王連慶 翟俏麗 趙培慶 李濤

（淄博市中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，淄博 255036）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

王連慶 翟俏麗 趙培慶 李濤

（淄博市中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，淄博 255036）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有自我更新的能力和多向分化潛能，在體外可被誘導(dǎo)分化成多種細(xì)胞類型，在骨及軟骨組織修復(fù)中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。為研發(fā)有效促進(jìn)BMMSCs定向分化的藥物，將BMMSCs更合理安全地應(yīng)用于臨床，有必要闡明表觀遺傳在BMMSCs分化過程中的調(diào)控機(jī)制。由于BMMSCs的異常分化可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，其分化調(diào)控機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。表觀遺傳調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化及非編碼RNA等，對(duì)決定BMMSCs分化方向至關(guān)重要。闡明表觀遺傳在BMMSCs分化過程中的調(diào)控機(jī)制，將有助于研發(fā)有效促進(jìn)BMMSCs定向分化的藥物，更合理安全地將BMMSCs應(yīng)用于臨床。就BMMSCs分化中的主要表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的最新研究進(jìn)展做一綜述，并進(jìn)行了總結(jié)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞分化；表觀遺傳調(diào)控

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，除具有支持與調(diào)控造血功能外，還具有成骨、成脂和軟骨形成等多向分化能力，是目前骨組織工程廣泛使用的主要細(xì)胞來源，可用于多種骨骼疾病的臨床治療，在其他組織器官損傷修復(fù)過程中也具有廣闊的應(yīng)用前景［1，2］。BMMSCs的分化受多種因素調(diào)控，表觀遺傳作為BMMSCs分化的主要調(diào)控機(jī)制之一，在決定其分化方向上起到重要作用。

表觀遺傳是能夠調(diào)控基因表達(dá)但不改變相關(guān)基因序列的可遺傳的修飾。表觀遺傳調(diào)控BMMSCs分化相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)，在一定程度上代表BMMSCs的多能性。同時(shí)，表觀遺傳狀態(tài)的改變也能 影響B(tài)MMSCs的分化方向及能力［3］。常見的表觀調(diào)控主要包括DNA甲基化、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化和非編碼RNA調(diào)控等，本文擬從以上幾方面介紹近年來BMMSCs分化過程中表觀遺傳調(diào)控的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 組蛋白修飾

1.1 組蛋白乙酰化修飾

組蛋白乙?；揎検窃诮M蛋白N端賴氨酸殘基上添加乙?；鶊F(tuán)，是最常見的表觀遺傳修飾之一。組蛋白乙?；軌虼龠M(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)開放從而使基因轉(zhuǎn)錄活化，組蛋白去乙?；瘎t與染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。組蛋白乙酰化水平主要受組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetylase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的調(diào)控［4］。

相關(guān)調(diào)控基因的組蛋白乙酰化程度可反映BMMSCs的干性維持及分化狀態(tài)，H3K9和H3K14的乙酰化（H3K9ac，H3K14ac）是基因活化的標(biāo)志。在BMMSCs成骨分化過程 中，成骨相關(guān)基因RUNX2和ALP的表達(dá)逐步上調(diào)，而干細(xì)胞自我更新相關(guān)的干性因子Oct4和Sox2表達(dá)顯著下降，它們的表達(dá)變化與H3K9ac和H3K14ac密切相關(guān)［5］。

根據(jù)HDAC結(jié)構(gòu)域的同源性可將其分為4類。在現(xiàn)有研究中，第I類的HDAC1、HDAC8及第III類的SIRT1在BMMSCs的分化選擇中發(fā)揮了重要的作用。在心肌微環(huán)境下，BMMSCs可以分化形成心肌細(xì)胞，在該過程中，HDAC1的表達(dá)顯著下降，同時(shí)，敲低HDAC1能夠促進(jìn)BMMSCs直接分化為心肌細(xì)胞［6］。HDAC8通過抑制H3K9的乙?；癛UNX2的活性，使大鼠BMMSCs向成骨分化的程度降低［7］。SIRT1則可直接調(diào)控干性因子Sox2來維持BMMSCs的自我更新和多能性，其活性的降低使Sox2表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致BMMSCs自我更新能力和分化能力的退化，活化的SIRT1則以劑量依賴的方式促進(jìn)BMMSCs克隆形成能力和成骨成脂分化能力［8］。同樣，SIRT1可通過去乙?；?catenin使其在核內(nèi)累積進(jìn)而調(diào)控BMMSCs分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［9］。此外，SIRT1可通過活化Sox9和NF-κB的去乙?；?，促進(jìn)BMMSCs的軟骨分化過程［10］（圖1 右）。

