董云王毅靳豐蔚孫萬倉劉自剛方彥徐妙云王磊

（1. 甘肅省農(nóng)科院院作物研究所，蘭州 730070；2. 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070；3. 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

研究報告

油菜（Brassica napus）Bna-miR1140基因啟動子miR1140Pro的克隆與表達(dá)模式研究

董云1王毅1靳豐蔚1孫萬倉2劉自剛2方彥2徐妙云3王磊3

（1. 甘肅省農(nóng)科院院作物研究所，蘭州 730070；2. 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070；3. 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

旨在研究Bna-miR1140的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)理，依據(jù)本實驗室前期的油菜miRNA芯片實驗結(jié)果，從油菜栽培種Westar中克隆了Bna-miR1140前體序列上游1.5 kb的片段，并進(jìn)行了順式作用元件分析，然后構(gòu)建了GUS報告基因植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將miR1140 pro∷GUS轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜Westar品種中，經(jīng)PCR法鑒定獲得5株陽性株。對陽性株油菜T1代各組織的GUS化學(xué)染色分析表明，miR1140前體序列上游1.5 kb區(qū)域具有啟動子的功能，能夠驅(qū)動GUS在油菜中表達(dá)，并且GUS基因僅在葉柄及葉腋中特異性表達(dá)，說明油菜miR1140Pro為特異性啟動子。

油菜；Bna-miR1140；啟動子；表達(dá)模式

啟動子是基因5'端與RNA酶及一些反式作用因子結(jié)合的區(qū)域，是指RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。生物能夠根據(jù)自身的需要及環(huán)境的改變，定時、定位及定量地表達(dá)所需的基因產(chǎn)物，在這個過程中，作為調(diào)控元件之一的啟動子發(fā)揮了重要的作用［1］。通常基因的表達(dá)模式由其上游啟動子所決定，在基因啟動子區(qū)通常存在不同的順式或反式作用元件，克隆基因啟動子序列并對其中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行分析是了解基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。

miRNAs是一類在進(jìn)化上保守的長約21 nt的非編碼單鏈RNA，在生物體生長發(fā)育過程、抗生物或者非生物脅迫中起著非常重要的作用，在基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置［2，3］，有效地抑制其靶基因編碼的蛋白質(zhì)的合成，或以其他調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制靶基因的表達(dá)。近年來，關(guān)于克隆、分析植物miRNA啟動子的報道較多，如毛果楊ptr-MIR156a［4］、草莓miR390［5］、番茄 Sly-miR167a［6］，此外，Han等［7］利用生物信息學(xué)對大豆降解組文庫miRNA的啟動子進(jìn)行了分析。前人研究結(jié)果表明Bna-miR1140基因是蕓薹屬特異miRNA［8］，并通過降解組測序分析得到Bna-miR1140的靶基因為一種糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase）和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子（Arabidopsis response regulator ARR8-like protein）［9］，而關(guān)于Bna-miR1140功能的研究鮮見報道。miRNA自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是miRNA 在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中第一步，也是非常重要的一步。本文為研究BnamiR1140的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)理，依據(jù)本實驗室前期的油菜miRNA芯片實驗結(jié)果，利用plantCARE軟件對Bna-miR1140上游1.5 kb的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，找到TATA-box，G-box等啟動子的關(guān)鍵元件，然后設(shè)計引物從油菜基因組DNA中擴(kuò)增出該1.5 kb片段并構(gòu)建了miR1140 pro∷GUS植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化油菜，獲得轉(zhuǎn)基因株系，GUS染色分析Bna-miR1140的表達(dá)特異性，旨在為進(jìn)一步揭示Bna-miR1140基因的時空表達(dá)和功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 油菜品種 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）栽培種westar。

1.1.2 菌株和載體 根癌農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體pPZP212均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供?？寺≥d體pEASY-T1 Cloning Vector（10 ng/μL）和大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞Trans 1-T1購自北京全式金生物公司。

