李冬艷,　吳　錫,　郝芳麗,　楊　洋,　陳小明

(大賽璐藥物手性技術(上海)有限公司, 上海 200131)

?

多糖類手性固定相超臨界流體色譜法分離手性化合物

李冬艷,吳錫,郝芳麗,楊洋,陳小明*

(大賽璐藥物手性技術(上海)有限公司, 上海 200131)

摘要:采用超臨界流體色譜法(SFC),在多糖固定相Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE和IF上成功拆分了11種手性化合物。分離結果表明,這6支手性色譜柱對這些手性化合物具有良好的手性識別互補性,均可以在10 min之內得到良好的分離結果,具有較好的實用性。改性劑甲醇、乙醇和異丙醇對手性化合物的保留時間以及手性選擇性均具有良好的調節(jié)作用,需要根據(jù)不同手性物質在手性柱上的分離情況加以區(qū)別,選擇使用,并調節(jié)改性劑至合適的比例。針對鍵合型固定相溶劑通用性的特征,特殊改性劑的應用也有助于優(yōu)化手性分離。

關鍵詞:超臨界流體色譜法;手性分離;手性固定相;多糖衍生物

近十多年來,超臨界流體色譜(SFC)發(fā)展迅速,成為繼GC與HPLC之后發(fā)展起來的又一項重要的色譜分離技術。尤其是在手性分離與分析領域,因其分析速度快、分離效率高、溶劑消耗少等優(yōu)點,已經成為手性色譜法中不可或缺的重要分離技術之一[1,2],與HPLC、GC相互補充,特別適用于手性分離制備[3]。另一方面,可以用在SFC上配套使用的手性柱或手性填料也多種多樣,使得手性分離的成功率極高,極大地推動了手性SFC的發(fā)展。目前,多糖類衍生物手性固定相,因其廣泛的手性識別能力、良好的穩(wěn)定性、耐用性、高負荷等優(yōu)點,無論是用于手性分析,還是手性色譜制備,都是HPLC中使用最為廣泛的手性固定相[4-6],由于該類固定相主要用于在正相流動相條件下實現(xiàn)手性分離,因此也非常適合于手性SFC分離[7]。國內也有一些SFC用于手性藥物分離的文獻綜述[8,9];金薇等[10]報道采用SFC分離了左乙拉西坦及其右旋異構體。

本文以鍵合型多糖系列柱i-chiral 6: Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE、IF為試驗對象,嘗試在SFC模式下對11種手性化合物進行手性分離,同時探討了改性劑種類、濃度、堿性添加劑以及特殊改性劑對SFC手性分離的影響。

1實驗部分

1.1儀器、試藥與材料

超臨界流體色譜儀(日本Jasco公司); 11個手性化合物樣品均由本公司自主開發(fā),其分子結構式如圖1所示;i-chiral 6系列手性柱(日本Daicel公司): Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE與IF(150 mm×4.6 mm, 5 μm),分別在硅膠載體上化學鍵合了系列多糖衍生物而得,各手性固定相的名稱與結構式如圖2所示。

CO2為上海空氣化工公司提供,化學純度99.99%,其他溶劑均為色譜純。

圖1　11個手性化合物的分子結構式Fig. 1　Molecular structures of the 11 chiral compounds

圖2　i-chiral 6系列手性固定相的分子結構式Fig. 2　Molecular structures of the chiral stationary phases on i-chiral 6　IA: amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate); IB: cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate); IC: cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate); ID: amylose tris(3-chlorophenylcarbamate); IE: amylose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate); IF: amylose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate).

1.2超臨界色譜條件

除非特別說明,色譜條件均為:流速2 mL/min;背壓10 MPa;檢測波長220 nm(化合物6為203 nm)。

色譜柱死時間由1,3,5-三叔丁基苯在相同的色譜條件下分別進樣測定。

1.3手性樣品溶液的配制

11種手性化合物均由兩種構型的對映體混合而得,溶解在甲醇溶液中,質量濃度約為1～3 g/L。

2結果與討論

2.1i-chiral 6系列手性柱手性識別能力的互補性

i-chiral 6系列手性柱是在硅膠載體上鍵合了一系列結構非常相似的多糖衍生物[11]。其中,IA、ID、IE、IF屬于直鏈淀粉衍生物,IB、IC屬于纖維素衍生物。因而這6種手性柱既相似又有區(qū)別。表1中列出了11種手性化合物在6支不同的手性柱上的手性識別結果?？梢钥闯?這6支手性柱對11種化合物的識別能力如下:IA可以識別其中的10個,IB識別5個,IC識別7個,ID識別9個,IE識別8個,IF識別8個。需要說明的是,表中所統(tǒng)計的結果僅僅是根據(jù)化合物在柱子上有無選擇性來判斷,并不能顯示其手性識別的強弱與分離的程度;并且流動相也不一樣,包含了甲醇、乙醇、異丙醇從10%～30%(v/v)多種色譜條件下的分離結果。從化合物方面看,化合物2、4、5、7在6支柱子上均能被識別。本實驗中,雖然樣本數(shù)偏少,并不非常具有代表性,但也基本上可以說明這6支手性柱在SFC模式下的共性與個性,對大部分手性化合物往往具有較好的手性識別互補性。

表 1　11個手性化合物在i-chiral 6系列柱上的手性識別結果

√: with chiral recognition;×: without chiral recognition. Modifiers: 10%, 20% or 30% (v/v) alcohol (methanol, ethanol or 2-propanol).

