吳海霞,　王東強(qiáng),　趙見超,　柯燕雄*,　梁鑫淼,2

(1. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200237; 2. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

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奎寧-冠醚組合型手性固定相直接拆分氨基酸的機(jī)理

吳海霞1,王東強(qiáng)1,趙見超1,柯燕雄1*,梁鑫淼1,2

(1. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200237; 2. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

摘要:合成了一種新型奎寧-冠醚組合型手性固定相(QN-CR CSP)并用于氨基酸手性對(duì)映體的直接拆分,該固定相對(duì)12種氨基酸對(duì)映體有良好的手性拆分能力。基于氨基酸手性識(shí)別中離子交換和絡(luò)合的協(xié)同作用,建立了一種新型的等溫吸附模型。通過迎頭特殊點(diǎn)洗脫法(FACP)測(cè)定色氨酸(Trp)在不同金屬離子添加劑條件下的等溫吸附線,驗(yàn)證了模型的合理性。流動(dòng)相中的Li+、Na+、K+等金屬離子與氨基酸競(jìng)爭(zhēng)固定相中的冠醚絡(luò)合位點(diǎn),隨著金屬離子與冠醚的絡(luò)合作用力和絡(luò)合吸附平衡常數(shù)增大,固定相對(duì)Trp的手性拆分能力下降。該模型的建立對(duì)理解氨基酸在此類固定相中的手性保留行為以及固定相結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)化具有重要意義。

關(guān)鍵詞:手性固定相;奎寧;冠醚;離子交換;絡(luò)合;等溫吸附線;氨基酸;手性拆分

蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床診斷和食品分析等領(lǐng)域均涉及氨基酸的手性分析與拆分。氨基酸的拆分方法包括化學(xué)拆分法、色譜拆分法、酶拆分法和誘導(dǎo)結(jié)晶法等,其中色譜法因高效、可靠、精確而得到廣泛應(yīng)用[1]?；诓煌中宰R(shí)別機(jī)理的手性固定相相繼被研制出來,如涂覆、化學(xué)鍵合手性配體[2]以及手性冠醚[3-6]等,這些手性固定相對(duì)氨基酸具有不同的手性識(shí)別機(jī)理,例如通過奎寧的離子交換作用[7-9]和冠醚的絡(luò)合作用[3-6]對(duì)氨基酸進(jìn)行手性拆分。本課題組制備了奎寧-冠醚組合型手性固定相[10],固定相與氨基酸的作用模式如圖1所示。通過離子交換和絡(luò)合的協(xié)同作用,對(duì)氨基酸的手性對(duì)映體有良好的拆分能力。

圖1　奎寧-冠醚組合型手性固定相與氨基酸的作用模式Fig. 1　Action model between chiral stationary phase combined with quinine and crown ether and amino acids

1998年,Fornstedt等[11]通過測(cè)定手性對(duì)映體在固定相上的等溫吸附線證實(shí)了手性固定相表面是不均勻的。多數(shù)鍵合型手性固定相表面的作用位點(diǎn)可分為手性作用位點(diǎn)和非手性作用位點(diǎn)[12,13],手性作用位點(diǎn)主要影響化合物的選擇性。通過測(cè)定手性對(duì)映體在固定相表面的等溫吸附線,分析了其在固定相表面的吸附行為,這對(duì)揭示手性拆分機(jī)理以及固定相結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)化具有重要的意義,該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于手性固定相的研究領(lǐng)域[14-16]。

理想色譜模型下,譜帶的遷移方程如下:

(1)

公式(1)中,C為流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度,q為溶質(zhì)在固定相中的平衡濃度,F為相比,u為流動(dòng)相的線速度,t為時(shí)間變量,z為軸向位置變量。

矩形濃度進(jìn)樣[15]時(shí),吸附容量的計(jì)算公式為:

(2)

其中C為樣品在流動(dòng)相中的濃度,V0為死體積,Vp為進(jìn)樣體積,Va為色譜柱中固定相的體積,VR(C)為濃度為C時(shí)的洗脫體積,q(C)為濃度為C時(shí)固定相的吸附容量。