1.1.3 酶、試劑盒和主要的化學(xué)試劑 Taq DNA聚合酶購自北京澤星生物公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；Go3S 柱離心式PCR產(chǎn)物回收試劑盒V3.1 K141購自申能博彩生物科技公司；Trizol購自上海生物工程有限公司；IPTG、X-gal、T4 DNA連接酶購自Promege公司。普通的化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 油菜Bna-miR1140基因啟動子的擴(kuò)增 根據(jù)本實驗室前期的油菜miRNA芯片實驗結(jié)果，對Bna-miR1140上游1.5 kb的序列設(shè)計引物，上游引物5'端添加Hind III 酶切位點，下游引物5'端添加XbaⅠ酶切位點；引物序列編號為BnamiR1140ProFw、Bna-miR1140ProRv；測序引物NOS70按照植物表達(dá)載體pPZP212中NOS終止子序列設(shè)計；鑒定引物Bna-miR1140ProFw1和gusRv按照miR1140 pro∷GUS構(gòu)建上的miR1140 pro序列和GUS基因序列設(shè)計。引物由上海生物工程有限公司合成，序列詳見表1。以CTAB法從油菜幼苗中提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增1 351 bp的Bna-miR1140基因啟動子片段。PCR反應(yīng)體系：Taq（2 U/mL）0.5 mL，10×Taq reaction buffer 2.0 mL，dNTP mix（10 mmol/L each）0.5 mL，Bna-miR1140ProFw（10 mmol/L）0.5 mL，Bna-miR1140Pro Rv（10 mmol/L）0.5 mL，油菜DNA 1.0 mL，dH2O 15 mL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 引物序列

1.2.2 油菜Bna-miR1140基因啟動子表達(dá)載體構(gòu)建 依據(jù)載體pEASY-T1 Cloning Vector使用說明進(jìn)行T連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1。通過藍(lán)白斑篩選得到的單克隆經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送北京中科希林生物公司用引物M13+和M13-進(jìn)行雙向測序驗證。利用plantCARE在線 軟 件（http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/ plantcare/html/）對啟動子序列的順式作用元件進(jìn)行在線分析，找到TATA-box，G-box等啟動子的關(guān)鍵元件。用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xba I對pPZP212質(zhì)粒和測序正確的Bna-miR1140Pro-pEASY-T1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳切膠回收1 351 bp和11 124 bp的DNA片段，膠回收后的Bna-miR1140Pro片段和pPZP212載體片段用T4 DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，再PCR和酶切鑒定陽性重組子Bna-miR1140Pro-Ppzp212，對鑒定正確的陽性重組子搖菌后送北京中科希林生物公司用引物Bna-miR1140ProFw和NOS70進(jìn)行雙向測序驗證。測序驗證正確的陽性重組子Bna-miR1140Pro-Ppzp212（以下簡寫為miR1140 pro∷GUS）電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.3 油菜的轉(zhuǎn)化及陽性植株鑒定 按照Prem L Bhalla和Mohan B Singh的方法［10］（略有改變），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染油菜子葉柄法轉(zhuǎn)化油菜。經(jīng)Kanamycin不同梯度培養(yǎng)篩選到的生根壯苗煉苗移栽后，用CTAB法提取其DNA，以miRProFw1/gusRv和miRProFw/gusRv兩對鑒定引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出1 905 bp和622 bp條帶的為陽性株，PCR陽性對照模板為質(zhì)粒miR1140 pro∷GUS；陰性對照為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的油菜基因組DNA。

1.2.4 轉(zhuǎn)miR1140 pro∷GUS油菜T1代陽性株組織化學(xué)染色 收集經(jīng)PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)miR1140 pro∷GUS油菜T1代植株各組織器官，分別放入 1.5 mL EP管中，加適量配制好的GUS染色緩沖液（浸沒材料為宜），于37℃溫育8-10 h，檢查X-gluc的著色情況，并用75%-95%梯度濃度的乙醇由先低濃度再高濃度的順序室溫脫色，直至葉片呈透明無色，最后用無菌水清洗2次，在體式顯微鏡下觀察著色情況。

