王娜龔娜劉國麗馬曉穎楊鎮(zhèn)楊濤

（1. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所遼，沈陽 110161；2. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，沈陽 110161）

內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物提高玉米滲透脅迫抗性的表達(dá)譜分析

王娜1龔娜2劉國麗2馬曉穎2楊鎮(zhèn)2楊濤2

（1. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所遼，沈陽 110161；2. 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，沈陽 110161）

利用基因芯片技術(shù)對10% PEG 滲透脅迫下植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物處理的玉米進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，檢測到的差異表達(dá)基因共計441個，其中上調(diào)表達(dá)基因147個，下調(diào)表達(dá)基因294個，參與21條代謝通路。采用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng) V 3.0（MAS）將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，其中45%基因參與各種生物學(xué)過程；18%基因與生成各種細(xì)胞組分有關(guān)；36%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能有關(guān)；1%與GenBank 中功能未知序列相對應(yīng)。KEGG 代謝分析表明差異表達(dá)基因廣泛涉及基礎(chǔ)物質(zhì)代謝、能量代謝、次生代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。表達(dá)譜分析結(jié)果表明，在滲透脅迫下次生代謝產(chǎn)物對玉米的影響是一個多基因參與、多個生物途徑協(xié)同調(diào)控的過程。

內(nèi)生真菌；玉米；滲透脅迫；基因表達(dá)譜

我國玉米約2/3是旱作種植，從播種到收獲整個生育期都可遭遇干旱［1］。干旱使玉米減產(chǎn)25%-30%，甚至絕收，成為影響我國玉米產(chǎn)量的第一限制因素［2，3］。近幾年，植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物因具有促進(jìn)作物生長、增強(qiáng)抗逆性、抗病蟲害及對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，引起廣泛重視，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。因此應(yīng)用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物提高玉米滲透脅迫抗性，將是改善以干旱為主的非生物脅迫的重要手段，同時闡明次生代謝產(chǎn)物提高玉米滲透脅迫抗性的機(jī)制是抗旱育種和栽培技術(shù)改良的理論基礎(chǔ)?；蛐酒且环N檢測基因差異表達(dá)的高通量技術(shù)［4］。目前，此技術(shù)已成功應(yīng)用于非生物脅迫下擬南芥、玉米、水稻的功能基因組研究［5］。本研究采用基因芯片技術(shù)研究滲透脅迫下植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物對玉米基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物由本實(shí)驗(yàn)室提供；供試玉米雜交種為新奇518。

采用水培實(shí)驗(yàn)，將次生代謝產(chǎn)物包衣的種子置于10% PEG-6000 溶液中培養(yǎng)，晝夜溫度控制在26/18℃，3次重復(fù)。2葉期時取玉米根系0.5 g，液氮中保存，用于提取總 RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取100 mg根系于液氮中迅速研磨，至預(yù)冷離心管中，加1 mL Trizol 試劑，振蕩30 s，室溫放置5 min，加200 μL 三氯甲烷，振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃（下同），12 000 r/min離心10 min，取上清液加等體積異丙醇混勻，室溫放置 10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀用1 mL 75%乙醇清洗，12 000 r/min離心5 min。棄上清，室溫放置5 min。沉淀溶于 30 μL RNasefree 的水中，-80℃保存?zhèn)溆?。用紫外分光光度計和甲醛變性凝膠電泳檢測RNA 樣品的質(zhì)量。

1.2.2 探針的制備 采用RNeasyMinElute Cleanup Kit純化 總RNA， 采 用One-cycl e cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為dscDNA，該cDNA純化由GeneChip Sample Cleanup Module來 完 成。 根 據(jù)GeneChip IVTLabeling Kit將純化的cDNA制備為生物素標(biāo)記的cRNA。生物素標(biāo)記的cRNA于94℃保溫，35 min進(jìn)行片段化處理，片段化的cRNA即為雜交探針備用。