通過測(cè)定不同濃度下樣品在固定相中的吸附容量,可以獲得樣品的等溫吸附線。目前測(cè)定等溫吸附線的方法主要有迎頭分析(FA)法、特殊點(diǎn)洗脫(ECP)法和迎頭特殊點(diǎn)洗脫(FACP)法[17]。其中FACP法相對(duì)簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度較高,因此本文采用FACP法測(cè)定Trp在奎寧-冠醚組合型固定相上的等溫吸附線,建立了Trp的等溫吸附模型,并對(duì)Trp在固定相上的手性拆分機(jī)理進(jìn)行了研究。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀配備515型HPLC泵、1500型柱溫箱和2996型紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司); KH5200B型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)。

氨基酸(純度>95%)、甲酸(FA)、二乙胺(DEA)、高氯酸鋰(LiClO4)、奎寧(QN)和三乙胺(TEA)均購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司;甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)、4-硝基苯基氯甲酸酯和γ-巰丙基三甲氧基硅烷購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;氫氧化鋰(LiOH5H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)和硼氫化鈉(NaBH4)均購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;球形硅膠(粒徑為5 μm,比表面積為300 m2/g)由華譜新創(chuàng)科技有限公司提供;3′-苯并十八冠-6-醚、活化奎寧[10]和(1S,2S)-2-氨基環(huán)己基苯基氨基甲酸酯[18]根據(jù)文獻(xiàn)合成;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2奎寧-冠醚組合型手性固定相(QN-CR CSP)的制備

QN-CR CSP的合成過程如下:3′-苯并十八冠-6-醚(C-1)與(1S,2S)-2-氨基環(huán)己基苯基氨基甲酸酯經(jīng)縮合反應(yīng)得到席夫堿,其經(jīng)硼氫化鈉還原得C-2。將C-2經(jīng)氯乙?；桶彼苯夥磻?yīng)得C-3,其與4-硝基苯基氯甲酸酯活化的奎寧C-4反應(yīng)制得選擇器C-5。選擇器C-5與γ-巰丙基三乙氧基硅烷修飾的硅膠經(jīng)自由基加成反應(yīng)得固定相QN-CR CSP。最后將其置于20 mL乙醇中勻漿,以乙醇為頂替液在50 MPa下填裝于不銹鋼柱管(150 mm×4.6 mm)中。合成路線見圖2。

1.3等溫吸附線的測(cè)定

色譜條件:流動(dòng)相為80%(體積分?jǐn)?shù))MeOH-120 mmol/L FA-60 mmol/L MOH(MOH中的M代表不同的陽(yáng)離子,分別為L(zhǎng)i、Na和K);流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254和305 nm;色譜柱為QN-CR CSP(150 mm×4.6 mm, 150 μm);柱溫為30 ℃。用1,3,5-三叔丁基苯測(cè)定死時(shí)間為2.21 min。

采用FACP法測(cè)定氨基酸的等溫吸附線,實(shí)驗(yàn)配置的定量環(huán)為5 mL。為保證進(jìn)樣濃度分布接近矩形濃度,采用截點(diǎn)進(jìn)樣(cut up injection)的方式進(jìn)樣[19],進(jìn)樣時(shí)間為3.5 min。

圖2　QN-CR CSP的合成路線Fig. 2　Synthesis route of QN-CR CSP

Analytek1αRsEOMpAnalytek1αRsEOMpPhg3.981.312.04DAPhe1.781.401.91DATrp2.591.943.65DBTyr1.501.903.84DBVal1.931.802.87DAIle2.551.211.46DASer2.871.422.44n.d.CThr3.361.171.06n.d.C3.761.11<0.5DC6.061.04<0.5DA

k1: retention factor;α: selectivity factor;Rs: resolution; EO: first configuration enantiomer peak; n. d.: not determined; Mp: mobile phase; A: MeOH (methanol)-FA (formic acid)-DEA (diethylamine) (100∶0.1∶0.1, v/v/v); B: MeOH-25 mmol/L FA-12.5 mmol/L TEA (triethylamine); C: 90% (v/v) ACN (acetonitrile)-5 mmol/L LiClO4.

