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        D型肉毒毒素凍干劑的試驗(yàn)

        2016-06-22 01:42:07劉生財(cái)張西云胡國元范玉霞李生慶李秀萍王亭亭李志寧劉懷新青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院青海西寧810016
        中國獸醫(yī)雜志 2016年3期
        關(guān)鍵詞:保存期保護(hù)劑

        劉生財(cái),張西云,胡國元,范玉霞,李生慶,李秀萍,王亭亭,李志寧,黃 榮,劉懷新(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧810016)

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        D型肉毒毒素凍干劑的試驗(yàn)

        劉生財(cái),張西云,胡國元,范玉霞,李生慶,李秀萍,王亭亭,李志寧,黃榮,劉懷新
        (青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧810016)

        摘要:通過保護(hù)劑的選擇及凍干試驗(yàn)研制了D型肉毒毒素新劑型-D型肉毒凍干劑。試驗(yàn)確定30%蔗糖+10%明膠作為凍干劑的保護(hù)劑;室溫(13℃~18℃)的保存期為10個(gè)月,37℃的保存期為6個(gè)月;水分含量為≤5%。同時(shí)制定了D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線。

        關(guān)鍵詞:D型肉毒毒素;保護(hù)劑;保存期;凍干曲線

        D型肉毒滅鼠劑是青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院利用該院從動物體內(nèi)分離、鑒定的D型肉毒梭菌,經(jīng)透析培養(yǎng)、除菌過濾研制的一種生物滅鼠劑,經(jīng)試驗(yàn)及使用證明,滅鼠效果良好,且具有不污染環(huán)境、無二次中毒及不傷害鼠類天敵的特點(diǎn),但存在必須低溫保存、運(yùn)輸及常溫下保存期短的弊端。

        為增加劑型,擴(kuò)大滅鼠范圍,延長常溫下的保存期,且便于運(yùn)輸、保存、使用,我們進(jìn)行了D型肉毒毒素凍干劑的試驗(yàn),并取得了較好的結(jié)果,報(bào)告于下。

        1 材料與方法

        1.1毒素的制備經(jīng)透析培養(yǎng)、離心過濾、無菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測定后,用無菌蒸餾水配制成2 000 萬MLD/mL毒素。

        1.2保護(hù)劑的制備(1)50%蔗糖;(2)30%蔗糖+ 10%明膠;(3)30%蔗糖+ 10%脫脂乳粉;(4)30%蔗糖+10%可溶淀粉。按毒素量的1/5分別配制上述保護(hù)劑,充分溶解后,高壓10磅40 min,備用。

        1.3自動灌裝機(jī)使用前經(jīng)無菌處理后,備用。

        1.4塑料瓶,硅膠塞用前清洗,晾干水分后,高壓10磅40 min備用。

        1.5凍干機(jī)日本產(chǎn)Blender冷凍機(jī)。

        1.6水分測定儀。

        1.7D型肉毒滅鼠劑凍干保護(hù)劑試驗(yàn)凍干毒素按5份毒素+1份保護(hù)劑制備。將配制好的毒素液,分裝到25 mL瓶中,每瓶裝量6 mL。冷凍室放入各樣品和對照瓶(加水6 mL),按照說明放置好各探頭,關(guān)閉冷凍室門。打開電源,調(diào)最高溫度30℃,最低溫度-30℃。啟動冷凍機(jī),先制冷到-30℃,持續(xù)3 h,然后進(jìn)行抽真空,真空度達(dá)到100 μm以上時(shí),升溫升華,直到30℃,完成一個(gè)周期。之后再重復(fù)制冷-升華全過程。(升華時(shí)從-30℃開始,制冷室溫度要達(dá)到-52℃、真空度為90~100 μm之間)。完成全部凍干需時(shí)16 h以上,待對照瓶內(nèi)水完全升華即結(jié)束。每瓶約抽2 min,真空度達(dá)300 μm時(shí),用石蠟封口。根據(jù)毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價(jià),確定毒素凍干用保護(hù)劑的成分。

        1.8D型肉毒滅鼠劑凍干試驗(yàn)(1)配毒、分與凍干:按5∶1的比例將毒素與1.2選出的保護(hù)劑充分混合,每瓶裝量為1億MLD(6 mL)、2億MLD (12 mL)、4億MLD(24 mL),置于-15℃冷庫中凍結(jié),將凍結(jié)好的毒素置于凍干機(jī)中,按凍干曲線圖進(jìn)行凍干,凍干時(shí)間為24~48 h;(2)無菌檢驗(yàn):以4億MLD/瓶為例,加水40 mL,即為1 000萬MLD/mL毒素,取普通斜面普通肉湯,加生肝塊VF 各2支,每支接種0.2 mL,37℃培養(yǎng)7 d,觀察有無細(xì)菌生長;(3)毒價(jià)測定:用體重16~18 g小鼠,靜脈注射測定毒價(jià),凍干后毒價(jià)有無變化。

        1.9殘留水分測定將本室生產(chǎn)的D型肉毒凍干劑3批次(200901、201001、201002批),其中200901批供試樣品10瓶,201001、201002批供試樣品各5瓶,采用真空干燥法,測定殘留水分含量。

        1.10保存期試驗(yàn)取D型肉毒凍干劑(0801批),毒價(jià)為2億MLD/瓶)24瓶,分別放于37℃溫箱及室溫中(13℃~18℃),每個(gè)月測毒1次,共測12個(gè)月,凍干劑用明膠緩沖液稀釋,測毒用體重18~22 g小鼠靜脈注射,記錄測毒結(jié)果。