1.2.3 雜交及洗滌 取適量片段化的cRNA 與試驗(yàn)芯片（experi-mentalchip）進(jìn)行雜交，16 h，60 r/min 旋轉(zhuǎn)。洗脫和染色于Affymetrix公司的Genechipfluidics station 洗滌工作站中進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)檢測 采用GeneChip Scanner3000高分辨率掃描儀掃描染色后的芯片，掃描所得數(shù)據(jù)利用 Affymetrix Gene Chip Operating Software Version1.4軟件進(jìn)行處理。然后對芯片上的數(shù)據(jù)用 Robust Multichip Analysis（RMA）方法進(jìn)行歸一化，最后篩選出 Ratio≥2 或≤0.5 的基因作為差異表達(dá)基因。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)（Capital-Bio Molecule Annotation System，MAS）以及NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）分析篩選的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量檢測

用Trizol 法提取玉米根尖總RNA。甲醛變性凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示，RNA條帶清晰，完整性較好，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1，總量≥8 μg，A260/A280≥1.80（表1），樣品純度、總量及完整性均符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。

表1 總RNA檢測結(jié)果

2.2 芯片數(shù)據(jù)分析

2.2.1 差異表達(dá)基因的篩選 采用Affymetrix Gene Chip Operating Software Version1.4軟件統(tǒng)計芯片雜交數(shù)據(jù)，通過分析Cy3、Cy5兩種熒光信號強(qiáng)度，可獲得雜交信號強(qiáng)度的散點(diǎn)圖。芯片上每一個基因點(diǎn)的雜交信號就會通過一個數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示（圖2）。Ratio值為各點(diǎn)（Cy5，Cy3）的坐標(biāo)比值。一般設(shè)定 Cy5/Cy3的正常比值（Ratio）在 0.5-2.0 之間，即圖中黑點(diǎn)。Ratio≥2.0 為上調(diào)基因，圖中紅點(diǎn)；Ratio≤0.5 為下調(diào)基因，圖中綠點(diǎn)。采用RMA歸一化方法篩選差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示Ratio＞2和＜0.5的差異基因共441個，其中上調(diào)147個，下調(diào)294個（圖2）。在上調(diào)基因中Ratio＞3.0的22個，Ratio＞4.0的6個，下調(diào)基因中Ratio ＜ 0.4的基因104個，Ratio ＜ 0.3的基因29個。表2中列舉了部分表達(dá)量變化較大的重要基因及其功能描述。

圖1 總RNA電泳圖

圖2 雜交信號散點(diǎn)圖

表2 表達(dá)量變化較大的基因

2.2.2 差異表達(dá)基因的GO分類 通過Gene Ontology（簡稱GO）體系對處理與對照間差異表達(dá)的441個基因進(jìn)行功能分類與注釋。如圖3所示，其中參與各種生物學(xué)過程（biological process）的基因占45%；與生成各種細(xì)胞組分（celluar component）有關(guān)的基因占18%；編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能（molecularfunction）有關(guān)的基因占36%；與GenBank中功能未知序列（other items）相對應(yīng)的基因占1%，這些基因所起的作用還需進(jìn)一步研究。按其生物學(xué)功能可分為21類（圖4），其中與分子功能相關(guān)基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)體活性（占2.27%）、結(jié)合反應(yīng)（占9.98%）、催化反應(yīng)（占21.09%）等共3個類別；細(xì)胞組分主要表現(xiàn)為膜關(guān)閉內(nèi)腔（占0.23%）、細(xì)胞器部分（占10.88%）、細(xì)胞器（占10.88%）、細(xì)胞組分（占16.10%）、細(xì)胞（占16.33%）、復(fù)雜大分子（占6.35%）等共6個類別；生物學(xué)過程主要表現(xiàn)在定位的建立（占5.22%）、發(fā)育過程（占3.85%）、定位（占5.44%）、多細(xì)胞的生物過程（占3.63%）、生殖過程（占0.45%）、繁殖（占0.68%）、應(yīng)激反應(yīng)（占3.63%）、生物過程調(diào)節(jié)（占4.99%）、生物調(diào)節(jié)（占5.22%）、新陳代謝（占21.77%）、生理過程（占34.47%）、細(xì)胞過程（占33.33%）等共12個類別，這說明滲透脅迫下植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物處理玉米后引起許多生理生化過程的變化。比較各功能類型中基因的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與催化反應(yīng)、新陳代謝、生理過程、細(xì)胞過程相關(guān)基因占絕大多數(shù)。從表達(dá)基因的數(shù)量來看，與膜關(guān)閉內(nèi)腔、生殖過程、繁殖相關(guān)的3類基因僅表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，而與復(fù)雜大分子相關(guān)的基因僅表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)；而其余各功能類型基因，均為下調(diào)表達(dá)基因的數(shù)量多于上調(diào)。說明滲透脅迫下植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物處理玉米后，引起根系中基因表達(dá)量下調(diào)較多。

