王 楊 柳，　張 春 枝，　浦 軍 平

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034；2.張家港市華昌藥業(yè)有限公司， 江蘇 張家港　215600 )

產(chǎn)D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌HC-017的高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

王 楊 柳1，張 春 枝1，浦 軍 平2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034；2.張家港市華昌藥業(yè)有限公司， 江蘇 張家港215600 )

摘要:利用D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶可催化制備D-絲氨酸，對(duì)產(chǎn)D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌HC-017 的高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)條件為：搖床轉(zhuǎn)速230 r/min，搖瓶種子培養(yǎng)時(shí)間6 h，接種量12%，誘導(dǎo)時(shí)間在OD=14.0～16.0時(shí)，誘導(dǎo)溫度28 ℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.2 mmol/L。在最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD達(dá)到50時(shí)，可得的酶活為259.6 U/g(以濕菌體計(jì))。

關(guān)鍵詞:D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶；重組大腸桿菌；高密度培養(yǎng)；優(yōu)化

0引言

D-絲氨酸不僅是一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞介質(zhì)，還可能參與老年癡呆和精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制，可以有效改善精神分裂癥患者的陽性癥狀和認(rèn)知障礙[1-2]。D-絲氨酸很難從自然界獲得，目前的制備方法主要有物理拆分法、化學(xué)拆分法及生物拆分法[3-4]。利用重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)產(chǎn)生D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶，不僅純度和產(chǎn)率較高，而且酶促反應(yīng)專一性強(qiáng)，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義[5]。

本文通過對(duì)搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶種子培養(yǎng)時(shí)間、接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度的實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了產(chǎn)D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌HC-017的高密度培養(yǎng)條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

重組大腸桿菌HC-017，大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，氯化鈉5，瓊脂20，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌25min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌25min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油6，磷酸氫二鉀12.5，磷酸二氫鉀 2.43，消泡劑0.5，121 ℃滅菌25min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨25，酵母膏100，甘油400，消泡劑 0.5，121 ℃滅菌25min。

1.2高密度培養(yǎng)方法

1.2.1種子培養(yǎng)

一級(jí)搖瓶：挑單菌落于裝液量50mL的250mL搖瓶中37 ℃、230r/min培養(yǎng)16h。

二級(jí)搖瓶：取20mL一級(jí)種子液移入裝液量400mL的2L搖瓶中37 ℃，230r/min培養(yǎng)6h，OD不超過4.0。

1.2.2發(fā)酵罐培養(yǎng)

將二級(jí)搖瓶培養(yǎng)好的菌種接入30L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，溶氧調(diào)至100%，溫度37 ℃，流加氨水控制pH7.0～7.2，初始攪拌200r/min，通氣量270L/h，罐壓0.03MPa?？刂迫苎踉?0%左右。待OD達(dá)到14.0～16.0，溫度降至28 ℃時(shí)加入0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)，攪拌和罐壓不變，溶氧在合適范圍，繼續(xù)培養(yǎng)至OD達(dá)到50。

1.3發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.3.1最適搖床轉(zhuǎn)速

分別在170、190、210、230、250r/min的條件下，測(cè)定OD，以確定最適的搖床轉(zhuǎn)速。

1.3.2種子最佳培養(yǎng)時(shí)間

于37 ℃、230r/min培養(yǎng)菌種，每隔2h取1mL培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液的OD，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

1.3.3最適接種量

取二級(jí)搖瓶種子液分別按8%、10%、12%、14%、16%的接種量，37 ℃、230r/min搖床培養(yǎng)8h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD。

1.3.4最適誘導(dǎo)時(shí)間

分別在OD=8、10、12、14、16和18時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG濃度0.2mmol/L，溫度28 ℃，當(dāng)OD達(dá)到50時(shí)測(cè)定酶活。

1.3.5最適誘導(dǎo)溫度

在OD=15時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG濃度0.2mmol/L，分別在24、26、28、30、32 ℃下培養(yǎng)，當(dāng)OD達(dá)到50時(shí)測(cè)定酶活。

1.3.6IPTG的最適濃度

在OD=15時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mmol/L，溫度28 ℃培養(yǎng)，當(dāng)OD達(dá)到50時(shí)測(cè)定酶活。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1酶活力測(cè)定

酶活力單位的定義：在37 ℃、pH7.3～7.4，1min內(nèi)催化生成1μmolD-絲氨酸所需酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。計(jì)算公式為：