        2 結(jié)果

        2.1D型肉毒滅鼠劑凍干保護(hù)劑的選擇

        2.1.1物理性狀凍干后取出,觀察不同配方的保護(hù)劑凍干后的性狀,蔗糖明膠的外觀最好,呈棕黃色疏松塊狀;蔗糖淀粉次之;單用蔗糖有泡狀突起;蔗糖奶粉最差。

        2.1.2溶解情況加蒸餾水于各樣瓶內(nèi),觀察瞬間溶解情況,根據(jù)溶解的快慢及完全與否依次為:蔗糖明膠-蔗糖-蔗糖淀粉-蔗糖奶粉。

        2.1.3測毒情況分別取各個(gè)配方組1瓶,加10 mL蒸餾水(使每毫升含毒素為1 000萬MLD),溶解后取1 mL毒素液用明膠緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后靜脈注射小鼠測含毒量。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

        表1 保護(hù)劑試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價(jià),確定毒素凍干用保護(hù)劑的成分為30%蔗糖+10%明膠,毒價(jià)穩(wěn)定,凍干效果良好。

        2.2D型肉毒滅鼠劑凍干試驗(yàn)

        2.2.1物理性狀為棕褐色,疏松塊狀。

        2.2.2無菌檢驗(yàn)以4億MLD/瓶為例,加水40 mL,即為1 000萬MLD/mL毒素,取普通斜面普通肉湯,加生肝塊VF各2支,每支接種0.2 mL,37℃培養(yǎng)7 d,無任何細(xì)菌生長。

        2.2.3毒價(jià)測定用16~18 g小鼠,靜脈注射測定毒價(jià),凍干后毒價(jià)未發(fā)生變化。

        按上法共凍干4批,生產(chǎn)D型肉毒凍干劑25.152萬mL,凍干情況見表2。

        表2 D型肉毒凍干劑凍干情況

        采用該凍干方法制備D型肉毒毒素凍干劑可行,達(dá)到了凍干劑企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

        2.3殘留水分測定經(jīng)3批次的殘留水分含量測定,D型肉毒凍干劑的平均殘留水分含量在

        3.45%~4.62%之間,達(dá)到了凍干劑企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中殘留水分含量在5%以內(nèi)的質(zhì)量要求。詳見表3。

        表3 D型肉毒凍干劑中殘留水分含量測定

        2.4保存期試驗(yàn)D型肉毒凍干劑室溫保存10個(gè)月毒力未發(fā)生變化,11個(gè)月后由2億MLD/瓶降至1億MLD/瓶,見表4。

        表4 D型肉毒凍干劑在室溫和37℃的保存期試驗(yàn)結(jié)果

        37℃保存6個(gè)月毒力未發(fā)生變化,7個(gè)月毒力由2億MLD/瓶降至1億MLD/瓶。

        2.5D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線圖通過凍干試驗(yàn),將隔板溫度、冷凝器溫度、產(chǎn)品溫度及真空度與時(shí)間的關(guān)系,繪制了凍干曲線圖(圖1)。

        3 討論

        3.1根據(jù)D型肉毒毒素凍干后的性狀、溶解性及毒價(jià),確定毒素凍干用保護(hù)劑的成分為30%蔗糖+ 10%明膠,毒價(jià)穩(wěn)定,凍干效果良好。

        3.2采用該凍干方法制備D型肉毒毒素凍干劑可行,凍干毒素物理性狀、無菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測定及殘留水分含量均符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

        圖1 D型肉毒毒素凍干劑凍干曲線(單位:溫度℃,真空度Pa,時(shí)間h)

        4 結(jié)論

        4.1研制的D型肉毒毒素凍干劑在室溫(13℃~18℃)可保存10個(gè)月,37℃可保存6個(gè)月,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出水劑室溫(13℃~18℃)可保存2個(gè)月,37℃可保存7 d的保存期,且便于運(yùn)輸、保存和使用。為我國的草原鼠害防治領(lǐng)域增加了一種新的劑型。

        4.2采用該方法試生產(chǎn)D型肉毒毒素凍干劑25.152萬mL,完成草原鼠害防治200萬畝,滅效均在90%以上。通過毒理、安評和藥效試驗(yàn),取得了農(nóng)藥生產(chǎn)許可證和農(nóng)藥臨時(shí)登記證。

        參考文獻(xiàn):

        [1]王明俊.獸用生物制品學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1997:346-368.

        Study on Freeze- dried Agent of Typeof D Botulinum Toxin

        LIU Sheng-cai,ZHANG Xi-yun,HU Guo-yuan,F(xiàn)AN Yu-xia,LI Sheng-qing,LI Xiu-ping,WANG Ting-ting,LI Zhi-ning,HUANG Rong,LIU Huai-xin
        (Animal Sciences and Veterinary Medicine,Qinghai University,Xining 810016,China)

        Abstract:The freeze-dried agent of type of D Botulinum,a new type of D Botulinum Toxin was developed based on the choice of protective agent and freeze-dried test.type D new dosage forms,Botulinum toxin type.30%of sucrose + 10%of gelatin as the protective agent of freeze-dried agent was determined.Under room temperature(13~18℃),it can be stored for 10 months. It can be stored for 6 months in37℃.Moisture content was less than 5%.The freeze-drying curve was made. Key words:Type of D Botulinum toxin;Protective agent;Storage period;Freeze-drying curve

        中圖分類號:R 378.91

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號:0529- 6005(2016)03- 0113- 03

        收稿日期:2014-05-23

        作者簡介:劉生財(cái)(1968-),男,副研究員,本科,從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作,E-mail:Liushc315@163.com

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