(jié)合自動與人工篩選，共得到25對備選引物。利用不同引物對隨機選取的部分品種基因組DNA 樣品初步擴增篩選，篩選出條帶清晰的9對引物（表1），有效擴增率為30%。利用引物M7對不同品種擴增，結(jié)果（圖1）表明利用蘋果屬EST序列應(yīng)用于木瓜屬SSR標(biāo)記是可行的，并能有效用于木瓜種質(zhì)鑒定。

表1 EST-SSR引物信息

2.3 EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

用篩選的 9 對引物對33種木瓜屬植物進(jìn)行多態(tài)性分析，共得到71 條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶59條，多態(tài)性條帶比率83.10%（表2）。觀測平均等位基因數(shù)為2.55，有效等位基因數(shù)為1.91，Nei’s遺傳多樣性為0.45，Shannon信息指數(shù)為0.71。PIC值是衡量等位信息含量的理想指標(biāo)，9對引物擴增后計算結(jié)果0.25＜PIC＜0.5，說明SSR位點均為中度多態(tài)性位點。

2.4 聚類分析

UPGMA聚類樹狀圖（圖2）顯示，SSR標(biāo)記能將33份木瓜屬不同種質(zhì)完全區(qū)分開，其相似性系數(shù)的變化在0.53-0.99之間，種質(zhì)間的遺傳差異性較大。以0.795相似系數(shù)為閾值，能將33份種質(zhì)資源聚為三大類，第一類包括光皮木瓜，第二類包括全部19份皺皮木瓜種質(zhì)，第三類又分為3個亞類：第一亞類包括5份西藏木瓜種質(zhì)，第二亞類包括3份毛葉木瓜，第三亞類包括3份日本木瓜。該聚類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)結(jié)果大致相同，說明分子標(biāo)記的多態(tài)性與形態(tài)表現(xiàn)的多樣性基本一致，而分子標(biāo)記能反映遺傳上的差異，對物種鑒定的準(zhǔn)確度更高。

圖1 引物M7在33份樣品中的擴增結(jié)果

表2 引物擴增結(jié)果

3 討論

由于EST-SSR多態(tài)位點多，信息含量高，可反映豐富的遺傳變異信息，常被用于藥材及品種的鑒定。大量研究表明，EST-SSR引物的跨種擴增可應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性研究。楊維澤等［6］利用百合等3種植物的EST-SSR標(biāo)記對云南重樓（多葉重樓的變種）進(jìn)行擴增，成功擴增出預(yù)期條帶，結(jié)果表明在滇重樓中具有較高的通用性。陳永霞等［7］選取小麥、玉米等禾谷作物的EST-SSR引物研究扁穗牛鞭草的遺傳變異和親緣關(guān)系，結(jié)果表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。目前，在薔薇科的屬種間證實了ESR-SSR引物的通用性。例如，秦玥等［8］從薔薇科EST庫中開發(fā)了10對華仁杏SSR引物，為華仁杏資源的品種鑒定及分子標(biāo)記輔助育種研究奠定基礎(chǔ)。Vendramin等［9］從桃EST庫中設(shè)計合成了21對EST-SSR引物，在李屬的6個種植物中擴增，擴增成功率高達(dá)78.1%。而通過蘋果屬SSR引物探究EST-SSR標(biāo)記在其他屬種間的通用性研究更為廣泛，主要用于山楂［10］、梨［11］等，已有14個SSR引物被定位到了梨的公共圖譜［1］。

由于目前木瓜屬基因組研究工作落后，難以在較短的時間開發(fā)大量的EST-SSR標(biāo)記，而木瓜和蘋果同屬于薔薇科蘋果亞科，具有較高的同源性。本研究采用蘋果屬植物上開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記，在木瓜屬植物上獲得較高的可轉(zhuǎn)移性，說明這些從蘋果基因組開發(fā)的EST-SSR的序列在木瓜屬上保守性較高，并且可以揭示一定的多態(tài)性水平。