2結(jié)果與討論

2.1手性固定相的表征

手性選擇器C-5的1H-NMR(CDCl3) (δ值)數(shù)據(jù):1.25(t,3H),1.46～1.48(t,2H),1.60(s,1H),1.71(s,2H),1.84(s,1H),2.03(s,2H),2.11(s,2H),2.27(s,2H),3.00(d,1H),3.38(t,1H),3.59(s,2H),3.65(s,7H),3.73(s,4H),3.88～3.93(m,6H),4.11～4.16(m,6H),4.29(s,2H),4.41(d,1H),4.61(s,1H),4.76(d,1H),4.90～4.95(t,2H),5.42(s,1H),6.63(d,1H),6.78(d,1H),6.89～6.96(t,2H),7.21(t,2H),7.35～7.44(m,6H),7.89(s,1H),8.10(d,1H),8.28(s,1H),8.72(s,1H)。

2.2氨基酸手性對(duì)映體的分離

選取系列氨基酸對(duì)映體為分析物對(duì)QN-CR CSP的手性拆分性能進(jìn)行評(píng)價(jià),其中12個(gè)氨基酸能夠得到拆分(見表1),在該固定相上,D-型氨基酸在色譜柱中首先被洗脫。色譜柱對(duì)Trp和Tyr的手性拆分能力尤為出色(見圖3),手性選擇因子(α)分別為1.94和1.90。

2.3陽(yáng)離子對(duì)手性選擇性的影響

固定相結(jié)構(gòu)中的18冠-6基團(tuán)對(duì)Li+、Na+和K+等陽(yáng)離子產(chǎn)生絡(luò)合作用[20,21],本文通過在流動(dòng)相中添加不同的陽(yáng)離子,考察了Trp在不同陽(yáng)離子存在條件下的保留情況和手性選擇性,結(jié)果見圖4。隨Li+、Na+和K+半徑依次增加,Trp的保留時(shí)間變短,手性選擇性下降。流動(dòng)相中的金屬離子與Trp中的氨基競(jìng)爭(zhēng)冠醚的絡(luò)合位點(diǎn),其中K+與18冠-6的絡(luò)合能力最強(qiáng),固定相對(duì)Trp的保留和手性選擇性下降最明顯。

圖3　Trp和Tyr的手性分離Fig. 3　Enantioseparations of Trp and Tyr

圖4　Trp在不同陽(yáng)離子條件下的分離Fig. 4　Separations of Trp with different cationic additives

2.4Trp的吸附等溫線

2.4.1氨基酸在QN-CR CSP上的吸附模型

對(duì)氨基酸而言,QN-CR CSP結(jié)構(gòu)中存在兩種主要的活性吸附位點(diǎn):離子交換位點(diǎn)(A)和冠醚的絡(luò)合作用位點(diǎn)(B)。氨基酸的羧基和離子交換位點(diǎn)產(chǎn)生離子交換作用,氨基與冠醚產(chǎn)生絡(luò)合作用。流動(dòng)相中的陰離子(FA-)和氨基酸競(jìng)爭(zhēng)與奎寧發(fā)生離子交換作用,金屬離子M(M為L(zhǎng)i+、Na+或K+)和氨基酸競(jìng)爭(zhēng)與冠醚發(fā)生絡(luò)合作用。

在推導(dǎo)等溫吸附方程時(shí),做了如下假定:假定1.如果氨基酸的氨基與絡(luò)合位點(diǎn)相互作用,且離子交換位點(diǎn)和絡(luò)合作用位點(diǎn)的距離足夠近,其羧基會(huì)同時(shí)與離子交換位點(diǎn)發(fā)生靜電相互作用,所產(chǎn)生的吸附模式為AB-X,其中X代表氨基酸分子。假定2.金屬離子能夠與冠醚發(fā)生絡(luò)合作用,如果冠醚絡(luò)合位點(diǎn)被金屬離子所占據(jù),被金屬離子占據(jù)的位點(diǎn)會(huì)形成新的離子交換位點(diǎn),對(duì)氨基酸產(chǎn)生吸附作用,因此隨著流動(dòng)相中金屬離子的種類和濃度的變化,固定相中的離子交換位點(diǎn)的總量也隨著變化。假定3.氨基酸在流動(dòng)相中的濃度足夠小,氨基酸分子之間的相互作用不予考慮。

根據(jù)上述假設(shè),可以算出絡(luò)合交換和離子交換產(chǎn)生的吸附容量。具體的推導(dǎo)過程如下。

(1)絡(luò)合交換:

(3)

公式(3)中的KM為金屬離子與冠醚的絡(luò)合吸附平衡常數(shù)。

(4)

