李冬艷,　吳　錫,　郝芳麗,　楊　洋,　陳小明

(大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司, 上海 200131)

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多糖類手性固定相超臨界流體色譜法分離手性化合物

李冬艷,吳錫,郝芳麗,楊洋,陳小明*

(大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)有限公司, 上海 200131)

摘要:采用超臨界流體色譜法(SFC),在多糖固定相Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE和IF上成功拆分了11種手性化合物。分離結(jié)果表明,這6支手性色譜柱對(duì)這些手性化合物具有良好的手性識(shí)別互補(bǔ)性,均可以在10 min之內(nèi)得到良好的分離結(jié)果,具有較好的實(shí)用性。改性劑甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)手性化合物的保留時(shí)間以及手性選擇性均具有良好的調(diào)節(jié)作用,需要根據(jù)不同手性物質(zhì)在手性柱上的分離情況加以區(qū)別,選擇使用,并調(diào)節(jié)改性劑至合適的比例。針對(duì)鍵合型固定相溶劑通用性的特征,特殊改性劑的應(yīng)用也有助于優(yōu)化手性分離。

關(guān)鍵詞:超臨界流體色譜法;手性分離;手性固定相;多糖衍生物

近十多年來,超臨界流體色譜(SFC)發(fā)展迅速,成為繼GC與HPLC之后發(fā)展起來的又一項(xiàng)重要的色譜分離技術(shù)。尤其是在手性分離與分析領(lǐng)域,因其分析速度快、分離效率高、溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為手性色譜法中不可或缺的重要分離技術(shù)之一[1,2],與HPLC、GC相互補(bǔ)充,特別適用于手性分離制備[3]。另一方面,可以用在SFC上配套使用的手性柱或手性填料也多種多樣,使得手性分離的成功率極高,極大地推動(dòng)了手性SFC的發(fā)展。目前,多糖類衍生物手性固定相,因其廣泛的手性識(shí)別能力、良好的穩(wěn)定性、耐用性、高負(fù)荷等優(yōu)點(diǎn),無論是用于手性分析,還是手性色譜制備,都是HPLC中使用最為廣泛的手性固定相[4-6],由于該類固定相主要用于在正相流動(dòng)相條件下實(shí)現(xiàn)手性分離,因此也非常適合于手性SFC分離[7]。國內(nèi)也有一些SFC用于手性藥物分離的文獻(xiàn)綜述[8,9];金薇等[10]報(bào)道采用SFC分離了左乙拉西坦及其右旋異構(gòu)體。

本文以鍵合型多糖系列柱i-chiral 6: Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE、IF為試驗(yàn)對(duì)象,嘗試在SFC模式下對(duì)11種手性化合物進(jìn)行手性分離,同時(shí)探討了改性劑種類、濃度、堿性添加劑以及特殊改性劑對(duì)SFC手性分離的影響。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試藥與材料

超臨界流體色譜儀(日本Jasco公司); 11個(gè)手性化合物樣品均由本公司自主開發(fā),其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示;i-chiral 6系列手性柱(日本Daicel公司): Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE與IF(150 mm×4.6 mm, 5 μm),分別在硅膠載體上化學(xué)鍵合了系列多糖衍生物而得,各手性固定相的名稱與結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

CO2為上?？諝饣す咎峁?化學(xué)純度99.99%,其他溶劑均為色譜純。

圖1　11個(gè)手性化合物的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1　Molecular structures of the 11 chiral compounds

圖2　i-chiral 6系列手性固定相的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 2　Molecular structures of the chiral stationary phases on i-chiral 6　IA: amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate); IB: cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate); IC: cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate); ID: amylose tris(3-chlorophenylcarbamate); IE: amylose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate); IF: amylose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate).

1.2超臨界色譜條件

除非特別說明,色譜條件均為:流速2 mL/min;背壓10 MPa;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm(化合物6為203 nm)。

色譜柱死時(shí)間由1,3,5-三叔丁基苯在相同的色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定。