圖1 油菜Bna-miR1140啟動子的克隆及酶切鑒定

2 結(jié)果

2.1 油菜Bna-miR1140啟動子片段的擴(kuò)增

以提取和純化的油菜DNA作為模板，BnamiR1140ProFw為正向引物，Bna-miR1140ProRv為反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Bna-miR1140啟動子序列，片段長1 351 bp左右（圖1-A）。PCR產(chǎn)物與pEASY-T1 Cloning Vector連接后，利用引物BnamiR1140ProFw/Bna-miR1140ProRv、酶Xba I/Hind III分別對質(zhì)粒Bna-miR1140Pro-pEASY-T1進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果（圖1-B、1-C）顯示質(zhì)粒PCR條帶和酶切條帶大小均與理論大小一致，說明BnamiR1140啟動子序列PCR產(chǎn)物成功連接到克隆載體。引物M13+和M13-對Bna-miR1140Pro-pEASY-T1雙向測序，用軟件Vector NT I9.0將序列拼接，序列長1 351 bp。利用plantCARE在線軟件（http:// bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子序列的順式作用元件進(jìn)行在線分析，結(jié)果（表2）顯示，該啟動子含有與轉(zhuǎn)錄必需的RNA聚合酶結(jié)合的TATA盒（TATA-box），以及在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率中發(fā)揮重要作用的CAAT盒（CAAT-box）。另外序列中包含了其他2種順式作用元件：參與水楊酸應(yīng)答的TCA元件（TCA-element）和參與細(xì)胞周期調(diào)控的元件（MSA-like），還含有一些光響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)的元件。

表2 應(yīng)用PlantCARE在線預(yù)測的油菜Bna-miR1140啟動子區(qū)的順式調(diào)控作用元件及功能

2.2 油菜Bna-miR1140啟動子植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用Hind III/Xba I分別雙酶切植物表達(dá)載體質(zhì)粒pPZP212和測序驗證正確的克隆質(zhì)粒miR1140PropEASY-T1，切膠回收目的片段（圖2-A和2-B），并 連 接。 先 用 引 物Bna-miR1140ProFw和BnamiR1140ProRv 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用酶EcoR I/Hind III、Xba I/Nco I、Xho I/Nco I等3對酶分別進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果見圖2-C、2-D、2-E。EcoR I/Hind III雙酶切產(chǎn)生的片段大小為3 510 bp，Xba I/Nco I雙酶切產(chǎn)生的片段大小2 335 bp，Xho I/Nco I雙酶切產(chǎn)生的兩個片段大小分別為1 399 bp和193 bp，3次酶切片段大小符合理論值。PCR和酶切均鑒定為陽性的重組子miR1140pro∷GUS經(jīng)測序驗證獲得最終的植物表達(dá)載體Bna-miR1140Pro-Ppzp212。將質(zhì)粒miR1140pro∷GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，用鑒定表達(dá)載體構(gòu)建的方法篩選到了陽性克隆。

圖2 油菜Bna-miR1140啟動子植物表達(dá)載體構(gòu)建及酶切鑒定

2.3 miR1140 pro∷GUS轉(zhuǎn)化油菜及T0代陽性株的獲得

轉(zhuǎn)化了植物表達(dá)載體miR1140pro∷GUS的農(nóng)桿菌LBA4404（OD650nm=0.5）懸浮液共計浸染300個具有2 mm葉柄的油菜子葉，在恢復(fù)培養(yǎng)后，進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)，總共誘導(dǎo)出愈傷295個，出愈率98%。選取無褐化、無污染的培養(yǎng)皿中的愈傷250個，在低濃度25 mg/L kanamycin抗性的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長，誘導(dǎo)出芽67個，芽誘導(dǎo)率 27%。挑取生長健壯、無污染和無褐化的54個發(fā)生芽繼續(xù)在低濃度25 mg/L kanamycin抗性的芽生長培養(yǎng)基中生長4周，然后轉(zhuǎn)移至高濃度50 mg/L kanamycin抗性的篩選培養(yǎng)基中生長4周，篩選出綠苗數(shù)10個，白化苗21個，壞死和污染的苗23個。將所有綠苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，一月后發(fā)生根的苗數(shù)為7株，出根率為70%。通過高濃度50 mg/L kanamycin抗性篩選后，初步確定7株呈陽性。

以抗性篩選為陽性的轉(zhuǎn)化miR1140pro∷GUS的T0代油菜苗基因組DAN為模板，利用miRProFw1/ gusRv和miRProFw/gusRv兩對引物分別對這些DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，WT作為陰性對照，大腸桿菌質(zhì)粒miR1140pro∷GUS作為陽性對照。瓊脂糖凝膠電泳檢測后（圖3），兩對引物的PCR擴(kuò)增鑒定陽性結(jié)果一致，并且分別擴(kuò)增出的片段大小與陽性對照相同，條帶大小分別為1 905 bp、622 bp。通過kanamycin抗性篩選和PCR鑒定，最后確定轉(zhuǎn)Bna-miR1140啟動子的油菜T0代陽性苗共5株。

