吳佳茗　陳衛(wèi)昌　張海玲　張光波　陶麗華　劉　憶

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科1(215006)　蘇州大學(xué)臨床免疫研究所2

結(jié)直腸癌患者外周血PD-1的表達(dá)及其臨床意義*

吳佳茗1#陳衛(wèi)昌1&張海玲1張光波2陶麗華1劉憶1

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科1(215006)蘇州大學(xué)臨床免疫研究所2

背景：協(xié)同刺激分子的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸關(guān)系密切。程序性死亡受體-1(PD-1)是重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，與相關(guān)配體結(jié)合后可誘導(dǎo)并維持腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目的：探討結(jié)直腸癌患者外周血PD-1的表達(dá)及其臨床意義。方法：選取2015年3月—2015年9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院的88例結(jié)直腸癌患者，以16名健康志愿者作為對照。采用ELISA法檢測血清可溶性PD-1(sPD-1)含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)。結(jié)果：結(jié)直腸癌患者外周血sPD-1含量和CD3+T細(xì)胞上PD-1陽性表達(dá)率均顯著高于對照組(P<0.05)，且sPD-1含量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡和腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論：結(jié)直腸癌患者外周血PD-1高表達(dá)，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。檢測PD-1有助于估計(jì)病情的進(jìn)展，有望成為新的腫瘤標(biāo)記物或抗腫瘤靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞結(jié)直腸腫瘤；程序性死亡受體-1；酶聯(lián)免疫吸附測定；流式細(xì)胞術(shù)

Flow Cytometry

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程。該過程與機(jī)體免疫功能狀態(tài)關(guān)系密切。腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸對惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展和轉(zhuǎn)移起有非常重要的作用[1]。程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)是近年發(fā)現(xiàn)的非常重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，有研究認(rèn)為其可協(xié)同程序性死亡因子配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)通過抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答而造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[2-4]。目前研究表明，PD-1高表達(dá)與部分腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5]。但PD-1與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚不清楚。本研究通過ELISA法檢測結(jié)直腸癌患者血清PD-1含量，同時(shí)檢測CD3+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，旨在探討PD-1表達(dá)對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年3月—2015年9月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科收治的88例結(jié)直腸癌初診患者，住院前均未接受過手術(shù)或放化療或任何免疫制劑治療，并經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告證實(shí)為結(jié)直腸癌且排除轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。其中男58例，女30例；年齡35～88歲，平均(64.03±11.67)歲；<60歲者28例，≥60歲者60例；結(jié)腸癌40例，直腸癌48例；高分化10例，中分化69例，低分化9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；根據(jù)2003年修改的國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)聯(lián)合制定的改良版Dukes分期法：A期26例，B期24例，C期30例，D期8例。選取同期16名性別、年齡匹配的健康志愿者作為對照，其中男10名，女6名，年齡35～71歲，平均(56.00±12.15)歲。本研究方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得受試者知情同意。

二、主要儀器與試劑

可溶性PD-1(sPD-1) ELISA檢測試劑盒(由蘇州大學(xué)臨床免疫研究所，醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所制備[6])，COULTER Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman公司)，紅細(xì)胞裂解液(BD公司)，F(xiàn)ITC anti-human CD3抗體、PE anti-human PD-1抗體(BioLegend公司)，PBS由本實(shí)驗(yàn)室配制。

三、標(biāo)本收集

清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，分別用促凝管和肝素鈉抗凝管抽取入選者外周靜脈血4 mL，其中促凝管以3 500 r/min 離心5 min，分離血清放入無菌EP管，置于-80 ℃冰箱中為ELISA檢測sPD-1保存?zhèn)溆茫桓嗡剽c抗凝管內(nèi)外周血標(biāo)本于6 h內(nèi)完成流式細(xì)胞術(shù)檢測。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1. ELISA法檢測血清sPD-1含量：按照ELISA試劑盒說明書操作，測定各標(biāo)本中sPD-1含量，檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算sPD-1含量(pg/mL)。

2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)率：結(jié)直腸癌組和對照組各取10例患者。實(shí)驗(yàn)設(shè)3管，分別加入抗凝全血100 μL，第1管均為空白管，第2管加入FITC anti-human CD3抗體5 μL，第3管加入FITC anti-human CD3抗體和PE anti-human PD-1抗體各5 μL。4 ℃避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL；室溫避光15 min，離心 5 min，棄上清后PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。流式數(shù)據(jù)分析和圖片采集均使用FlowJo軟件。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、血清sPD-1含量