公式(4)中的K1為氨基酸與冠醚的絡(luò)合吸附平衡常數(shù)。

考慮金屬離子與氨基酸的絡(luò)合競(jìng)爭(zhēng)吸附,通過絡(luò)合和靜電相互協(xié)同作用(AB-X)產(chǎn)生的氨基酸吸附容量qCR[22]為:

(5)

公式(5)中的q1為固定相中冠醚的飽和絡(luò)合吸附容量。

(2)離子交換:

(6)

公式(6)中的K2為氨基酸與離子交換位點(diǎn)的平衡常數(shù)。

(7)

公式(7)中的KFA為FA-與奎寧的離子交換平衡常數(shù)。

考慮氨基酸與溶液中陰離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附,由離子交換產(chǎn)生的吸附容量qex為:

(8)

公式(8)中的q2為固定相中離子交換飽和吸附容量。

氨基酸的總吸附容量q為:

(9)

在一定的流動(dòng)相條件下,金屬離子的濃度(cM)和甲酸根離子的濃度(cFA)是固定的,上式可以改寫為如下形式:

(10)

圖5　(a)滿環(huán)進(jìn)樣和截點(diǎn)進(jìn)樣色譜峰對(duì)比圖和(b)吸光度對(duì)濃度校正曲線圖Fig. 5　(a) Comparison of the chromatographic peaks of the full-loop injection and the cut up injection and (b) the absorbance-concentration calibration curve

圖6　不同陽(yáng)離子條件下Trp的等溫吸附線實(shí)驗(yàn)點(diǎn)及非線性擬合線Fig. 6　Experimental points of Trp’s adsorptions isotherms and the nonlinear fitting lines with different cationic additives

該方程與Bi-Langmuir等溫吸附線[17]形式類似,公式(10)中K3和K4分別為與金屬離子絡(luò)合平衡和甲酸根離子交換平衡相關(guān)常數(shù),K3=1+KMcM,K4=1+KFAcFA。在流動(dòng)相中金屬離子濃度相同的條件下,對(duì)于Li+、Na+和K+應(yīng)有K3K>K3Na>K3Li。

由于氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型不同,不同的氨基酸與固定相的離子交換和絡(luò)合交換作用會(huì)受到π-π相互作用、氫鍵和空間位阻等因素的影響,這些相互作用會(huì)影響絡(luò)合交換常數(shù)K1和離子交換常數(shù)K2的大小。

2.4.2等溫吸附線的測(cè)定

受氨基酸溶解度的限制,試驗(yàn)中使用添加不同甲酸鹽的80%(體積分?jǐn)?shù))MeOH溶液以考察在更大的濃度范圍內(nèi)Trp的吸附行為。實(shí)驗(yàn)中采用FACP方法測(cè)定等溫吸附線,該方法的準(zhǔn)確性主要取決于進(jìn)樣濃度分布是否為矩形。因此試驗(yàn)中采用了截點(diǎn)進(jìn)樣的方式,進(jìn)樣濃度分布如圖5a所示,如果將5 mL定量環(huán)中的樣品全部進(jìn)樣,在進(jìn)樣的后半部分由于擴(kuò)散作用,進(jìn)樣濃度產(chǎn)生拖尾。如果在流速為0.8 mL/min時(shí),進(jìn)樣3.5 min后立即將進(jìn)樣閥切換到給樣位置,得到的進(jìn)樣濃度分布非常接近矩形分布。用流動(dòng)相配制0.520、1.005、2.001、4.004和4.504 mg/mL的Trp溶液,測(cè)定不同質(zhì)量濃度的Trp溶液的紫外響應(yīng)值,用二次方程對(duì)紫外響應(yīng)值(A, AU)和質(zhì)量濃度(C, mg/mL)的關(guān)系進(jìn)行擬合(見圖5b),C=0.182A2+2.362A,R2=0.999 96,n=5。將試驗(yàn)測(cè)定的FACP洗脫曲線用該方程轉(zhuǎn)換成洗脫質(zhì)量濃度C與保留時(shí)間的關(guān)系曲線,并用公式(2)計(jì)算出不同濃度下的等溫吸附容量,結(jié)果如圖6所示。