圖3 轉(zhuǎn)化miR1140 Pro∷GUS油菜T0代陽性株P(guān)CR鑒定

2.4 轉(zhuǎn)miR1140 Pro∷GUS油菜T1代陽性株組織化學(xué)染色鑒定

由于構(gòu)建的miR1140 pro∷GUS植物表達(dá)載體中帶有miR1140 pro驅(qū)動的報告基因GUS，所以可以通過對轉(zhuǎn)Bna-miR1140啟動子的T1代油菜的5個株系中的陽性株進(jìn)行各組織GUS染色，觀察GUS基因的表達(dá)，以野生型油菜和轉(zhuǎn)空載體pPZP212的油菜作為對照。染色結(jié)果（圖4）表明，在轉(zhuǎn)miR1140 pro∷GUS的T1代陽性株油菜中，GUS基因未在根、葉、花中表達(dá)，僅在油菜的葉柄和芽分生組織中表達(dá)，由此說明Bna-miR1140的表達(dá)模式為特異性表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)miR1140 pro∷GUS油菜T1代陽性株組織化學(xué)染色

3 討論

通常功能基因的表達(dá)模式由其上游啟動子所決定，在基因啟動子區(qū)一般存在不同的順式或反式作用元件。在植物體內(nèi)，不同的轉(zhuǎn)錄因子與這些元件結(jié)合從而調(diào)控基因表達(dá)量的升高或降低。microRNA作為近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的調(diào)控型小分子RNA備受人們關(guān)注，并且在生物體生長發(fā)育過程中起著重要的作用。目前，人們將microRNA的研究著力于其加工成熟過程以及其生物學(xué)功能上，并取得重要的成果，關(guān)于miRNA的轉(zhuǎn)錄和啟動子功能的研究報道也較多。RNA聚合酶II和III均可以參與miRNA的轉(zhuǎn)錄［11，12］，作為聚合酶II基因的一個重要特征，啟動子有著非常重要的作用。Lee等［13］首次通過實驗發(fā)現(xiàn)人體來源的miR23a是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄而來，他們發(fā)現(xiàn)其前體轉(zhuǎn)錄物具有RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特征，即5'端具有帽子結(jié)構(gòu)，而3'端具有PolyA結(jié)構(gòu)。Kasschaukd等［14］也研究發(fā)現(xiàn)許多primiRNA含有5'帽子和3' poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)，而這是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的mRNA的典型特征，之后Xie等［15］發(fā)現(xiàn)在其研究的miRNA的前體上游序列中普遍存在著TATA-box，這預(yù)示著這些序列可能具有啟動子活性。

miRNA特異的表達(dá)模式可能取決于其上游啟動子的調(diào)控，而且，miRNA啟動子的調(diào)控模式與功能基因啟動子類似，能夠指導(dǎo)miRNA在植物特定發(fā)育時期，特定組織中發(fā)揮重要調(diào)控作用［16］?？寺iRNA前體上游的序列，通過連接報告基因gus，轉(zhuǎn)化擬南芥等植物后進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析和GUS活性的測定，可以分析啟動子不同的調(diào)控模式及其miRNA的功能。Sunkar 等［17］在研究擬南芥中miR398參與植物抗氧化脅迫的分子機(jī)理時，將miR398b 基因上游2 kb的序列與gus報告基因相連并轉(zhuǎn)化擬南芥。GUS染色結(jié)果顯示，miR398b 基因的上游序列能夠驅(qū)動gus基因在擬南芥的輪座葉，莖和花藥中表達(dá)。此外，該研究小組還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Cu和Fe離子處理后，轉(zhuǎn)基因植株的GUS 著色明顯變淺，這與miR398b 響應(yīng)氧化脅迫處理下調(diào)是完全吻合的。Robert等［18］將miR159a和miR159b莖環(huán)結(jié)構(gòu)上游序列與gus報告基因連接構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，對轉(zhuǎn)基因擬南芥的染色結(jié)果表明，miR159a和miR159b的啟動子驅(qū)動的gus基因具有相似的表達(dá)模式，且與其靶基因的表達(dá)模式也非常相似。miR398a已證明可以參與植物抵抗氧化脅迫過程，miR398a在擬南芥中過表達(dá)可以提高擬南芥對病原菌的抗性，由其表達(dá)模式推測它可能參與了某些物質(zhì)的運(yùn)輸［17］。Wang等［19］研究了擬南芥中miR160 與根尖形成的相互關(guān)系，在實驗中將miR160 前體上游序列與gus報告基因相連后轉(zhuǎn)化擬南芥，GUS染色顯示miR160能夠在主根維管組織和側(cè)根原基處有所表達(dá)，而在根尖部位表達(dá)量微弱，連同其他數(shù)據(jù)證明miR160 在根尖形成過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

