劉海波，繩秀珍，唐小千，邢 婧，戰(zhàn)文斌（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島 266003）

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培養(yǎng)條件對海豚鏈球菌的生長及其胞外產(chǎn)物蛋白組成的影響

劉海波，繩秀珍，唐小千，邢 婧，戰(zhàn)文斌
（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島 266003）

摘 要：本文研究了培養(yǎng)條件對海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）NUF849生長的影響，分析了不同培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物的蛋白組成變化。結(jié)果顯示，海豚鏈球菌在28 ℃時生長狀態(tài)最好，胞外產(chǎn)物最豐富，主要有92 kDa、88 kDa、68 kDa、62 kDa、57 kDa、50 kDa、46 kDa、42 kDa、38 kDa、37 kDa、36 kDa、30 kDa、27 kDa和24 kDa等蛋白條帶，溫度升高或降低皆使蛋白條帶減少；相對于普通氣體環(huán)境，5%～ 10%CO2對海豚鏈球菌的生長無顯著影響，但使胞外產(chǎn)物蛋白條帶減少，92 kDa、88 kDa、62 kDa、37 kDa和27 kDa條帶豐度升高；培養(yǎng)基含2‰葡萄糖和5‰NaCl時，海豚鏈球菌生物量最高，5‰和10‰葡萄糖均可增加胞外產(chǎn)物蛋白條帶，提高68 kDa、57 kDa、37 kDa和27 kDa蛋白豐度，但20‰葡萄糖和高于10‰的NaCl會抑制海豚鏈球菌的生長并減少胞外產(chǎn)物蛋白豐度；培養(yǎng)基中添加二聯(lián)吡啶（DPD）和FeCl3時，海豚鏈球菌生長受到抑制，胞外產(chǎn)物蛋白條帶較BHI培養(yǎng)基條件下明顯減少。本文結(jié)果有助于認識海豚鏈球菌對外界環(huán)境條件的反應(yīng)，為揭示其致病機理提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：海豚鏈球菌；培養(yǎng)條件；生長狀態(tài)；胞外產(chǎn)物；蛋白組成

海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）是導(dǎo)致魚類鏈球菌病的主要致病菌之一，可感染牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、羅非魚（Oreochromis nilotica）、海鱸（Lateolabrax japonicus）等多種魚類[1-3]，可給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

細菌的生長狀況與其生長環(huán)境密切相關(guān)。如溫度、氣體環(huán)境、滲透壓以及金屬離子含量均可對細菌的生長狀態(tài)產(chǎn)生影響，從而影響菌體蛋白、胞外產(chǎn)物（extracellular products，ECPs）等的表達分泌[4-5]。胞外產(chǎn)物中的很多蛋白，包括酶、細胞因子和激素等，均對細菌的存活和繁衍具有重要作用，尤其是致病性細菌的分泌蛋白往往含有致病或毒力因子[6]，其對于細菌致病機理的研究具有重要意義。在不同的培養(yǎng)環(huán)境中，細菌會隨環(huán)境變化改變自身生長代謝，胞外產(chǎn)物也會發(fā)生相應(yīng)變化。因此，研究環(huán)境因子對細菌生長及胞外產(chǎn)物分泌的影響，可以更好地認識細菌對外界的反應(yīng)，為揭示細菌的致病機理提供參考依據(jù)。

本實驗室前期研究了5株海豚鏈球菌菌株的毒力特性、各菌株胞外產(chǎn)物的抗原性及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[7-9]。本文選取其中毒力較強的菌株NUF849，研究其在不同溫度、氣體環(huán)境以及培養(yǎng)基鹽度、葡萄糖含量、鐵元素含量等條件下的生長狀況，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析不同環(huán)境條件下海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物蛋白組成變化。

1　材料與方法

1.1細菌培養(yǎng)