圖3 差異表達(dá)基因功能分類

圖4 上、下調(diào)差異表達(dá)基因的功能分類

2.2.3 代謝途徑的變化情況 利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對篩選出的441個差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類，確定其參與的主要代謝途徑（pathway）。結(jié)果（圖5）顯示，差異表達(dá)基因分布在21個代謝途徑中，全部為下調(diào)代謝途徑。這些差異表達(dá)基因廣泛涉及能量代謝、次生代謝及基礎(chǔ)物質(zhì)代謝等。與蛋白、糖類和核酸等3類生物大分子代謝相關(guān)的途徑共占總量的66.7%，輔酶代謝相關(guān)的途徑占14.3%，氧化磷酸化、次生代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑所占比例相對較低。如圖5所示，滲透脅迫下植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物引起玉米根系各個代謝途徑中基因數(shù)量變化較小而p-Value值差異非常顯著。p-Value值越小說明這條代謝途徑受影響越顯著。其中蛋白酶體、蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、糖酵解和糖異生受影響最為顯著，檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、嘧啶代謝、嘌呤代謝受影響最不顯著。

3 討論

在干旱、鹽堿等滲透脅迫條件下，植物通過改變基因表達(dá)，調(diào)控代謝途徑等作出響應(yīng)。本研究通過對差異表達(dá)基因的分析，表明在滲透脅迫下次生代謝產(chǎn)物對玉米的影響是一個多基因參與、多個生物過程協(xié)同調(diào)控的過程，基因表達(dá)量的變化可能是調(diào)控的主要方式，同時基因表達(dá)量差異較大的基因也不能忽略。本研究采用基因芯片技術(shù)，在玉米根系中共檢測到17 556個基因，其中差異表達(dá)的基因441個，包括147個上調(diào)基因，294個下調(diào)基因，說明滲透脅迫下次生代謝產(chǎn)物引起玉米根系基因的表達(dá)發(fā)生了變化。利用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢，結(jié)果表明這些基因參與了21條生物學(xué)代謝通路，說明次生代謝產(chǎn)物通過多個生物過程協(xié)同作用來調(diào)控玉米適應(yīng)滲透脅迫。