酶活(U/g)=1 000ρVn/mMt

式中：ρ為D-絲氨酸質(zhì)量濃度,mg/mL；V為最終轉(zhuǎn)化液體積，mL；n為轉(zhuǎn)化液稀釋倍數(shù)；m為濕菌體質(zhì)量，g；M為D-絲氨酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；t為時(shí)間，min。

1.4.2D-絲氨酸含量檢測(cè)

利用高效液相色譜法檢測(cè)產(chǎn)物D-絲氨酸的含量。色譜條件：色譜柱ZORBAXEclipseXDB-C8(4.6mm×150mm×5μm)；流動(dòng)相A：乙酸鈉溶液；流動(dòng)相B：甲醇。檢測(cè)條件：流動(dòng)相A、B體積比75:25，體積流量1.0mL/min，波長(zhǎng)334nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5μL。

2結(jié)果與分析

2.1搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

搖床轉(zhuǎn)速直接影響種子培養(yǎng)基中溶氧的量。不同的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)重組大腸桿菌HC-017培養(yǎng)的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，OD也隨之提高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到230r/min時(shí)，OD達(dá)到最大值。

圖1　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體培養(yǎng)的影響

2.2種子培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

搖瓶種子的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。由圖2可以看出，0～2h，菌種處于生長(zhǎng)的延滯期；2～10h，菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；10～16h，菌體生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。當(dāng)培養(yǎng)至6h時(shí)，菌種達(dá)到一定數(shù)量，且菌體生長(zhǎng)繁殖能力較旺盛，因此種子的最佳培養(yǎng)時(shí)間為6h。

圖2　搖瓶種子的生長(zhǎng)曲線

2.3接種量的優(yōu)化

接種量過大，菌體會(huì)生長(zhǎng)過快，會(huì)使發(fā)酵液黏度增加，引起溶氧不足；接種量過小，會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率[6]。不同接種量對(duì)菌體密度的影響如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)接種量為12%時(shí)，發(fā)酵條件最佳。

圖3　接種量對(duì)菌體密度的影響

2.4誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

過早誘導(dǎo)會(huì)造成菌體濃度和酶產(chǎn)量偏低，同時(shí)也增加了染菌機(jī)會(huì)；誘導(dǎo)較晚雖可獲得較高的的菌體濃度，但細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的時(shí)間則較少[7]。在不同的時(shí)間誘導(dǎo)對(duì)酶活的影響如圖4所示。由圖4可以看出，當(dāng)OD在14.0～16.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，酶活力最高。

圖4　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活的影響

2.5誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

溫度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而溫度過低會(huì)使酶活受到抑制，細(xì)胞的新陳代謝活減弱[8]。不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活的影響如圖5所示，由圖5可知，最適誘導(dǎo)溫度為28 ℃。

圖5　誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活的影響

2.6IPTG濃度的優(yōu)化

不同的誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)酶活力的影響如圖6所示，由圖6可知，當(dāng)IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí)，酶活力最高。

圖6　誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)酶活的影響

3結(jié)論

產(chǎn)D-絲氨酸羥基轉(zhuǎn)移酶重組大腸桿菌HC-017高密度培養(yǎng)的最佳條件和搖床轉(zhuǎn)速230r/min，搖瓶種子培養(yǎng)6h，接種量12%，誘導(dǎo)時(shí)間在OD=14.0～16.0，誘導(dǎo)溫度28 ℃，IPTG濃度0.2mmol/L。在最佳的工藝條件下，當(dāng)OD達(dá)到50時(shí)，濕菌體的酶活為259.6U/g。

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OptimizationofhighdensitycultureofrecombinantE. coliHC-017toproduceD-serinehydroxyltransferase

WANGYangliu1,ZHANGChunzhi1,PUJunping2

( 1.SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.ZhangjiagangHuachangPharmaceuticalCompanyLimited,Zhangjiagang215600,China)

Abstract:D-serine hydroxyl transferase was used to produce D-serine, and its in high density culture of recombinant E. coli HC-017 was optimized. Its optimal culture conditions were as follows: rotation speed 230 r/min, flask seed culture 6 h, inoculum 12%, induction time with OD in the range of 14.0-16.0, induction temperature 28 ℃, IPTG concentration 0.2 mmol/L. When the OD of cell culture was 50, the enzyme activity was 259.6 U/g of wet cell.

Key words:D-serine hydroxyl transferase; recombinant E. coli; high density culture; optimization

收稿日期:2015-01-03.

基金項(xiàng)目:遼寧省高校聯(lián)合培養(yǎng)研究生項(xiàng)目(2014154)；生物技術(shù)與資源利用國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題.

作者簡(jiǎn)介:王楊柳(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

中圖分類號(hào):Q939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)03-0174-03