海豚鏈球菌NUF849由本實驗室保藏[10]。NUF849經(jīng)血平板活化后，轉(zhuǎn)接于腦心浸液（BHI）平板繼續(xù)培養(yǎng)，再挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，于28 ℃靜置培養(yǎng)至吸光度為0.900 0左右（595 nm，Tecan），然后將其作為種子液置于BHI液體培養(yǎng)基（20 mL液體，100 mL三角瓶）中進行擴大培養(yǎng)。

1.2不同培養(yǎng)條件的設(shè)置及生長曲線的測繪

將海豚鏈球菌NUF849接種于普通BHI液體培養(yǎng)基（含有5‰NaCl和2‰葡萄糖），對溫度、氣體環(huán)境以及培養(yǎng)基的鹽度（NaCl含量）、葡萄糖含量、鐵離子含量等培養(yǎng)條件作如下設(shè)置：（1）分別于15 ℃、20 ℃、28 ℃、37 ℃條件下靜置培養(yǎng)；（2）分別置于普通氣體環(huán)境（空氣）和含5%～10% CO2氣體環(huán)境（燭缸法）中培養(yǎng)；（3）培養(yǎng)基NaCl濃度分別為5‰、10‰、15‰、20‰；（4）培養(yǎng)基葡萄糖濃度分別為2‰、5‰、10‰、15‰、20‰；（5）培養(yǎng)基二聯(lián)吡啶（DPD，鐵離子絡(luò)合劑）濃度分別為0 mM、0.5 mM、1 mM；（6）培養(yǎng)基三氯化鐵（FeCl3，鐵離子添加劑）濃度分別為0 mM、1 mM、3 mM、5 mM。除了溫度梯度實驗組外，其他組皆于28 ℃靜置培養(yǎng)。

取樣前搖勻三角瓶內(nèi)液體，測樣前同樣搖勻96孔板。每隔3 h，在無菌條件下，每瓶取液體培養(yǎng)物200 μL×3，以酶標(biāo)儀測定其吸光度（595 nm），之后繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)取樣21 h。以吸光度（OD）值代表菌液濃度，以時間（h）為橫軸，OD值為縱軸，繪制生長曲線。未接種的培養(yǎng)液作為基底值。每個環(huán)境條件設(shè)置三個平行，取平均值作為繪圖數(shù)據(jù)。

1.3胞外產(chǎn)物制備

采用平板玻璃紙法，制備胞外產(chǎn)物[11]。將活化后的海豚鏈球菌接種于BHI肉湯，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h；取1 mL液體培養(yǎng)物涂布于鋪覆滅菌玻璃紙的BHI平板，28 ℃培養(yǎng)60 h；0.01 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔，收集菌懸液離心（8 000 g，20 min，4 ℃）；上清經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌，并以截留分子量為8～14 kDa的透析袋于超純水中4 ℃透析，凍干，以PBS重懸，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后，分裝貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4SDS-PAGE

將不同培養(yǎng)條件下所得的海豚鏈球菌NUF849胞外產(chǎn)物進行SDS-PAGE。將胞外產(chǎn)物與電泳樣品緩沖液等體積混勻，沸水浴10 min，冷卻后上樣，每泳道上樣10 μg。采用Tris-甘氨酸電泳緩沖液，4 ℃條件下進行電泳。丙烯酰胺濃度 ：分離膠10%（v/v）、濃縮膠4.75%（v/v）。設(shè)置濃縮膠部分恒定電流為30 mA，分離膠部分恒定電流為60 mA。電泳結(jié)束后，用凝膠經(jīng)考馬斯亮藍R250常規(guī)染色，再用全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描，觀察各組胞外產(chǎn)物蛋白組成，利用Gel-Pro Analyzer軟件分析各蛋白分子量。

2　結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌的生長曲線

將海豚鏈球菌NUF849分別置于15 ℃、20 ℃、28 ℃和37 ℃下靜置培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)28 ℃是NUF849的最適生長溫度，其延滯期最短，最終生物量最高；20℃與37 ℃下細菌的生長狀態(tài)相似生長速度較慢，生物量較少；15℃下細菌生長受到嚴(yán)重限制（圖1-A）。