由EST-SSR標(biāo)記的引物篩選結(jié)果可以看出，25對EST-SSR備選引物中，9對擴增出清晰條帶，有效擴增率為36.00%。33份木瓜的相似系數(shù)在0.53-0.99之間，種質(zhì)資源間有較大的遺傳變異，遺傳多樣性較高。由聚類結(jié)果可知，木瓜屬親緣關(guān)系較近的種聚在一起，其4個種的親緣關(guān)系較近，僅有光皮木瓜表現(xiàn)出顯著的單系性，并未與其余4種聚為一支，說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與其他分子標(biāo)記，如AFLP標(biāo)記［12］、SRAP標(biāo)記［13］、RAPD標(biāo)記［14］和ISSR標(biāo)記［15］，對木瓜屬遺傳親緣關(guān)系的研究結(jié)果一致。聚類圖（圖2）顯示西藏木瓜與毛葉木瓜聚為一支，親緣關(guān)系密切，本研究支持王明明等［15］對木瓜屬品種親緣關(guān)系的SRAP分析的研究結(jié)果。俞德俊等［16］也認(rèn)為西藏木瓜與毛葉木瓜親緣關(guān)系十分緊密。

圖2 基于 EST-SSR 分析33個種質(zhì)的遺傳相似性聚類圖

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析皺皮木瓜19個樣品的聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單獨聚為一類都具有比較典型的區(qū)別于其他單株的形態(tài)學(xué)特征，尤其是花色、花型。其中單獨分支的ZP06、ZP07、ZP19在形態(tài)學(xué)特征也與其他差異明顯，表現(xiàn)為葉長圓狀披針形，下表面有褐柔毛，大果型，種子呈扁三角形。其他多為中小果型，種子多呈長三角形，聚類結(jié)果與形態(tài)方面也有對應(yīng)一致的差異結(jié)果，如ZP04、ZP05花大紅色，ZP09、ZP11花色為淺粉色，ZP12、ZP13為粉白色，ZP08、ZP14、ZP15、ZP16的氣香濃郁。張亞利［17］的研究也證實分子標(biāo)記聚類結(jié)果和形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果有一定的一致性。

基于EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)的蘋果EST-SSR引物是可行的，并能用于木瓜屬種質(zhì)的鑒定，同時在指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源分析、遺傳作圖等研究方面有廣闊的應(yīng)用前景。因此，從近緣物種 EST-SSR 上開發(fā)更多的木瓜屬SSR引物是有效途徑。

4 結(jié)論

利用蘋果 EST 數(shù)據(jù)庫開發(fā)了 9對多態(tài)性豐富的 EST-SSR 引物，并用其對 33份木瓜屬品種資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，共擴增出結(jié)合位點 71個，總的多態(tài)性比率為 83.10%，供試材料相似系數(shù)的變化在0.53-0.99，在相似性系數(shù) 0.795 處可將33份材料分為 3 組。本研究結(jié)果表明篩選的9對蘋果屬ESTSSR可用于木瓜屬種質(zhì)的鑒定。

致謝：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物信息中心王興軍教授的課題組提供本研究分子實驗平臺，特此感謝。

［1］Bouek A, Vision TJ. The molecular ecologist's guide to expressed sequence tags［J］. Molecular Ecology, 2007（16）：907-924.

［2］李明芳, 鄭學(xué)勤. 開發(fā) SSR 引物方法之研究動態(tài)［J］遺傳, 2004, 26（5）：769-776.

［3］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2010版）［S］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2010++2.

［4］Scott KD, Eggler P, Seaton G, et al. Analysis of SSR derived from grape EST［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2000（100）：723-726.

［5］肖木輯, 李明順, 李新海, 等. 東北地區(qū)主要玉米自交系的 SSR遺傳多樣性分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報, 2006, 21（增刊）：23-27.