組蛋白去乙?；敢种苿?duì)BMMSCs的分化有很強(qiáng)的影響。用組蛋白去乙?；敢种苿┍焖幔╒PA）和丁酸鈉（NaBu）處理BMMSCs可增加組蛋白H3和H4乙?；?，顯著促進(jìn)肝臟特異基因的表達(dá)，這提示去乙?；敢种苿┐龠M(jìn)BMMSCs向肝臟方向的分化［11］。同時(shí)，NaBu可抑制大鼠BMMSCs中HDAC2的表達(dá)及其在平滑肌特異基因上的募集，進(jìn)一步誘導(dǎo)高水平的H3K9ac和H4ac，促進(jìn)平滑肌特異基因的表達(dá)，誘導(dǎo)BMMSCs向平滑肌方向分化［12］。另外一種組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA，可顯著抑制干性因子Oct4、Sox2及Nanog的下調(diào)，以穩(wěn)定BMMSCs中多能性基因的表達(dá)［13］。其他研究發(fā)現(xiàn)，TSA處理增加了組蛋白H3的乙酰化水平并抑制了BMMSCs成脂分化［14］（圖1左）。

1.2 組蛋白甲基化修飾

組蛋白甲基化是另一種常見的組蛋白翻譯后修飾。組蛋白可以發(fā)生單甲基化、雙甲基化或三甲基化。甲基化的增加通常能夠促進(jìn)組蛋白與DNA的親和力，增加轉(zhuǎn)錄抑制的程度，例如H3K9me和H3K27me。然而也有一些重要的例外，如H3K4的甲基化常與活化的染色質(zhì)相關(guān)，而H3K9三甲基化依賴于不同的基因?qū)θ旧|(zhì)狀態(tài)有不同的調(diào)控作用。組蛋白甲基化受組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）和組蛋白去甲基化酶（HDM）共同調(diào)控［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基化修飾酶能夠調(diào)控BMMSCs的分化能力。甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2，可以三甲基化染色質(zhì)H3K27，而這種抑制性的表觀遺傳標(biāo)記能夠被去甲基化酶KDM6A去掉。Hemming小組［15］發(fā)現(xiàn)，EZH2的高表達(dá)能夠促進(jìn)BMMSCs的成脂分化，抑制成骨分化，KDM6A則有相反的作用，兩者通過影響關(guān)鍵調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的水平來調(diào)控BMMSCs分化的特異性。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1，可通過組蛋白甲基化介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑調(diào)控基因表達(dá)，該因子進(jìn)入細(xì)胞核后，可對(duì)H3R17進(jìn)行甲基化，提高BMMSCs的體外成脂分化、成骨分化及成肌分化的能力［16］。

圖1 乙酰化修飾對(duì)BMMSC分化的影響

胚胎干細(xì)胞中的關(guān)鍵基因位點(diǎn)同時(shí)包含活化的組蛋白修飾標(biāo)記（如H3K4me3）和抑制性的組蛋白修飾標(biāo)記（如H3K27me3），這兩種修飾使基因處于一種抑制性但可以被迅速活化的狀態(tài)［3］。這些位點(diǎn)上表觀遺傳修飾的狀態(tài)可決定相關(guān)基因的最終命運(yùn)。在未分化的BMMSCs中，c-Myc和cyclin D1（Wnt/βcatenin信號(hào)通路的靶點(diǎn)）基因上與β-catenin相結(jié)合的啟動(dòng)子區(qū)同時(shí)具有抑制狀態(tài)及活化狀態(tài)的染色質(zhì)標(biāo)記，在BMMSCs向成骨分化過程中，啟動(dòng)子區(qū)含有活化的染色質(zhì)標(biāo)記H3K4me，而抑制性標(biāo)記H3K27me3缺失，與之相反，在BMMSCs成脂分化過程中，啟動(dòng)子區(qū)則僅有抑制性的H3K27me標(biāo)記［17］。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是DNA化學(xué)修飾的一，在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。哺乳動(dòng)物的DNA甲基化主要是在C-G二核苷酸（CpG）上共價(jià)添加甲基基團(tuán)，具有靶向特異性，是最重要的沉默性表觀遺傳修飾之一。目前已發(fā)現(xiàn)的所有CpG島的DNA甲基化幾乎都沉默了相關(guān)基因，DNA甲基化抑制劑5-Aza可使基因表達(dá)很大程度上得以恢復(fù)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族（DNMTs）與可能的DNA去甲基化酶協(xié)同調(diào)控DNA甲基化水平及相關(guān)基因的表達(dá)［4］。