1.3手性樣品溶液的配制

11種手性化合物均由兩種構(gòu)型的對(duì)映體混合而得,溶解在甲醇溶液中,質(zhì)量濃度約為1～3 g/L。

2結(jié)果與討論

2.1i-chiral 6系列手性柱手性識(shí)別能力的互補(bǔ)性

i-chiral 6系列手性柱是在硅膠載體上鍵合了一系列結(jié)構(gòu)非常相似的多糖衍生物[11]。其中,IA、ID、IE、IF屬于直鏈淀粉衍生物,IB、IC屬于纖維素衍生物。因而這6種手性柱既相似又有區(qū)別。表1中列出了11種手性化合物在6支不同的手性柱上的手性識(shí)別結(jié)果。可以看出,這6支手性柱對(duì)11種化合物的識(shí)別能力如下:IA可以識(shí)別其中的10個(gè),IB識(shí)別5個(gè),IC識(shí)別7個(gè),ID識(shí)別9個(gè),IE識(shí)別8個(gè),IF識(shí)別8個(gè)。需要說明的是,表中所統(tǒng)計(jì)的結(jié)果僅僅是根據(jù)化合物在柱子上有無選擇性來判斷,并不能顯示其手性識(shí)別的強(qiáng)弱與分離的程度;并且流動(dòng)相也不一樣,包含了甲醇、乙醇、異丙醇從10%～30%(v/v)多種色譜條件下的分離結(jié)果。從化合物方面看,化合物2、4、5、7在6支柱子上均能被識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)中,雖然樣本數(shù)偏少,并不非常具有代表性,但也基本上可以說明這6支手性柱在SFC模式下的共性與個(gè)性,對(duì)大部分手性化合物往往具有較好的手性識(shí)別互補(bǔ)性。

表 1　11個(gè)手性化合物在i-chiral 6系列柱上的手性識(shí)別結(jié)果

√: with chiral recognition;×: without chiral recognition. Modifiers: 10%, 20% or 30% (v/v) alcohol (methanol, ethanol or 2-propanol).

2.2不同改性劑對(duì)手性分離的影響

由于CO2的洗脫能力較弱,要成功實(shí)現(xiàn)手性SFC分離,往往需要在CO2中添加一定量的極性改性劑,如在HPLC上常用的一些溶劑醇、乙腈等。加入改性劑的主要目的有:增加洗脫強(qiáng)度；調(diào)節(jié)樣品與手性固定相之間的選擇性與分離度;改善樣品在CO2中的溶解度等。本文考察了甲醇、乙醇、異丙醇等3種常用在SFC上的改性劑對(duì)手性分離的影響,分離結(jié)果見表2。

表2中列出了化合物1～5在IA、IC、ID、IE和IF柱上的分離結(jié)果?；衔?、2、5隨著改性劑由甲醇變?yōu)楫惐?選擇因子α與分離度Rs都減小,而化合物3、4則相反。另外,對(duì)于保留因子k的影響,只有化合物3在ID柱上是隨著由甲醇變?yōu)楫惐嫉倪^程增大,其他的化合物都表現(xiàn)為相反的規(guī)律?？梢?在SFC模式下,各種醇類改性劑對(duì)手性分離的影響并沒有非常明顯的規(guī)律,結(jié)果與待分離的樣品緊密相關(guān)。要開始新的SFC篩選,一般可以從甲醇開始嘗試,然后依次嘗試乙醇、異丙醇。

表 2　不同改性劑條件下的手性分離結(jié)果

* With 0.1% (v/v) diethylamine (DEA).

2.3改性劑的濃度對(duì)手性分離的影響

本研究中,我們分別用含10%、20%、30%(v/v)甲醇的改性劑考察化合物6～9在IA、IC、ID和IE柱上的分離,結(jié)果如表3所示。從表3中可以看出,隨著甲醇改性劑含量的增大,保留因子k1、k2,以及Rs均變小。這主要是因?yàn)楦男詣┖吭龃笠院?洗脫能力顯著增強(qiáng),因而在色譜柱上出峰時(shí)間變快,保留變小,這與正相手性HPLC保留行為基本相符。對(duì)于選擇因子,我們發(fā)現(xiàn)化合物6、7、8隨著甲醇比例的增大變化不太,但化合物9則比較明顯,當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)增加到30%時(shí),基本上不能被識(shí)別。

2.4特殊改性劑對(duì)手性分離的影響

多糖類手性固定相根據(jù)生產(chǎn)工藝主要可以分為兩大類:涂布型與鍵合型。涂布型固定相是通過物理吸附的方法將多糖高分子涂覆在多孔硅膠表面,因而不能使用那些能將多糖衍生物溶解或溶脹的溶劑作流動(dòng)相組分,如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯、四氫呋喃等,這里稱這些溶劑為特殊改性劑。新一代鍵合型i-chiral 6手性柱則可以很好地解決這一問題:HPLC的常用溶劑,只要在流動(dòng)相中是互溶的,都可用作流動(dòng)相的成分之一,這樣就大大方便了手性分離方法的建立,尤其是以制備分離為目的的方法開發(fā)時(shí),更能體現(xiàn)其調(diào)節(jié)樣品溶解度與分離度的優(yōu)勢(shì)[8]。在SFC模式下,同樣也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要使用這些特殊改性劑來優(yōu)化手性分離,得到滿意的分離結(jié)果。

表 3　添加甲醇條件下的手性分離結(jié)果

* With 0.1% (v/v) DEA.

圖3　化合物11在IC與IE手性柱上的分離譜圖Fig. 3　Chromatograms of compound 11 on chiral columns IC and IE　Modifiers: (a) 30% (v/v) 2-propanol+0.1% (v/v) DEA; (b) 30% (v/v) Co-solvent with 0.1% (v/v) DEA. Co-solvent: the mixture of 2-propanol and dichloromethane (1∶1, v/v).