不同氣體環(huán)境中的海豚鏈球菌NUF849生長狀況差異不大，與普通氣體環(huán)境條件相比，在含5%～10% CO2氣體環(huán)境中，細菌較快進入指數(shù)生長期，但最終得到的生物量略低（圖1-B）。

培養(yǎng)基中NaCl含量為5‰時，海豚鏈球菌NUF849的最終生物量最高，隨著鹽度的升高（10‰、15‰和20‰），生物量依次遞減（圖1-C）。

培養(yǎng)基中葡萄糖含量為2‰時，海豚鏈球菌NUF849的最終生物量最高，5‰葡萄糖含量較2‰時更快進入指數(shù)增長期，但最終生物量略低；隨葡萄糖含量從10‰、15‰、20‰逐漸升高，最高生物量依次遞減（圖1-D）。

培養(yǎng)基中添加FeCl3和DPD后，海豚鏈球菌NUF849的生長皆受到抑制，其最終生物量明顯低于BHI培養(yǎng)基條件下的生物量（圖1-E、F）。隨著FeCl3濃度的升高，細菌生長速度和生物量均逐漸降低（圖1-E）；添加0.5 mM DPD會減緩細菌的生長速度，但得到的最高生物量與BHI培養(yǎng)條件下相當(dāng)，而1.0 mM DPD使最終生物量明顯降低（圖1-F）。

圖1　不同培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌的成長曲線

2.2不同培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物蛋白組成的變化

溫度對海豚鏈球菌NUF849胞外產(chǎn)物的蛋白組成和豐度有顯著影響（圖2-A），28 ℃時胞外產(chǎn)物蛋白條帶最為豐富，主要蛋白條帶有92 kDa、68 kDa、62 kDa、57 kDa、50 kDa、46 kDa、42 kDa、38 kDa、37 kDa、36 kDa、30 kDa、27 kDa 和24 kDa等；15 ℃時胞外產(chǎn)物蛋白條帶最少，僅68 kDa一條較為明顯且豐度較高；20 ℃時胞外產(chǎn)物蛋白條帶較28 ℃時減少，各條帶豐度降低；37℃時92 kDa、37 kDa、36 kDa等蛋白條帶豐度明顯降低，但88 kDa、46 kDa、38 kDa、20 kDa等條帶豐度較 28 ℃時略有增加。

CO2對NUF849胞外產(chǎn)物的蛋白組成有較大影響（圖2-B）。與普通氣體環(huán)境相比較，在5%～10%CO2氣體環(huán)境中，除92 kDa、88 kDa、62 kDa、37 kDa和27 kDa等蛋白條帶豐度上升外，其余蛋白條帶豐度均呈下降趨勢。

培養(yǎng)基中NaCl或葡萄糖含量的改變，均使NUF849胞外產(chǎn)物的蛋白組成產(chǎn)生變化（圖2-C、D）。與BHI相比較（內(nèi)含5‰NaCl、2‰葡萄糖），10‰NaCl含量使胞外產(chǎn)物蛋白條帶明顯減少，僅48 kDa、37 kDa蛋白條帶豐度上升，15‰NaCl含量使大部分蛋白條帶豐度降低但57 kDa、37 kDa和27 kDa條帶的豐度上升；5‰葡萄糖含量豐富了胞外產(chǎn)物蛋白條帶，且提高了68 kDa、57 kDa、37 kDa和27 kDa等條帶的豐度，10‰葡萄糖含量具有相似效果，而20‰葡萄糖含量對胞外產(chǎn)物的分泌有抑制作用，所有蛋白條帶豐度均下降。

