張　彧,謝　娟,徐　瑞,李麗娜,阮之平

原發(fā)性肝癌病人抑郁與血管生成的相關(guān)性研究

張彧,謝娟,徐瑞,李麗娜,阮之平

摘要:[目的]探索原發(fā)性肝癌抑郁對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，為原發(fā)性肝癌伴抑郁病人的護(hù)理提供理論基礎(chǔ)。[方法]采用Hamilton抑郁量表(HAMD)和Zung抑郁自評(píng)量表對(duì)原發(fā)性肝癌病人做心理篩查;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)病人血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)和血管生成指標(biāo);利用體外培養(yǎng)系統(tǒng),檢測(cè)原發(fā)性肝癌伴抑郁病人的血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移的影響;追蹤原發(fā)性肝癌病人血清氧化應(yīng)激及血管生成對(duì)原發(fā)性肝癌病人無進(jìn)展生存期及總的生存期的影響。[結(jié)果]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth fator,VEGF)在原發(fā)性肝癌伴抑郁病人中的表達(dá)顯著高于其非抑郁病人中的表達(dá)水平(P<0.05);體外實(shí)驗(yàn)證明原發(fā)性肝癌伴抑郁病人的血清能夠有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力;原發(fā)性肝癌病人抑郁水平、血清氧化應(yīng)激水平及VEGF水平與病人的生存期呈負(fù)相關(guān)。[結(jié)論]原發(fā)性肝癌病人抑郁水平與血清VEGF呈正相關(guān),與病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞:原發(fā)性肝癌;抑郁;氧化應(yīng)激;血管生成

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)是第5位常見的惡性腫瘤,全世界每年有約600 000人死于該疾病,占據(jù)腫瘤相關(guān)死亡率的第3位[1]。我國的肝癌發(fā)病人數(shù)約占全世界的55%;死亡率僅次于肺癌,位居第2位。由于原發(fā)性肝癌的起病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差、治療效果不理想,在原發(fā)性肝癌病人中,抑郁的發(fā)生比例非常高[2]。近年來,由于對(duì)腫瘤病人心理因素的重視,一門新興學(xué)科——腫瘤心理學(xué)得到長(zhǎng)足發(fā)展[3]。腫瘤心理學(xué)認(rèn)為惡性腫瘤屬心身疾病,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與個(gè)性心理特征、情緒障礙、生活習(xí)慣、社會(huì)矛盾等有關(guān)。氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤血管生成的促進(jìn)作用[4]越來越受到人們的重視。研究認(rèn)為活性氧(ROS)對(duì)血管形成的促進(jìn)作用源于在蛋白及信使核糖核酸(mRNA)水平上調(diào)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth fator,VEGF)的表達(dá)[5]?，F(xiàn)有的研究可以證實(shí)抑郁與腫瘤的死亡相關(guān),明確氧化應(yīng)激參與了抑郁的病理、生理過程[6-8],而氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)腫瘤血管的生成[9-11],那么在肝癌伴抑郁的病人中,會(huì)不會(huì)因較高的氧化應(yīng)激水平而存在更強(qiáng)的腫瘤血管生成活性,由此影響病人的無進(jìn)展生存期及總的生存期呢？本研究擬通過心理測(cè)評(píng)分組,動(dòng)態(tài)觀察原發(fā)性肝癌伴或不伴抑郁病人其氧化應(yīng)激水平的差異,對(duì)比分析抑郁程度和血清VEGF的關(guān)系,旨在了解肝癌抑郁情緒與腫瘤血管生成之間的關(guān)系,并有望為心身疾病的發(fā)生、發(fā)展提供新的研究方向。

1資料和方法

1.1一般資料研究對(duì)象為2012年—2014年陜西省腫瘤醫(yī)院住院病人40例。納入標(biāo)準(zhǔn):符合世界衛(wèi)生組織(WHO)原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn);尚未進(jìn)行或1個(gè)月內(nèi)未行化療、放療及手術(shù)者;Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分≥60分;預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn):入組前1個(gè)月曾服用抗抑郁及抗氧化劑;既往有精神病史者;有智能障礙者;藥物、煙酒依賴者;患有感染或其他嚴(yán)重軀體疾病者。設(shè)立兩個(gè)研究組,每組20例,兩組病人的年齡、性別、病理分型、臨床分期、腫瘤大小及數(shù)目均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。依據(jù)Hamilton 17項(xiàng)抑郁量表(HAMD,評(píng)分≥18分)和Zung抑郁自評(píng)量表(SDS,標(biāo)準(zhǔn)分≥50分)做心理篩查。病人簽知情同意書,臨床研究?jī)?nèi)容符合《赫爾辛基宣言》及倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2試劑和儀器M199培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Hyclone公司;96孔板和細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Costar公司;Transwell小室購于Corning公司,基質(zhì)膠購自日本BD公司。條件培養(yǎng)基制備:抽取病人全血5 mL,分離得到血清,并于1 000 rpm離心5 min 清除殘留細(xì)胞,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分別將病人血清加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(3 200 pg/mL、1 600 pg/mL、800 pg/mL、400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL)各100 μL,37 ℃孵箱孵育2 h,洗滌5次,加入50 μL鼠抗人VEGF工作液,37 ℃孵箱孵育1 h,洗滌,加入100 μL酶標(biāo)抗體工作液,37 ℃孵箱孵育1 h,每孔加入100 μL底物工作液,混勻37 ℃避光孵育10 min,加入50 μL中止液混勻后在492 nm處測(cè)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程,計(jì)算得到待測(cè)樣品VEGF含量。