DNA甲基化狀態(tài)的改變關(guān)系到細(xì)胞分化命運(yùn)的轉(zhuǎn)換。5-Aza導(dǎo)致的整體甲基化水平的改變抑制了BMMSCs的增殖和成脂分化［14］，促進(jìn)其成骨分化、向神經(jīng)元樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞的分化［18］。應(yīng)用靶向DNA甲基化技術(shù)將BMMSCs中Trip10甲基化，其分化潛能受到限制，促進(jìn)了BMMSCs向神經(jīng)及成骨方向分化，阻斷了BMMSCs的成脂分化，說明Trip10的甲基化對(duì)BMMSCs分化方向的誘導(dǎo)具有特異性［19］。腫瘤抑制基因HIC1 和RassF1A的靶向甲基化促使BMMSCs轉(zhuǎn)化成腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的BMMSCs仍然能分化成不同的細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，同時(shí)，HIC1 和RassF1A定向甲基化后，少量轉(zhuǎn)化的BMMSCs使免疫缺陷的小鼠快速產(chǎn)生腫瘤，這也提示DNA的異常甲基化可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［20］。

3 非編碼RNA

3.1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼 RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，是表觀遺傳調(diào)控研究的另一個(gè)熱點(diǎn)。人類的lncRNA有大約30 000條不同的轉(zhuǎn)錄本，是非編碼轉(zhuǎn)錄組的主要組成成分，絕大部分lncRNA的功能尚不清楚。近年來，一些研究證實(shí)lncRNA在BMMSCs分化調(diào)控中也發(fā)揮了重要作用。Wang等［21］報(bào)道，在BMMSCs向軟骨方向分化過程中，lncRNA ZBED3-AS1 和 CTA-941F9.9表達(dá)顯著上調(diào)，并在分化28 d后仍呈高水平表達(dá)，提示它們可能參與了BMMSCs的軟骨分化過程。在BMMSCs成骨分化過程中，lncRNA-ANCR（anti-differentiation ncRNA）表達(dá)顯著降低，lncRNA-ANCR通過與EZH2結(jié)合抑制Runx2的表達(dá)，進(jìn)而抑制BMMSCs的成骨分化，抑制內(nèi)源lncRNA-ANCR的表達(dá)則促進(jìn)了成骨分化［22］。此外，有研究報(bào)道lncRNA H19和uc022axw.1的上調(diào)表達(dá)可能也參與了BMMSCs的成骨分化［23］。這些研究結(jié)果表明lncRNA也是BMMSCs分化的一種重要調(diào)控因子，為骨相關(guān)疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)。

3.2 微小RNA

微小RNA（microRNA）是一類長(zhǎng)度為21-25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA特異結(jié)合，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制其翻譯。miRNA也參與了基因的表觀遺傳調(diào)控，在BMMSCs的干性維持和多分化方向的過程中發(fā)揮了重要作用。miRNA-133a能夠促進(jìn)BMMSCs向心肌細(xì)胞的分化［24］。而miRNA-124通過與STAT3的3'-UTR的靶向結(jié)合，抑制STAT3的翻譯，使BMMSCs向心肌細(xì)胞分化的能力減弱［25］。此外，miRNA-9與β-巰基乙醇協(xié)同誘導(dǎo)BMMSCs向神經(jīng)方向分化［26］。miRN A-29a/b及miRNA-449a可抑制BMMSCs向軟骨方向的分化［27］。miRNA-155，miRNA-221/222則在BMMSCs的成脂分化過程中發(fā)揮了重要的負(fù)調(diào)控作用［28］。