培養(yǎng)基中添加DPD和FeCl3使海豚鏈球菌NUF849胞外產(chǎn)物蛋白條帶較BHI培養(yǎng)基條件下明顯減少（圖2-E），但1 mM DPD使分子量為27 kDa的蛋白豐度增大，0.05 mM DPD使 25 kDa以下的小分子量蛋白豐度略有增加；隨FeCl3濃度增大，胞外產(chǎn)物各蛋白條帶數(shù)量明顯降低，5 mM FeCl3條件下僅27 kDa蛋白條帶較為明顯。

3　討論

本文以BHI培養(yǎng)基在不同環(huán)境條件下培養(yǎng)海豚鏈球菌，測繪生長曲線，研究了海豚鏈球菌NUF849對環(huán)境條件的群體反應(yīng)，利用SDS-PAGE分析了這些環(huán)境條件下海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物的蛋白組成變化，發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌的生長狀態(tài)與胞外產(chǎn)物組成均與外界環(huán)境緊密相關(guān)。在海豚鏈球菌生長狀態(tài)好、生物量高的環(huán)境條件下，其所產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物也最豐富。因此可通過調(diào)節(jié)環(huán)境條件來調(diào)整海豚鏈球菌的生長狀態(tài)。

圖2　不同培養(yǎng)條件對海豚鏈球菌NUF849胞外產(chǎn)物的影響

資料顯示，由海豚鏈球菌引發(fā)的海水養(yǎng)殖魚類鏈球菌病多發(fā)生于夏季高溫期，20 ℃以下較少發(fā)病[12]。本研究中，28 ℃ BHI培養(yǎng)基條件下的海豚鏈球菌生長最快，胞外產(chǎn)物蛋白條帶也最為豐富，與海豚鏈球菌在28℃易引發(fā)疾病的實際情況相對應(yīng)，說明28 ℃時海豚鏈球菌產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物中可能含有較多致病因子。本實驗室前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，28 ℃時以普通BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)的海豚鏈球菌所分泌的胞外產(chǎn)物中，分子量為36 kDa的蛋白條帶僅存在于強致病性毒株的胞外產(chǎn)物中，分子量為24 kDa、30 kDa、38 kDa、46 kDa、50 kDa、62 kDa 及88 kDa等蛋白條帶具有抗原性，推測以上蛋白可能是海豚鏈球菌侵染宿主過程中的重要參與者。本研究中的海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物蛋白組成與前期研究結(jié)果一致[8]。通過研究溫度對海豚鏈球菌的影響發(fā)現(xiàn)，與28 ℃相比較，溫度降至20℃時海豚鏈球菌生長受到抑制，上述抗原性蛋白條帶豐度有所下降，15℃時大部分蛋白條帶消失，37 ℃時88 kDa、46 kDa、38 kDa蛋白條帶豐度增大，而36 kDa蛋白條帶僅在28 ℃和37 ℃條件下出現(xiàn)，即在較高溫度下，胞外產(chǎn)物蛋白組成相對較豐富，且豐度較高。這些結(jié)果說明溫度對海豚鏈球菌生長及胞外產(chǎn)物分泌影響較大，較高溫度下的胞外產(chǎn)物蛋白組成更豐富，胞外產(chǎn)物蛋白組成與豐度隨溫度變化可能導(dǎo)致其毒力變化，原因可能是不同環(huán)境溫度下的海豚鏈球菌感染力不同，且主要在高溫季節(jié)感染發(fā)病。