結(jié)直腸癌患者血清sPD-1含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1　結(jié)直腸癌患者和對照組血清sPD-1含量比較

二、結(jié)直腸癌患者血清sPD-1含量與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者血清sPD-1含量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)(P<0.05)，而不同性別、年齡、腫瘤部位的結(jié)直腸癌患者血清sPD-1含量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

三、外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)

結(jié)直腸癌患者外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)率為35.11%±4.25%，明顯高于對照組的18.20%±4.20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

圖2　結(jié)直腸癌患者和對照組CD3+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的流式細(xì)胞圖

臨床病理特征例數(shù)sPD-1含量P值性別 男58128.82±102.170.870 女30131.82±87.37年齡(歲) <6028140.96±116.660.146 ≥6060126.06±78.79腫瘤部位 結(jié)腸40142.48±101.490.222 直腸48121.07±83.32腫瘤分化程度 高分化1081.49±25.01<0.05 中分化69122.12±74.21 低分化9252.13±156.46淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無52100.36±30.87<0.01 有36174.76±127.80Dukes分期 A+B期5097.06±26.52<0.01 C+D期38175.20±124.30

討論

結(jié)直腸癌位列我國消化道惡性腫瘤死因的第3位， 且其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升和年輕化的趨勢[7]。因結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相對隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)往往已處于中晚期階段，故結(jié)直腸癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。

目前腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確。腫瘤抗原雖然可被宿主T細(xì)胞識別，腫瘤卻很少被清除。近年研究發(fā)現(xiàn)免疫逃逸在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前普遍認(rèn)為通過免疫逃逸，腫瘤細(xì)胞可免受防御系統(tǒng)的監(jiān)控和殺傷，并能不斷增殖[8]。效應(yīng)T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和無反應(yīng)性是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一。T細(xì)胞的有效活化除需抗原呈遞信號(第一信號)外，還需要適時(shí)、適度的獲得正性或負(fù)性協(xié)同刺激信號(第二信號)的共同作用。協(xié)同刺激信號的缺失，將造成T細(xì)胞反應(yīng)無能，甚至程序性死亡[9]。

B7/CD28家族成員為極其重要的第二信號分子。PD-1又稱CD279，屬于B7/CD28家族共刺激分子，廣泛表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞表面[10]。有研究顯示，PD-1高表達(dá)與T細(xì)胞免疫缺陷密切相關(guān)[11]。PD-1為抑制性受體，與配體PD-L1結(jié)合后可通過抑制T細(xì)胞的活化、增殖以及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)并維持T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3,12-13]。相關(guān)研究[14-16]已證實(shí)在部分腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中PD-1高表達(dá)，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)。目前以PD-1為靶點(diǎn)針對肺癌的靶向治療藥物PD-1抑制劑Nivolumab已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究階段，有望成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破[17]。

本研究通過ELISA法發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者外周血sPD-1含量較對照組明顯增高(P<0.05)，且其含量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)，即分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或Dukes C或D期者的外周血sPD-1含量明顯升高。提示sPD-1與結(jié)直腸癌的腫瘤負(fù)荷和累及范圍可能有關(guān)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者外周血CD3+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)較對照組明顯上調(diào)(P<0.01)，與目前有關(guān)PD-1作用機(jī)制的研究結(jié)果相符，即活化T細(xì)胞表面PD-1高表達(dá)，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制T細(xì)胞的正常免疫功能，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者外周血sPD-1含量和CD3+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)較健康志愿者明顯上調(diào)，且sPD-1含量與結(jié)直腸癌患者的多種臨床病理參數(shù)相關(guān)，故PD-1可能與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系，有望作為一個(gè)新的輔助診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床。但由于實(shí)驗(yàn)方法的局限，本研究尚未從分子和基因水平闡明PD-1在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，后續(xù)可采用體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察并驗(yàn)證PD-1分子對結(jié)直腸癌生物學(xué)效應(yīng)的影響，從而為以PD-1為靶點(diǎn)的免疫和基因治療提供有力的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1 Ferrone S, Whiteside TL. Tumor microenvironment and immune escape[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2007, 16 (4): 755-774, viii.