將得到的等溫吸附數(shù)據(jù)用方程(10)進(jìn)行擬合,等溫吸附方程中各個(gè)參數(shù)見表2, 在幾種不同流動(dòng)相條件下都有K1DK2L,這兩種作用對(duì)手性選擇性的貢獻(xiàn)相反,但絡(luò)合吸附平衡常數(shù)遠(yuǎn)大于離子交換平衡常數(shù),導(dǎo)致L-Trp在固定相中保留時(shí)間更長(zhǎng),說明絡(luò)合作用對(duì)固定相的手性選擇性起主要作用。據(jù)此,如能對(duì)固定相的手性結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整,使絡(luò)合交換與離子交換對(duì)Trp的手性選擇性貢獻(xiàn)一致,能進(jìn)一步提高固定相的手性選擇性。隨著Li+、Na+、K+半徑的增大,K3值增大,這是由于隨著陽(yáng)離子半徑增大,金屬離子與冠醚的絡(luò)合作用力增強(qiáng)。金屬離子與Trp競(jìng)爭(zhēng)手性絡(luò)合吸附位點(diǎn),絡(luò)合能力越強(qiáng)的金屬離子對(duì)固定相的手性選擇性影響越大,這與前面試驗(yàn)中觀察到的金屬離子對(duì)手性選擇性的影響結(jié)果一致。

表 2　不同陽(yáng)離子條件下Trp的等溫吸附參數(shù)

q1,q2,K1,K2,K3andK4are the same as in equation (10).

固定相的手性結(jié)構(gòu)對(duì)甲酸根的離子交換沒有影響,固定相與甲酸根離子交換相關(guān)的常數(shù)K4應(yīng)基本相同,在幾種流動(dòng)相條件下,模型擬合得到的甲酸根與固定相的離子交換常數(shù)非常接近,符合吸附模型的預(yù)期。D-Trp在流動(dòng)相含Li+、Na+和K+時(shí)的絡(luò)合平衡常數(shù)非常接近,L-Trp也是如此,該結(jié)果同樣符合模型的預(yù)測(cè),因?yàn)長(zhǎng)i+、Na+和K+等的競(jìng)爭(zhēng)只是影響Trp的吸附量,對(duì)Trp的吸附平衡常數(shù)影響很小。以上結(jié)果說明該吸附模型基本上能夠反映Trp在固定相上的吸附行為。

3結(jié)論

本文報(bào)道了一種奎寧-冠醚組合型手性固定相的制備,該固定相對(duì)氨基酸的手性對(duì)映體具有良好的選擇性。根據(jù)固定相的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),建立了氨基酸在固定相中的吸附模型,通過考察Li+、Na+和K+等對(duì)Trp手性選擇性以及等溫吸附線的影響,對(duì)Trp在該固定相的保留行為進(jìn)行了詳細(xì)的研究。奎寧-冠醚組合型手性固定相對(duì)氨基酸的手性分離是一個(gè)復(fù)雜的過程,固定相對(duì)Trp的手性選擇性主要來源于冠醚的絡(luò)合與奎寧的離子交換的協(xié)同作用,該結(jié)果對(duì)理解氨基酸在此類固定相中的手性保留行為及固定相結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步優(yōu)化具有重要的意義。

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Separation mechanism of chiral stationary phase based on quinine and crown ether for the direct stereoselective separation of amino acids

WU Haixia1, WANG Dongqiang1, ZHAO Jianchao1, KE Yanxiong1*, LIANG Xinmiao1,2

(1. School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;2. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)

Abstract:A novel chiral stationary phase combining quinine and crown ether (QN-CR CSP) was developed to separate amino acid enantiomers. This CSP showed good enantioselectivity for some amino acids. Since the synergistic effect of ion exchange and complexation in chiral recognition of amino acids, a new adsorption isotherm was built. Using the method of frontal analysis by characteristic point (FACP), the adsorption isotherms of tryptophan (Trp) under different mobile phase conditions were determined and fitted the proposed adsorption isotherm model well. With the increase of the competition between metal cationic and amino to crown ether, the equilibrium constant of complexing adsorption was found increased. The chiral separation ability was decreased. The adsorption isotherm improved the understanding of the retention behavior of amino acids on QN-CR CSP, which was also benefit to optimize the structure of the stationary phase.

Key words:chiral stationary phases; quinine; crown ether; ion exchange; complexation; adsorption isotherm; amino acids; chiral separation

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.07015

*收稿日期:2015-07-15

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21375038).

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)01-0062-06

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*通訊聯(lián)系人.Tel:(021)642506222,E-mail:key@ecust.edu.cn.

Foundation item: Natural Science Foundation of China (Grant No. 21375038).