2.2不同改性劑對手性分離的影響

由于CO2的洗脫能力較弱,要成功實現(xiàn)手性SFC分離,往往需要在CO2中添加一定量的極性改性劑,如在HPLC上常用的一些溶劑醇、乙腈等。加入改性劑的主要目的有:增加洗脫強度；調節(jié)樣品與手性固定相之間的選擇性與分離度;改善樣品在CO2中的溶解度等。本文考察了甲醇、乙醇、異丙醇等3種常用在SFC上的改性劑對手性分離的影響,分離結果見表2。

表2中列出了化合物1～5在IA、IC、ID、IE和IF柱上的分離結果?；衔?、2、5隨著改性劑由甲醇變?yōu)楫惐?選擇因子α與分離度Rs都減小,而化合物3、4則相反。另外,對于保留因子k的影響,只有化合物3在ID柱上是隨著由甲醇變?yōu)楫惐嫉倪^程增大,其他的化合物都表現(xiàn)為相反的規(guī)律?？梢?在SFC模式下,各種醇類改性劑對手性分離的影響并沒有非常明顯的規(guī)律,結果與待分離的樣品緊密相關。要開始新的SFC篩選,一般可以從甲醇開始嘗試,然后依次嘗試乙醇、異丙醇。

表 2　不同改性劑條件下的手性分離結果

* With 0.1% (v/v) diethylamine (DEA).

2.3改性劑的濃度對手性分離的影響

本研究中,我們分別用含10%、20%、30%(v/v)甲醇的改性劑考察化合物6～9在IA、IC、ID和IE柱上的分離,結果如表3所示。從表3中可以看出,隨著甲醇改性劑含量的增大,保留因子k1、k2,以及Rs均變小。這主要是因為改性劑含量增大以后,洗脫能力顯著增強,因而在色譜柱上出峰時間變快,保留變小,這與正相手性HPLC保留行為基本相符。對于選擇因子,我們發(fā)現(xiàn)化合物6、7、8隨著甲醇比例的增大變化不太,但化合物9則比較明顯,當甲醇體積分數(shù)增加到30%時,基本上不能被識別。

2.4特殊改性劑對手性分離的影響

多糖類手性固定相根據(jù)生產工藝主要可以分為兩大類:涂布型與鍵合型。涂布型固定相是通過物理吸附的方法將多糖高分子涂覆在多孔硅膠表面,因而不能使用那些能將多糖衍生物溶解或溶脹的溶劑作流動相組分,如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯、四氫呋喃等,這里稱這些溶劑為特殊改性劑。新一代鍵合型i-chiral 6手性柱則可以很好地解決這一問題:HPLC的常用溶劑,只要在流動相中是互溶的,都可用作流動相的成分之一,這樣就大大方便了手性分離方法的建立,尤其是以制備分離為目的的方法開發(fā)時,更能體現(xiàn)其調節(jié)樣品溶解度與分離度的優(yōu)勢[8]。在SFC模式下,同樣也可以根據(jù)實驗的需要使用這些特殊改性劑來優(yōu)化手性分離,得到滿意的分離結果。

表 3　添加甲醇條件下的手性分離結果

* With 0.1% (v/v) DEA.

圖3　化合物11在IC與IE手性柱上的分離譜圖Fig. 3　Chromatograms of compound 11 on chiral columns IC and IE　Modifiers: (a) 30% (v/v) 2-propanol+0.1% (v/v) DEA; (b) 30% (v/v) Co-solvent with 0.1% (v/v) DEA. Co-solvent: the mixture of 2-propanol and dichloromethane (1∶1, v/v).

如圖3所示,我們比較了IC、IE兩支手性柱分離化合物11的結果,分別用異丙醇或異丙醇與二氯甲烷混合物作為改性劑?？梢钥闯?當添加二氯甲烷為改性劑時,不僅改善了選擇因子,同時也提高了分離度,達到了優(yōu)化分離的目的。