2 Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion[J]. Nat Med, 1999, 5 (12): 1365-1369.

3 Okazaki T, Honjo T. The PD-1-PD-L pathway in immunological tolerance[J]. Trends Immunol, 2006, 27 (4): 195-201.

4 Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion[J]. Nat Med, 2002, 8 (8): 793-800.

5 Konishi J, Yamazaki K, Azuma M, et al. B7-H1 expression on non-small cell lung cancer cells and its relationship with tumor-infiltrating lymphocytes and their PD-1 expression[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10 (15): 5094-5100.

6 吳海競, 陳永井, 苗瞄, 等. 可溶性PD-1酶聯(lián)檢測試劑盒的研制及其應(yīng)用[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2008, 24 (9): 825-827.

7 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61 (2): 69-90.

8 Ye Y, Zhou L, Xie X, et al. Interaction of B7-H1 on intrahepatic cholangiocarcinoma cells with PD-1 on tumor-infiltrating T cells as a mechanism of immune evasion[J]. J Surg Oncol, 2009, 100 (6): 500-504.

9 Chambers CA. The expanding world of co-stimulation: the two-signal model revisited[J]. Trends Immunol, 2001, 22 (4): 217-223.

10Nishimura H, Agata Y, Kawasaki A, et al. Developmentally regulated expression of the PD-1 protein on the surface of double-negative (CD4-CD8-) thymocytes[J]. Int Immunol, 1996, 8 (5): 773-580.

11Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J]. Annu Rev Immunol, 2008, 26: 677-704.

12劉書漫, 孟青, 張欽憲, 等. B7-H1及其受體PD-1在胃癌組織中的表達(dá)與意義[J]. 中華腫瘤雜志, 2008, 30 (3): 192-195.

13Carter L, Fouser LA, Jussif J, et al. PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2[J]. Eur J Immunol, 2002, 32 (3): 634-643.

14Sznol M, Chen L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19 (5): 1021-1034.

15李超, 汪宏, 周勇. PD-1在胃癌患者CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2011, 20 (5): 419-422.

16馬薇, 羅殿中, 陳源, 等. PD-L1和PD-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 27 (9): 1551-1554.

17Ascierto PA, Simeone E, Sznol M, et al. Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies[J]. Semin Oncol, 2010, 37 (5): 508-516.

(2015-11-03收稿；2015-12-24修回)

Expression of Peripheral Blood PD-1 and its Clinical Significance in Patients with Colorectal CancerWUJiaming1,CHENWeichang1,ZHANGHailing1,ZHANGGuangbo2,TAOLihua1,LIUYi1.1DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006);2InstituteofImmunology,SoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: chenwc_suzhou@163.com

Background: The abnormal expression of costimulatory molecules is closely related to immune escape of tumor cells. Programmed death-1 (PD-1) is an important negative costimulatory molecule, and can induce and maintain the immune tolerance of tumor cells by binding with related ligands, thus promotes the development and progress of tumor. Aims: To investigate the expression of peripheral blood PD-1 and its clinical significance in patients with colorectal cancer. Methods: Eighty-eight patients with colorectal cancer from March 2015 to September 2015 at the First Affiliated Hospital of Soochow University were enrolled, and 16 healthy volunteers were served as controls. Level of soluble PD-1 (sPD-1) was determined by ELISA. The expression of PD-l on CD3+T cells in peripheral blood was measured by flow cytometry. Results: Level of sPD-1 and expression of PD-l on CD3+T cells in peripheral blood in colorectal cancer patients were significantly higher than those in controls (P<0.05). Level of sPD-1 in colorectal cancer patients was closely related to tumor differentiation, lymph node metastasis and Dukes’ stage (P<0.05), but not related to gender, age and tumor location (P>0.05). Conclusions: Peripheral blood PD-1 is highly expressed in patients with colorectal cancer, and is positively correlated with tumor stage and metastasis. The detection of PD-1 is helpful to estimate the progress of colorectal cancer, and it may become a new tumor marker or a target for anti-tumor targeted therapy.

Key wordsColorectal Neoplasms;Programmed Death-1;Enzyme-Linked Immunosorbent Assay;

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.05.004

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(K112226512)

#Email: 20134232030@stu.suda.edu.cn

&本文通信作者，Email: chenwc_suzhou@163.com