Bna-miR1140是蕓薹屬特異miRNA，關(guān)于其功能研究和表達(dá)調(diào)控均未見報道。本研究將目標(biāo)啟動子與GUS報告基因融合，通過轉(zhuǎn)化油菜和GUS化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)miR1140啟動子為特異性啟動子，GUS僅在葉柄及葉腋中表達(dá)，即表明miR1140在葉柄和葉腋中表達(dá)。植物通過在葉腋中形成新的分生組織產(chǎn)生分枝，分枝的形成受到植株發(fā)育階段、環(huán)境因素和激素的嚴(yán)格調(diào)控［20］。miRNA參與油菜分枝生長發(fā)育的分子機(jī)理研究幾乎是一片空白，目前還沒有從油菜中克隆出任何控制分枝的相關(guān)基因及miRNA，這與分枝在油菜株型育種中的重要地位極其不符合。研究miRNA參與調(diào)控油菜分枝形成和發(fā)育的遺傳控制機(jī)理，可以完善高等植物發(fā)育生物學(xué)的理論。同時，對于克隆鑒定調(diào)控油菜分枝發(fā)育的miRNA基因，結(jié)合分子育種手段，培育理想油菜株型，以及增加油菜產(chǎn)量和降低油菜生產(chǎn)成本極具現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

本研究對miRNA基因上游1 351 bp的序列進(jìn)行分離，并構(gòu)建了miR1140 pro∷GUS植物表達(dá)載體，得到5株轉(zhuǎn)化miR1140 pro∷GUS的油菜T0代陽性株。通過對陽性株油菜各組織的GUS化學(xué)染色分析表明，miR1140前體序列上游1.5 kb區(qū)域具有啟動子的功能，能夠驅(qū)動GUS在油菜中的表達(dá)。對miR1140 pro∷GUS轉(zhuǎn)基因油菜根、莖、葉、葉腋（莖尖分生組織，SAM）、葉柄、花、種莢等組織、器官進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果表明GUS僅在葉柄及葉腋中表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning of Bna-miR1140 Gene Promoter in Rape and Preliminary Identification of Its Expression Pattern

DONG Yun1WANG Yi1JIN Feng-wei1SUN Wan-cang2LIU Zi-gang2FANG Yan2XU Miao-yun3WANG Lei3
（1. Crop Research Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070；2. Rapeseed Engineering Technology Research Center of Gansu，Lanzhou 730070；3. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

In order to explore the expression pattern and regulation mechanism of Bna-miR1140，the upstream 1.5 kb fragment from Bna-miR1140 precursor was cloned in a cultivated variety Westar of rape by PCR approach on the basis of rapeseed miRNAs chip results in our laboratory，and their cis-acting elements were analyzed. Then plant expression vector of GUS reporter genes was constructed，the vector miR1140 pro∷GUS was transformed into variety Westar by Agrobacterium-mediated approach，and 5 positive transgenic lines were obtained. GUS chemically staining the varied tissues of T1 generation groups of positive rape strains，the results showed that the upstream 1.5 kb region of miR1140 precursor sequence presented the function of promoter，driving GUS expression in rapeseed，moreover，only specific expression in the petiole and leaf axil，indicating that miR1140Pro was a specific promoter.

rapeseed；Bna-miR1140；promoter；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.010

2016-02-06

國家自然科學(xué)基金項目（31260334），甘肅省自然科學(xué)基金資助項目（1308RJZA205），甘肅省農(nóng)科院創(chuàng)新專項（2013GAAS16），甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心項目（1306NTGA022）

董云，男，博士，副研究員，研究方向：油菜育種；E-mail：dongyungs@163.com

徐妙云，女，博士，研究方向：植物開花時間和種子發(fā)育調(diào)控機(jī)制；E-mail：xumiaoyun76@163.com

王磊，男，博士，研究方向：玉米抗逆與生殖發(fā)育調(diào)控、玉米基因工程；E-mail：caaswlwl@163.com