部分細菌莢膜的形成受CO2調(diào)控[13]，A群鏈球菌部分毒力因子的分泌也受CO2濃度的影響[14]，這說明CO2會影響細菌菌體蛋白和分泌蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)5%～10% CO2可誘導(dǎo)海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物部分蛋白豐度產(chǎn)生變化。在上述具有抗原性的蛋白[8]中，88 kDa、62 kDa條帶豐度上升，其余蛋白條帶豐度均下降；但5%～10% CO2對海豚鏈球菌的生長無顯著影響，可能是由于設(shè)定條件尚未超出菌株生長的耐受范圍。葡萄糖和NaCl濃度梯度實驗顯示，5‰葡萄糖含量可促進菌株生長，豐富胞外產(chǎn)物蛋白條帶，提高個別條帶的豐度，但過量的葡萄糖（20‰）和高濃度NaCl均會抑制菌株的生長和胞外蛋白的表達分泌。在Tadahiro等的研究中也發(fā)現(xiàn)，化膿鏈球菌的部分毒力因子，如補體抑制劑、致熱性外毒素、有絲分裂因子等的分泌會隨葡萄糖和NaCl含量的增加而減少甚至消失[14]。同時研究發(fā)現(xiàn)，在鐵元素富足時，A群鏈球菌許多蛋白表達量降低[14]，而M蛋白的表達會因鐵元素的缺失受到抑制[15]。本研究中，添加鐵離子或鐵離子螯合劑均使胞外產(chǎn)物蛋白條帶減少，說明培養(yǎng)基中鐵離子過多或缺失均對海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物的分泌有抑制作用。另外，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl、葡萄糖及鐵離子濃度發(fā)生變化時，上述具有抗原性的蛋白條帶[8]的豐度均呈現(xiàn)下降趨勢，并且均導(dǎo)致36 kDa蛋白缺失。本研究結(jié)果說明氣體環(huán)境以及培養(yǎng)基的鹽度、葡萄糖含量、鐵元素含量等培養(yǎng)條件的變化也直接影響海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物蛋白組成和豐度，但至于這些蛋白組成與豐度變化如何影響海豚鏈球菌的毒力特性還有待進一步研究。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Effects of Culture Conditions on Growth of Streptococcus iniae and Protein Compositions of Its Extracellular Products

Liu Haibo，Sheng Xiuzhen，Tang Xiaoqian，Xing Jing，Zhan Wenbin
（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao，Shandong 266003）

Abstract：In this paper，the growth of Streptococcus iniae NUF849 under different culture conditions were studied，and the extracellular products（ECPs）of S.iniae were obtained using plate culture technique with their protein compositions profi led through SDS-PAGE. The results showed that the optimal growth of S. iniae and protein excretion of ECPs were detected under 28℃，and the bands of ECPs mainly included 92 kDa，88 kDa，68 kDa，62 kDa，57 kDa，50 kDa， 46 kDa，42 kDa，38 kDa，37 kDa，36 kDa，30 kDa，27 kDa and 24 kDa protein，while some protein abundance were reduced with the temperature increasing or decreasing；Compared to ordinary gaseous environment，there was no significant effect on the growth of S. iniae with 5%～10% CO2，but the protein bands of ECPs was reduced，although the abundance of several bands with molecular weight of 92 kDa，88 kDa，62 kDa，37 kDa and 27 kDa increased；The maximal biomass could be got when the medium contained 2‰ glucose and 5‰ NaCl，and the bands of ECPs were enriched at 5‰ and 10‰ of glucose with the protein abundance of 68 kDa，57 kDa，37 kDa and 27 kDa.However，20‰ of glucose and over 10‰ of NaCl inhibited the growth of S. iniae and the secretion of ECPs proteins. In addition，the growth of S.iniae was obviously inhibited and the bands of ECPs proteins were signifi cantly decreased when DPD or FeCl3was added to the mediumas compared with BHI medium.The results revealed that the temperature，gaseous environment，salinity，glucose content and iron content in the medium had important effects on the growth of S.iniae and protein excretion of its ECPs，which would help us to have better understanding of responds of S. iniae to the condition changes and its pathogenesis. Key words： Streptococcus iniae；culture condition；growth status；extracellular product；protein composition

中圖分類號：S941.42

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）05-0085-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.026

基金項目：國家科技支撐計劃課題（2012BAD17B01）、山東省科技發(fā)展計劃項目（2014GNC111015）、山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項項目（2014ZZCX06205）

通訊作者：繩秀珍