陳小青，朱方容，賓榮佩，廖詠梅，韋海玲，李乙

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007；2.廣西大學(xué)，南寧市 530004）

桑斷枝爛葉病病原菌對(duì)桑樹不同部位的致病性測(cè)定

陳小青1，朱方容1，賓榮佩1，廖詠梅2，韋海玲2，李乙1

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007；2.廣西大學(xué)，南寧市 530004）

為測(cè)試桑斷枝爛葉病病原菌對(duì)桑樹的致病性，用病原菌的分生孢子、菌絲塊對(duì)室內(nèi)盆栽的桑樹的枝葉片進(jìn)行接種處理；用病原菌的菌絲塊對(duì)人工氣候室內(nèi)水培保鮮的桑樹枝梢不同部位的葉片和枝莖段進(jìn)行接種處理。結(jié)果表明，在溫度為20～25℃，濕度為95%～100%的條件下，接種新梢嫩葉、嫩枝，48 h就出現(xiàn)病斑，以后病斑不斷擴(kuò)大，接種后第3～5 d，病斑擴(kuò)展最快；病原菌的易感染部位是桑樹新梢；半年生成熟枝條和1年生老枝干難以被侵染；新梢頂端第4節(jié)位以上的嫩枝、嫩葉最容易感染發(fā)病。因此，清除病枝、病葉是減少初侵染源、防止病害發(fā)生的重要手段。

桑；斷枝爛葉?。恢虏⌒?/p>

2011年3月下旬，廣西的鳳山、東蘭、凌云、靖西等蠶區(qū)的桑園發(fā)生與流行一種新的桑病，病狀表現(xiàn)為桑樹新梢和葉片出現(xiàn)相似的灰褐斑而使枝條折斷、病葉穿孔破爛，對(duì)蠶桑生產(chǎn)的危害大，文獻(xiàn)資料查不到相似病癥的記載，暫稱之為“桑斷枝爛葉病”。該病主要為害桑樹新長的嫩枝及葉片，老枝少見染病。葉片染病，先出現(xiàn)灰褐色點(diǎn)狀病斑，以后病斑擴(kuò)大成圓形或不規(guī)則形病斑，病斑有同心輪紋，病斑處失去水分而干枯、變薄、易裂、穿孔、破損；枝條的病斑也為灰褐色，有的也有明顯同心輪紋，病斑不斷擴(kuò)大，直至環(huán)繞枝條一圈，枝條病斑處干癟、腐朽粉化、內(nèi)部中空，很容易折斷。2011年3-4月觀察到病害在鳳山縣鳳城、金牙、中亭、喬音、袍里等鄉(xiāng)鎮(zhèn)暴發(fā)流行之外，此后幾年，均未大規(guī)模發(fā)生流行，僅在局部桑園發(fā)生持續(xù)為害。

本研究小組對(duì)桑斷枝爛葉病進(jìn)行病原菌的分離及顯微鏡觀察，并通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行種類鑒定，初步鑒定桑斷枝爛葉病由莖點(diǎn)霉屬（Phoma）真菌引起。本文采用致病菌株對(duì)桑樹枝葉不同部位的致病性進(jìn)行測(cè)試，研究其侵染規(guī)律，為該病有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌菌株

FSX-FHC菌株，來源：鳳山縣鳳城鎮(zhèn)鳳凰村發(fā)病桑園，分離保存于廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站桑樹病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試桑樹品種