圖2 PPARγ在BMMSC成骨分化末期調(diào)控C/EBPα表達(dá)的模式圖

4 表觀遺傳修飾的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)

在生物體復(fù)雜精細(xì)的內(nèi)環(huán)境下，表觀遺傳調(diào)控往往也不是以單一的方式發(fā)揮作用的，不同的組蛋白修飾之間可以相互影響，協(xié)同發(fā)揮作用，組蛋白修飾也可以與DNA甲基化相互偶聯(lián)，從而產(chǎn)生復(fù)雜的表觀遺傳效應(yīng)。表觀遺傳修飾的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)模式也參與了BMMSCs分化的精細(xì)調(diào)控。

BMMSCs的成骨分化和成脂分化之間的平衡受C/EBPα啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化和組蛋白乙?；膮f(xié)同調(diào)控，在成骨分化的末期，C/EBPα啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化阻止了PPARγ的結(jié)合，HDAC1進(jìn)一步結(jié)合到該區(qū)域，降低組蛋白乙酰化水平，PPARγ在C/EBPα的啟動(dòng)子區(qū)建立了DNA甲基化和組蛋白乙酰化的橋梁［29］。組蛋白修飾因子YY1與轉(zhuǎn)錄共激活因子p300可通過對(duì)組蛋白乙?；降恼{(diào)控改變BMMSCs中軟骨特異基因ChM-I的表達(dá)，在啟動(dòng)子區(qū)低甲基化的細(xì)胞中抑制YY1并增加p300和基本轉(zhuǎn)錄因子Specificity protein3（Sp3）的表達(dá)能夠維持ChM-I的表達(dá)，但在高甲基化的細(xì)胞中并沒有這種作用，說明在BMMSCs軟骨分化過程中，ChM-I受組蛋白去乙?；徒M蛋白甲基化的協(xié)同負(fù)調(diào)控［30］。BMMSCs在成骨分化過程中RUNX2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)的H3K9ac和H3K4me3修飾水平及在RUNX2啟動(dòng)子區(qū)的募集均有升高，而與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的H3K9me3修飾水平及在RUNX2啟動(dòng)子區(qū)的募集降低，RUNX2啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化修飾程度降低［31］。這些研究結(jié)果說明，不同的表觀遺傳修飾之間可以協(xié)同作用調(diào)控BMMSCs的分化過程。

5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中的表觀遺傳組學(xué)研究

近年來，系統(tǒng)性高通量的研究方法比如染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序ChIP-seq（chromatin immunoprecipitation with deep sequencing） 和 芯 片ChIP-on-chip（chromatin immunoprecipitation assay）技術(shù)的廣泛應(yīng)用有助于從基因組整體水平研究表觀遺傳修飾的狀況，建立BMMSCs分化過程的表觀遺傳譜。

Herlofsen 等［32］應(yīng)用ChIP-Seq研究了來源于4個(gè)捐贈(zèng)者的hBMMSCs體外軟骨分化前后7 d的染色質(zhì)表觀遺傳譜，分析了6種組蛋白修飾（H3K4me3，H3K9ac，H327me3，H3K36me3，H3K4me1，H3K27ac）在整體基因組上的變化情況，并用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法檢測(cè)DNA甲基化和mRNA芯片檢測(cè)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，分化過程中上調(diào)的基因與軟骨形成密切相關(guān)。在其基因體（gene bodies）區(qū)發(fā)生了與轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)的H3K36me3修飾，在基因的啟動(dòng)子區(qū)和5'末端區(qū)域活化染色質(zhì)標(biāo)記H3K4me3和H3K9ac水平大幅增加，每個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因在至少一個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域的H3K27ac和H3K4me1修飾增加，這兩種修飾也是活化染色質(zhì)的標(biāo)記。在7 d的時(shí)間范圍內(nèi)啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化改變與基因表達(dá)的變化并不顯著相關(guān)。