［6］楊維澤, 許宗亮, 楊紹兵, 等. 三種植物EST-SSR引物在滇重樓上的通用性分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014（4）：1686-1690.

［7］陳永霞, 張新全, 謝文剛, 等. 利用EST-SSR標(biāo)記分析西南扁穗牛鞭草種質(zhì)的遺傳多樣性［J］. 草業(yè)學(xué)報, 2011（6）：245-253.

［8］秦玥. 華仁杏品種資源SSR指紋圖譜構(gòu)建研究［D］. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2013.

［9］Vendramin E, Derrori MT, Giovinazzi J, et al. A set of EST-SSRs isolated from peach fruit transcriptome and their transportability across Prunus species［J］. Mol Eco Not, 2007（7）：307-310.

［10］張葉, 代紅艷, 張琪靜, 等. 利用蘋果SSR引物分析山楂屬植物遺傳關(guān)系［J］. 果樹學(xué)報, 2008（4）：521-525.

［11］路娟, 吳俊, 張紹鈴, 等. 基于蘋果EST-SSR的梨種質(zhì)資源遺傳多樣性分析［J］. 西北植物學(xué)報, 2010（4）：690-696.

［12］臧德奎, 陳紅, 鄭林, 等. 木瓜屬優(yōu)良品種親緣關(guān)系的AFLP分析［J］. 林業(yè)科學(xué), 2009（8）：39-43.

［13］王明明, 陳化榜, 王建華, 等. 木瓜屬品種親緣關(guān)系的SRAP分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010（3）：542-551.

［14］陳紅. 木瓜屬種質(zhì)資源的RAPD、AFLP親緣關(guān)系鑒定及遺傳多樣性分析［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

［15］聶金娥. ISSR和SRAP對木瓜種質(zhì)遺傳多樣性研究［D］.濟南：山東中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

［16］俞德俊, 關(guān)克儉, 陸玲娣, 等. 中國植物志［M］. 第36卷.北京：科學(xué)出版社, 1974：348-354.

［17］張亞利. 形態(tài)學(xué)性狀及AFLP標(biāo)記在木瓜海棠新種質(zhì)鑒別和分類中的應(yīng)用［J］. 江蘇農(nóng)科學(xué), 2010（4）：145-147.

（責(zé)任編輯 李楠）

Analysis of Genetic Diversity in Chaenomeles Using Apple EST-SSRs

ZHANG Yan-yan1QI Hong2GUO Qing-mei1SUN Zhi-ying1ZHOU Feng-qin1LI Sheng-bo3
（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250355；2. Jinan Food and Drug Control/Testing Center，Ji’nan 250001；3. Shandong Yate Eco-tech Co.，Ltd.，Linyi 266071）

EST-SSR markers of Malus pumila Mill. were selected to investigate the genetic diversity of germplasm resources in 33 cultivars of Chaenomeles，and hence to confirm the transferability of SSRs information from Malus to Chaenomeles. In this study，15 selected primers were employed for PCR amplification and 9 primers presented polymorphic bands；71 bands were generated by all EST-SSR，of which 59（83.10%）were polymorphic；the different cultivars listed here were successfully distinguished. The average of polymorphic information content（PIC）were 0.45. The average of Shannon index（I） and Nei’s genetic diversity index（H）were 0.71 and 0.45. UPGMA cluster based on the EST-SSR data，the materials were divided into 5 groups. Different samples of Chaenomeles were gathered together and could be distinguished by system tree. The results showed that EST-SSR markers developed from M. pumila showed high transferability to Chaenomeles，and they may be used in germplasm evaluation and genetic relationship for Chaenomeles.

EST-SSR；Chaenomeles；transferability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.014

2015-10-27

國家科技支撐計劃（2011BAI06B06），山東省科技發(fā)展計劃項目（2011GSF11904）

張艷艷，女，碩士研究生，研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源；E-mail：yan13579.com@qq.com

郭慶梅，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源；E-mail：qmguo@sina.com