桂桑優(yōu)62。

1.3 接種方法

1.3.1 分生孢子懸浮液接種盆栽桑樹的葉片 采用分生孢子懸浮液對(duì)室內(nèi)盆栽桑樹葉片進(jìn)行接種。將單孢純化后的FSX-FHC菌株接種至桑汁培養(yǎng)基平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)20～30 d，待培養(yǎng)基可觀察到黑褐色分生孢子器時(shí)，用已消毒的接種針在超凈工作臺(tái)內(nèi)挑取數(shù)個(gè)分生孢子器置于10 mL的無菌水中，用解剖針輕輕輾壓分生孢子器，使分生孢子溢出，并用移液槍輕輕混打液體使分生孢子均勻地分散到無菌水中，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定分生孢子液的濃度，通過逐漸加入分生孢子器將溶液配制成濃度為1×108個(gè)/mL的分生孢子懸浮液。采用微型噴霧器，將配制好的分生孢子懸浮液均勻噴灑于刺傷（解剖針輕刺上表皮和葉肉）的桑葉片表面，外罩塑料薄膜保濕，置于25 ℃下36 W的白光燈光照12 h和黑暗12 h交替條件下保濕培養(yǎng)。3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理5株，每株噴灑分生孢子懸浮液3張葉子，噴到滴水為度。另一處理以噴灑無菌水作對(duì)照。接種3 d后觀察接種葉片發(fā)病情況，并拍照記錄。

1.3.2 菌絲塊接種室內(nèi)盆栽桑樹的葉片 用FSXFHC菌株的菌絲塊對(duì)室內(nèi)盆栽桑樹進(jìn)行接種。將FSX-FHC菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃36W的白光燈光照條件下培養(yǎng)7 d，自菌落邊緣打直徑為0.6 cm的菌碟，用解剖針挑取菌碟將菌絲面朝下接種于健康的桑葉表面，并順勢(shì)用針頭輕輕刺入桑葉形成小傷口，使菌絲的表面與傷口貼合。放置于人工簡(jiǎn)易氣候室內(nèi)，溫度23～26 ℃，每天上午10時(shí)和下午3時(shí)開霧氣各0.5 h保濕培養(yǎng)。共接種10株，每2株為一次重復(fù)，每重復(fù)接種10個(gè)點(diǎn)。用無菌的PDA培養(yǎng)基接種作空白對(duì)照。接種3 d后觀察接種葉片發(fā)病情況，并拍照記錄。

1375 胰腺癌石蠟包埋組織中微 RNA 原位雜交檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化 倪晨明，倪燦榮，金 鋼，焦莉娟，李連峰，鄭建明

1.3.3 菌絲塊接種室內(nèi)水培保鮮的桑樹綠枝葉 用FSX-FHC菌株的菌絲塊對(duì)室內(nèi)水培保鮮的桑樹綠枝葉進(jìn)行接種。先設(shè)定人工氣候室內(nèi)的溫度20℃ 和濕度100%待用。選擇陰天或晴天上午9時(shí)前，在田間將供試帶12片葉以上的桑綠枝剪下，及時(shí)用廢舊報(bào)紙包好遮光防止萎蔫，立即轉(zhuǎn)入人工氣候室內(nèi)，置于裝有滅菌水的三角瓶中水培，拉線固定好枝條梢部，防止枝條倒伏，霧化補(bǔ)濕，黑暗條件下放置1～2 h待枝葉完全恢復(fù)后即可接種。

將FSX-FHC菌株在PDA培養(yǎng)基25℃ 36 W的白光燈光照條件下培養(yǎng)7 d，自菌落邊緣打直徑為0.6 cm的菌碟，用解剖針挑取菌碟將菌絲面朝下接種于健康的桑葉表面，并順勢(shì)用針頭輕輕刺入桑葉形成小傷口，使菌絲的表面與傷口貼合。

接種后，人工氣候室內(nèi)設(shè)定06:00～17:59溫度25℃，光照強(qiáng)度420 Lx和18:00～05:59溫度23℃ 晝夜交替，保持濕度95%以上。共接種13株，高度1 m以上，枝條帶葉12片葉以上，接種部位分別在第2、4、6、8、10、12節(jié)位的葉片及其葉下莖段，每葉葉脈兩側(cè)各接1個(gè)共2個(gè)，每節(jié)莖段接1個(gè)。以無菌的PDA培養(yǎng)基接種作空白對(duì)照。接種3 d后觀察接種葉片發(fā)病情況，并拍照記錄，7 d后調(diào)查發(fā)病率。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，不形成病斑；1級(jí)，病斑面積占半張葉面積的1%～5%；2級(jí)，病斑面積占半張葉面積的6%～15%；3級(jí)，病斑面積占半張葉面積的16%～25%；4級(jí)，病斑面積占半張葉面積的26%～35%；5級(jí)，病斑面積占半張葉面積的35%以上。