另外,在SFC模式中,有一點不太確定的就是樣品在CO2中的溶解度。目前為止還沒有很好的方法可以測定待分離樣品在CO2中的溶解度。這也是SFC和HPLC的一個顯著的區(qū)別。一般來說,樣品溶于改性劑之后與CO2混合,然后進入色譜柱。如果樣品在改性劑中的溶解度比較好,也許不會遇到任何問題。但如果樣品在改性劑中的溶解度比較小,甚至微溶,那么就要特別注意了。因為CO2可能是助溶劑,也可能相反。前者對分離有利,后者則可能會出現(xiàn)樣品在CO2中析出,導致手性柱柱壓升高,出峰怪異,甚至樣品結晶吸附在手性固定相上不被洗脫等現(xiàn)象。尤其是當SFC用于手性制備分離時,溶解度的因素尤其要引起重視。而加入特殊改性劑,往往可以改善樣品的溶解度。

2.5堿性添加劑對手性分離的影響

在正相手性HPLC分離模式中,對于酸性、堿性手性樣品一般都需要在流動相中添加微量的有機酸或堿,才能確保酸、堿化合物的有效分離。SFC條件下一般也需要遵循這個規(guī)則。只不過由于CO2本身具有一定的酸性,因而對于部分酸性不是很強的化合物,不必添加酸性添加劑也能實現(xiàn)良好的分離。本研究中,由于樣品的限制,只針對堿性化合物9進行了對比試驗。如圖4所示,在Chiralpak IE柱上,以中性的10%(v/v)甲醇作為改性劑時,色譜峰拖尾,分離度很小,幾乎不能被有效分離;但添加了0.1%(v/v)的DEA時,色譜分離效果得到了明顯改善。由此可見,堿性添加劑對堿性化合物的分離至關重要。

圖4　化合物9在Chiralpak IE手性柱上的色譜圖Fig. 4　Chromatograms of compound 9 on chiral column Chiralpak IE　Modifiers: (a) 10% (v/v) methanol; (b) 10% (v/v) methanol+0.1% (v/v) DEA.

3結論

11個手性化合物通過手性SFC取得了良好的分離,均可以在10 min之內完成快速分析。11個手性化合物在i-chiral 6上的拆分結果也表明了i-chiral 6系列手性柱手性識別能力的互補性,為實現(xiàn)成功的手性SFC分離提供了重要的基礎。手性SFC中,改性劑的種類與濃度對手性SFC分離都有非常大的影響。實際分離過程中,可以根據(jù)實驗需要分別考慮采用甲醇、乙醇或異丙醇為改性劑,并且調整到合適的比例來優(yōu)化手性分離結果。另外,如二氯甲烷等特殊改性劑的使用,對于某些手性化合物可以達到在i-chiral 6上分離的目的。對于堿性化合物,在改性劑中添加微量的堿性添加劑對于實現(xiàn)良好的手性分離至關重要。

參考文獻:

[1]Terfloth G. J Chromatogr A, 2001, 906: 301

[2]Ward T J, Ward K D. Anal Chem, 2012, 84: 626

[3]Miller L. J Chromatogr A, 2012, 1250: 250

[4]Okamoto Y, Yashima E. Angew Chem Int Ed, 1998, 37: 1020

[5]Yashima E. J Chromatogr A, 2001, 906: 105

[6]Francotte E. J Chromatogr A, 2001, 906: 379

[7]Lee J, Lee J T, Watts W L, et al. J Chromatogr A, 2014, 1374: 238

[8]Ren Q L, Su B G, Huang M, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2000, 28(6): 772

任其龍, 蘇寶根, 黃梅, 等. 分析化學, 2000, 28(6): 772

[9]Wu J, Feng F. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2004, 28(7): 300

武潔, 馮芳. 藥學進展, 2004, 28(7): 300

[10]Jin W, Yang X L, Lu D, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2013, 33(5): 822

金薇, 楊新磊, 陸丹, 等. 藥物分析雜志, 2013, 33(5): 822

[11]Zhang T, Franco P, Nguyen D, et al. J Chromatogr A, 2012, 1269: 178

Separation of enantiomers by supercritical fluid chromatography on polysaccharide derivative-based chiral stationary phases

LI Dongyan, WU Xi, HAO Fangli, YANG Yang, CHEN Xiaoming*

(Daicel Chiral Technologies (China) Co. Ltd., Shanghai 200131, China)

Abstract:Eleven kinds of chiral compounds have been well separated within 10 min on polysaccharide derivative-based chiral stationary phases named Chiralpak IA, IB, IC, ID, IE and IF by supercritical fluid chromatography (SFC). The chiral recognition of these chiral compounds has demonstrated good complementary enantioselectivities of the six chiral columns, which were proved to be useful for chiral SFC. Both the elution time and enantioselectivies could be significantly affected by the modifier types and their concentrations, such as methanol, ethanol and isopropanol, which should be optimized during the experiments. In addition, the solvent versatility of the immobilized chiral stationary phase on the optimization of the chiral separation was helpful.

Key words:supercritical fluid chromatography (SFC); chiral separation; chiral stationary phase; polysaccharide derivatives

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10039

*收稿日期:2015-10-26

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)01-0080-05

色譜手性分離?？ぱ芯空撐?/p>

*通訊聯(lián)系人.E-mail:chen_xiaoming@dctc.daicel.com.