圖5 下調(diào)代謝途徑

在滲透脅迫下，植物為了能繼續(xù)生存，從3個層次上做出相應(yīng)調(diào)整，最終適應(yīng)環(huán)境：調(diào)控正常生長發(fā)育；控制造成的傷害和修復(fù)；重新均衡體內(nèi)狀況［6］。由于脅迫所產(chǎn)生的活性氧，它們損傷植物的蛋白質(zhì)、膜脂及細(xì)胞組分等，是導(dǎo)致植物損傷的一個重要原因。參與抗氧化保護(hù) 反應(yīng)的酶類主要有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST），谷胱甘肽氧化酶（GPOX），過氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）等。其中GST是主要成員，可與內(nèi)源或外源有害物質(zhì)結(jié)合，使其分解，或形成易溶于水的物質(zhì)，排出體外，從而達(dá)到 解毒的目的［7，8］。Shimabukuro等［9］于1970年最先報道因除草劑形成的氧脅迫能誘導(dǎo)玉米中GST大量表達(dá)，使除草劑阿特津脫毒，激發(fā)植物的防御反應(yīng)。Gallé等［10］用PEG處理小麥，耐旱小麥中GST的活性高于不耐旱小麥，不同品種小麥GST基因均呈上調(diào)表達(dá)。戚元成等［11］報道，過量表達(dá)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱能力。本研究處理組谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶13 Glutathione transferase13（GST），上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的7.926 2倍，表明滲透脅迫下次生代謝 產(chǎn)物影響了玉米體內(nèi)GST的表達(dá)。鋅依賴水解酶類（Zn-dependent hydrolases，including glyoxylases）廣泛存在于高等植物，參與植物發(fā)育調(diào)控、免疫應(yīng)答及非生物逆境脅迫響應(yīng)等多個方面［12］。本研究處理組鋅依賴水解酶類上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的3.256 6倍，表明滲透脅迫下次生代謝產(chǎn)物影響了玉米體內(nèi)鋅依賴水解酶類的表達(dá)。非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（nonspecific lipid-transfer protein，nsLTPs）是一類廣泛存在于植物中的堿性小蛋白，參與許多生物進(jìn)程，如磷脂轉(zhuǎn)移、生殖發(fā)育、病原菌防 御和非生物脅迫反應(yīng)［13］。本研究處理組nsLTPs上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的3.218 7倍，表明滲透脅迫下次生代 謝產(chǎn)物影響了玉米體內(nèi)nsLT Ps的表達(dá)。在滲透脅迫下，次生代謝產(chǎn)物還引起了大量假設(shè)蛋白表達(dá)量的變化。其中，hypothetical protein LOC100277838上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的40.270 2倍，它是由Robert E. Sharp實(shí)驗(yàn)室在干 旱脅迫下選取玉米根部構(gòu)建標(biāo) 準(zhǔn)化文庫時獲得，位于第8條染色體上［14］。hypothetical protein LOC100272329上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的21.432 8倍，具有泛素硫酯酶活性，參與泛素依賴蛋白分解代謝生物過程，位于第4條染色體上［15］。hypothetical protein LOC100191831上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量是對照的6.798 6倍，由Schna ble等［15］于2009年進(jìn)行玉米全基因組測序時獲得，位于第9條染色體上。雖然干旱脅迫下次生代謝產(chǎn)物僅引起玉米根部2.51%基因的表達(dá)量發(fā)生變化，但這些差異表達(dá)基因表現(xiàn)出廣泛的功能多樣性。

4 結(jié)論

本研究采用基因芯片技術(shù)，滲透脅迫下在次生代謝產(chǎn)物處理的玉米根系中共檢測到差異表達(dá)的基因441個，包括147個上調(diào)基因，294個下調(diào)基因。通過GO體系對這些差異基因進(jìn)行功能分類，其中45%基因參與各種生物學(xué)過程；36%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能有關(guān)；18%基因與生成各種細(xì)胞組分有關(guān)；1%與GenBank中功能未知序列相對應(yīng)，這些基因所起的作用還需進(jìn)一步研究。利用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢，結(jié)果表明這些差異基因參與了21條生物學(xué)代謝通路，包括基礎(chǔ)物質(zhì)代謝、能量代謝、次生代謝及信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression Profile Analysis of Maize Resistance Under Osmotic Stress Induced by Secondary Metabolites of Endophytes

WANG Na1GONG Na2LIU Guo-li2MA Xiao-ying2YANG Zhen2YANG Tao2
（1. Institute of Plant Nutrients and Environmental Resources，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161；2. Center of Microbial Engineering，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161）

Genechip technology was used to analyze the expression profile of differential genes in corn treated by metabolites of endophyte under 10% PEG osmotic stress. The results showed that there were 441 differentially expressed genes identified in this study including 147 upregulated genes and 294 down-regulated genes，participating in 21 metabolic pathways. The genes with differential expressions were classified by GO-ranking methods through CapitalBio Molecule Annotation System V 3.0（MAS）. Among them 45% participated in various biological processes，18% were related to synthesis of cellular components，the coded products of 36% genes were related to performing a variety of molecular function，and 1% corresponded with other unknown sequences in GenBank. Thus the role of these genes still needs further study. Pathways analysis using the KEGG pathway database showed the differentially expressed genes broadly were involved in basic metabolism，energy metabolism，secondary metabolism and signal transduction pathways. The expression profile analysis indicate that the effects of secondary metabolites on corn under osmotic stress are synergistical processes by many genes in many pathways.

endophyte；maize；osmotic stress；gene expression profile

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.013

2015-10-16

遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2011215005），遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目（2013002002）

王娜，女，碩士，研究方向：植物內(nèi)生菌；E-mail：wnsxh1999@126.com

楊濤，男，博士，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物；E-mail：yangtaolaas@sina.cn