1.3.4 菌絲塊接種不同樹齡枝段 剪取具有主枝段（1年生）、分枝段（半年生成熟枝段）和新梢幼嫩枝的整條樹枝，共選11枝，每桑枝條按照以上分段進(jìn)行接種，參照1.3.3準(zhǔn)備接種用的FSX-FHC菌株菌絲塊。接種后相對(duì)濕度95%環(huán)境保持20 d，調(diào)查發(fā)病率。

2 結(jié)果

2.1 分生孢子懸浮液接種對(duì)盆栽桑樹葉片的致病性

用單孢分離純化的FSX-FHC菌株的分生孢子器配制分生孢子懸浮液，接種于桑葉片表面。7 d后調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每株桑苗接種的3張葉片中，對(duì)照處理僅有褐色傷痕，未見典型病斑（圖1-a）；而分生孢子懸浮液接種的葉片，也只有1張發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間初期癥狀類似，病斑中心處變薄，易失水變干破裂、穿孔，外圈為明顯的淡黃色暈圈（圖1-b，圖1-c）。接種30 d后發(fā)病的葉片上均未觀察到分生孢子器。

圖1 FSX-FHC菌株分生孢子懸浮液接種盆栽桑樹葉片7 d癥狀（a為對(duì)照；b、c為接種癥狀）

2.2 菌絲塊接種對(duì)室內(nèi)盆栽桑樹葉片的致病性

與對(duì)照（見圖2-a）相比，菌絲塊接種桑樹葉片后3 d開始出現(xiàn)病斑，病斑中心處初為較薄水漬狀，第3～5 d病斑擴(kuò)散速度最快，7 d后病斑可見明顯輪紋，并有少量凸起顆粒狀物，為分生孢子器，10 d以后病斑停止擴(kuò)散，病斑近圓形或不規(guī)則形，病斑中間變干破裂、穿孔，外圈有明顯的黃色暈圈（圖2-b，圖2-c），20 d后病葉開始脫落，發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀一致。從表1可以看出，以菌絲塊接種發(fā)病率高達(dá)82.76%。

圖2 FSX-FHC菌株菌絲塊接種盆栽桑樹葉片7 d癥狀（a為對(duì)照；b、c為接種癥狀）

表1 FSX-FHC菌株菌絲塊接種室內(nèi)盆栽桑樹葉片的發(fā)病情況

2.3 菌絲塊對(duì)水培保鮮綠枝不同部位葉片及其葉下莖段的致病性

用FSX-FHC菌株的菌絲塊接種桑樹新梢第2節(jié)至第12節(jié)的葉片及其葉下莖段，所有接種點(diǎn)均發(fā)病。接種后48 h即可見接種點(diǎn)周圍出現(xiàn)明顯水漬狀，第3～4 d病斑明顯擴(kuò)大，但第5 d后以后病斑基本停止擴(kuò)大。接種7 d后，病斑上可見明顯的同心輪紋和少量的分生孢子器，但病斑組織變薄，容易破裂穿孔。其中第2節(jié)、第4節(jié)位的葉片發(fā)病率最高，葉片的發(fā)病率分別為65.38%和73.08%，莖段的發(fā)病率分別為63.64%和72.73%；第6節(jié)至第12節(jié)位的葉片、莖段的發(fā)病率均在50%以下。表明病原菌的侵染部位是新梢，第4節(jié)位以上的嫩枝、嫩葉最容易感染發(fā)??；隨著枝葉的成熟，對(duì)病菌的抵抗力增強(qiáng)，接種后發(fā)病率降低。

圖3 FSX-FHC菌株菌絲塊對(duì)桑樹新梢不同部位葉片及其葉下莖段的致病性

2.4 菌絲塊對(duì)桑樹不同年齡枝段的致病性

主枝段（1年生）、分枝段（半年生成熟枝段）和新梢幼嫩枝接種菌絲塊后，1年生主枝及半年生成熟枝段未見病斑出現(xiàn)，發(fā)病率均為0；新梢幼嫩枝發(fā)病率為18.18%。說明成熟枝條（半年以上年齡的枝段）對(duì)病原菌有較強(qiáng)的抵抗性。病原菌易侵染桑樹的部位為新梢未成熟幼嫩枝。