此外，Tan 等［33］應(yīng)用ChIP-on-chip技術(shù)在全基因組水平研究hBMMSCs的基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac和H3K9me2修飾狀況，結(jié)果表明在hBMMSCs中基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9的修飾與mRNA的表達(dá)相關(guān)性很好，功能分析顯示在hBMMSCs自我更新中多種關(guān)鍵的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠被H3K9的修飾調(diào)控。而在hBMMSCs成骨分化過程中，H3K9ac在基因啟動(dòng)子區(qū)的整體富集逐漸降低，H3K9me2的整體富集升高［34］。這些結(jié)果表明H3K9ac和H3K9me2影響的基因活化和沉默可能對(duì)hBMMSCs的自我更新、多能性維持及成骨分化至關(guān)重要。

6 展望

表觀遺傳調(diào)控參與了多種細(xì)胞發(fā)育和分化過程，也是BMMSCs分化的主要調(diào)控機(jī)制。近年來已發(fā)現(xiàn)多種參與BMMSCs分化的表觀遺傳修飾，在此基礎(chǔ)上，研發(fā)有效調(diào)控這些修飾的藥物，為BMMSCs提供精確的分化條件，使BMMSCs能夠向可控可預(yù)測(cè)的方向分化。除了文中介紹的組蛋白修飾類型外，組蛋白磷酸化、泛素化等修飾在BMMSCs分化中的作用也有待深入研究。此外，隨著BMMSCs體外培養(yǎng)代數(shù)的增加，DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和成脂分化相關(guān)基因甲基化水平升高［35］。這些因素對(duì)BMMSCs的衰老有重要影響，因此對(duì)DNA甲基化的合理調(diào)控是抑制BMMSCs衰老，使之更有效的應(yīng)用于臨床治療的一種方法。這些研究成果對(duì)其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，如脂肪和臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)制研究及臨床應(yīng)用也有重要的參考價(jià)值。BMMSCs的異常分化可導(dǎo)致腫瘤及其他一些疾病的發(fā)生，表觀遺傳調(diào)控的異常是其主要原因之一［3］，表觀遺傳修飾試劑作為分化誘導(dǎo)劑的應(yīng)用對(duì)選擇性癌癥治療是很重要的，它侵入性更低，并對(duì)癌細(xì)胞有更高的選擇性。表觀遺傳治療的缺點(diǎn)是缺乏特異性，目前能夠調(diào)控干細(xì)胞分化和增殖的小分子藥物已在檢測(cè)和開發(fā)階段，可調(diào)控觀編程和發(fā)育信號(hào)途徑的各個(gè)方面［36］。

綜上所述，表觀遺傳在BMMSCs的多能性維持和分化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，但具體機(jī)制尚 不完全明了，新的調(diào)控修飾有待發(fā)現(xiàn)。這個(gè)領(lǐng)域的深入研究必將為提高BMMSCs的定向分化效率提供線索，在臨床組織工程和細(xì)胞移植領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Epigenetic Regulation Mechanism in the Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell

WANG Lian-qing ZHAI Qiao-li ZHAO Pei-qing LI Tao
（Center of Translational Medicine，Central Hospital of Zibo，Zibo 255036）

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells（BMMSCs），with the potential of self-renewal and multipotent differentiation，may differentiate to be several types of cells by induction，thus hold critical clinic values for the restoration of destroyed bones and cartilages. In order to investigate a medicine that may efficiently promote the directional differentiation of BMMSCs and thus using BMMSCs in clinic more safely and reasonably，it is necessary to illustrate the epigenetic regulation mechanism in the differentiation process of BMMSCs. Abnormal regulation of BMMSCs differentiation may lead to development of several diseases，thus appropriate control of BMMSCs differentiation mechanism has been the hotspot topic of research. Epigenetic regulation，such as DNA methylation，histone acetylation，histone methylation and noncoding RNA，play critical roles in the regulation of BMMSCs differentiation. This review summarizes the progress on major epigenetic regulation mechanisms involved in BMMSCs differentiation in recent years.

bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）；cell differentiation；epigenetic regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.003

2015-08-25

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014HM042，ZR2015PH031，ZR2015HM031）

王連慶，男，博士，研究方向：遺傳學(xué)；E-mail：lianqing.wang@hotmail.com

李濤，男，博士，研究方向：骨科；E-mail：litaozhongguo@vip.163.com