如圖3所示,我們比較了IC、IE兩支手性柱分離化合物11的結(jié)果,分別用異丙醇或異丙醇與二氯甲烷混合物作為改性劑?？梢钥闯?當(dāng)添加二氯甲烷為改性劑時(shí),不僅改善了選擇因子,同時(shí)也提高了分離度,達(dá)到了優(yōu)化分離的目的。

另外,在SFC模式中,有一點(diǎn)不太確定的就是樣品在CO2中的溶解度。目前為止還沒有很好的方法可以測(cè)定待分離樣品在CO2中的溶解度。這也是SFC和HPLC的一個(gè)顯著的區(qū)別。一般來說,樣品溶于改性劑之后與CO2混合,然后進(jìn)入色譜柱。如果樣品在改性劑中的溶解度比較好,也許不會(huì)遇到任何問題。但如果樣品在改性劑中的溶解度比較小,甚至微溶,那么就要特別注意了。因?yàn)镃O2可能是助溶劑,也可能相反。前者對(duì)分離有利,后者則可能會(huì)出現(xiàn)樣品在CO2中析出,導(dǎo)致手性柱柱壓升高,出峰怪異,甚至樣品結(jié)晶吸附在手性固定相上不被洗脫等現(xiàn)象。尤其是當(dāng)SFC用于手性制備分離時(shí),溶解度的因素尤其要引起重視。而加入特殊改性劑,往往可以改善樣品的溶解度。

2.5堿性添加劑對(duì)手性分離的影響

在正相手性HPLC分離模式中,對(duì)于酸性、堿性手性樣品一般都需要在流動(dòng)相中添加微量的有機(jī)酸或堿,才能確保酸、堿化合物的有效分離。SFC條件下一般也需要遵循這個(gè)規(guī)則。只不過由于CO2本身具有一定的酸性,因而對(duì)于部分酸性不是很強(qiáng)的化合物,不必添加酸性添加劑也能實(shí)現(xiàn)良好的分離。本研究中,由于樣品的限制,只針對(duì)堿性化合物9進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。如圖4所示,在Chiralpak IE柱上,以中性的10%(v/v)甲醇作為改性劑時(shí),色譜峰拖尾,分離度很小,幾乎不能被有效分離;但添加了0.1%(v/v)的DEA時(shí),色譜分離效果得到了明顯改善。由此可見,堿性添加劑對(duì)堿性化合物的分離至關(guān)重要。

圖4　化合物9在Chiralpak IE手性柱上的色譜圖Fig. 4　Chromatograms of compound 9 on chiral column Chiralpak IE　Modifiers: (a) 10% (v/v) methanol; (b) 10% (v/v) methanol+0.1% (v/v) DEA.

3結(jié)論

11個(gè)手性化合物通過手性SFC取得了良好的分離,均可以在10 min之內(nèi)完成快速分析。11個(gè)手性化合物在i-chiral 6上的拆分結(jié)果也表明了i-chiral 6系列手性柱手性識(shí)別能力的互補(bǔ)性,為實(shí)現(xiàn)成功的手性SFC分離提供了重要的基礎(chǔ)。手性SFC中,改性劑的種類與濃度對(duì)手性SFC分離都有非常大的影響。實(shí)際分離過程中,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別考慮采用甲醇、乙醇或異丙醇為改性劑,并且調(diào)整到合適的比例來優(yōu)化手性分離結(jié)果。另外,如二氯甲烷等特殊改性劑的使用,對(duì)于某些手性化合物可以達(dá)到在i-chiral 6上分離的目的。對(duì)于堿性化合物,在改性劑中添加微量的堿性添加劑對(duì)于實(shí)現(xiàn)良好的手性分離至關(guān)重要。

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Separation of enantiomers by supercritical fluid chromatography on polysaccharide derivative-based chiral stationary phases

LI Dongyan, WU Xi, HAO Fangli, YANG Yang, CHEN Xiaoming*

(Daicel Chiral Technologies (China) Co. Ltd., Shanghai 200131, China)

Abstract:Eleven kinds of chiral compounds have been well separated within 10 min on polysaccharide derivative-based chiral stationary phases named Chiralpak IA, IB, IC, ID, IE and IF by supercritical fluid chromatography (SFC). The chiral recognition of these chiral compounds has demonstrated good complementary enantioselectivities of the six chiral columns, which were proved to be useful for chiral SFC. Both the elution time and enantioselectivies could be significantly affected by the modifier types and their concentrations, such as methanol, ethanol and isopropanol, which should be optimized during the experiments. In addition, the solvent versatility of the immobilized chiral stationary phase on the optimization of the chiral separation was helpful.

Key words:supercritical fluid chromatography (SFC); chiral separation; chiral stationary phase; polysaccharide derivatives

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10039

*收稿日期:2015-10-26

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)01-0080-05

色譜手性分離專刊·研究論文

*通訊聯(lián)系人.E-mail:chen_xiaoming@dctc.daicel.com.