表2 FSX-FHC菌株對(duì)桑樹不同年齡枝段的致病性

3 討論

3.1 室內(nèi)水培保鮮桑樹新梢接種方法在病原鑒定中的應(yīng)用。

在人工氣候室條件下水培保鮮桑樹新梢，再用桑斷枝爛葉病FSX-FHC菌株的分生孢子及菌絲塊接種，均可引起桑葉和桑枝產(chǎn)生與田間表現(xiàn)一致的癥狀。接種后2 d出現(xiàn)褐色病斑，此后病斑迅速擴(kuò)大，接種后5 d病斑停止擴(kuò)大，形成分生孢子器，病斑處變薄易破，癥狀表現(xiàn)與田間發(fā)病完全一致。該接種方法為本文首創(chuàng)，該方法具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)試準(zhǔn)確、試材易備、隨時(shí)可試的特點(diǎn)，可在短期內(nèi)快速的進(jìn)行多次試驗(yàn)，可用于不同病害的病原鑒定、抗性評(píng)價(jià)和病原菌復(fù)壯、保存等相關(guān)試驗(yàn)。

3.2 斷枝爛葉病病原菌侵染為害桑樹的部位主要是新梢的葉片和枝莖

病原菌對(duì)半年以上成熟枝、老枝沒有致病力，對(duì)頂端4節(jié)以上的嫩枝、嫩葉致病力最強(qiáng)。因此，在進(jìn)行斷枝爛葉病的病原菌致病性測(cè)試、桑品種抗病性測(cè)試等相關(guān)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)選新梢相同節(jié)位的葉片或枝段接種。而在生產(chǎn)實(shí)際中應(yīng)重點(diǎn)保護(hù)嫩枝嫩葉，預(yù)防斷枝爛葉病的發(fā)生與為害。

3.3 病害的流行與氣候條件的關(guān)系有待進(jìn)一步研究

田間實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的桑園多分布于巖溶峰叢洼地、盤地，四面環(huán)山，比較避風(fēng)，春季長期大霧繚繞、空氣濕度大等具有特定地理位置和獨(dú)特氣候條件。而在人工接種過程中，也發(fā)現(xiàn)溫度20～25℃，濕度95%～100%時(shí)，病害接種成功率最高并能使病斑迅速擴(kuò)展蔓延。因此，病害發(fā)生是否與特殊的氣候條件有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

［1］ 朱方容.桂西蠶區(qū)發(fā)生罕見桑樹病害的診斷及防控措施［EB/OL］.（2011-05-05）［2016-05-15］.http：//www.gxcy.gov.cn/tytg/ShowArticle.asp？ArticleID=45104.

［2］ 謝玲，岑貞陸，朱方容，等.桑樹細(xì)菌性枯萎病病菌致病性測(cè)定的人工接種方法［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（6）：1133-1136.

［3］ 王瑜，劉怡，周彬彬，等.苜蓿對(duì)匍柄霉葉斑病與莖點(diǎn)霉葉斑病的抗性評(píng)價(jià)研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（7）：155-161.

［4］ 高葦，李寶聚，石延霞，等.茄子棒孢葉斑病病原菌鑒定及致病性研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2012，42（2）：113-119.

S888.71；

A；

1006-1657（2016）02-0012-4

2016-04-25；

2016-05-20

廣西“十二五”科技規(guī)劃重大專項(xiàng)項(xiàng)目及課題（No.桂科重14121002，No.桂科重14121002-4-4），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（No.CARS-22），八桂學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)（No.2011104-16）。

信息］陳小青（1979—），女，本科，農(nóng)藝師，從事桑樹病蟲害防治研究。E-mail：326401251@qq.com

信息］朱方容（1962—），男，本科，研究員。E-mail：gxzfr@126.com