1.4四甲基偶氨唑鹽比色法(MTT)實(shí)驗(yàn)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)按1×104/mL的密度150 μL接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,去除培養(yǎng)基,換成含有抑郁肝癌病人或者非抑郁肝癌病人血清的條件培養(yǎng)基(血清量∶完全培養(yǎng)基為1∶1)繼續(xù)培養(yǎng)直至7 d。以M199完全培養(yǎng)基為陽性對(duì)照。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值。

1.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)胰酶消化HUVEC細(xì)胞成單細(xì)胞懸液,用含1%胎牛血清的M199培養(yǎng)基重懸,按1×104/mL的密度100 μL接種于Transwell上層小室。吸取各種條件培養(yǎng)基500 μL加入Transwell下層小室,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以M199完全培養(yǎng)基為陽性對(duì)照。用棉簽蘸磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長(zhǎng)但未能穿過膜的細(xì)胞。將膜取出放入預(yù)先裝有95%乙醇的24孔板內(nèi)固定10min。吸棄乙醇,加0.1%的結(jié)晶紫染色30 min,用PBS小心洗去多余的染料,翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜,小心撕下,晾干,置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大鏡下隨機(jī)觀察并計(jì)10個(gè)視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),照相記錄。

1.6評(píng)價(jià)內(nèi)容與方法原發(fā)性肝癌病人抑郁水平與氧化應(yīng)激及VEGF表達(dá)的相關(guān)性研究,為了研究原發(fā)性肝癌病人抑郁水平對(duì)病人疾病進(jìn)展及預(yù)后的影響,首先原發(fā)性肝癌病人抑郁水平與病人血管生成之間的關(guān)系,試圖探討與完善肝癌疾病進(jìn)展的精神心理因素。通過提前設(shè)定好的臨床病例篩選標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合抑郁量表的評(píng)估將研究對(duì)象分為原發(fā)性肝癌伴抑郁組和不伴抑郁組,通過臨床生化試驗(yàn)檢測(cè)病人血清中氧化應(yīng)激指標(biāo),包括ROS、超氧化物歧化酶(SOD)，血管生成指標(biāo)通過ELISA方法檢測(cè)血清VEGF水平。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來源于原發(fā)性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力;采用trans-well小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來源于原發(fā)性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人的血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力。

2結(jié)果

2.1原發(fā)性肝癌病人抑郁水平與氧化應(yīng)激及VEGF表達(dá)的相關(guān)性研究原發(fā)性肝癌抑郁組病人血清氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS顯著高于原發(fā)性肝癌非抑郁組的病人,SOD水平低于非抑郁組(P<0.05)，血管生成指標(biāo)VEGF在抑郁組病人中顯著高于非抑郁組的原發(fā)性肝癌組(P<0.05),見表1。相關(guān)分析顯示：原發(fā)性肝癌病人血清中ROS與VEGF水平呈正相關(guān)(r=0.678，P<0.05)，SOD則與VEGF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721，P<0.05)。

表1　兩組原發(fā)性肝癌病人氧化應(yīng)激及VEGF表達(dá)水平

2.2原發(fā)性肝癌病人血清中氧化應(yīng)激物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響分離兩組原發(fā)性肝癌病人的血清(每組選擇3例病人分別進(jìn)入研究,最終以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值進(jìn)行比較分析)與完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC,通過細(xì)胞增殖能力和遷移能力評(píng)價(jià),結(jié)果來源于伴有抑郁病人的血清培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力顯著高于非抑郁組(P<0.05),見圖1;抑郁組細(xì)胞遷移能力也顯著高于非抑郁組的遷移能力(P<0.05),見圖2。

圖1　抑郁對(duì)原發(fā)性肝癌病人血清血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

圖2　抑郁對(duì)原發(fā)性肝癌病人細(xì)胞遷移能力的影響

2.3原發(fā)性肝癌病人抑郁水平、氧化應(yīng)激及VEGF水平對(duì)病人預(yù)后的影響通過對(duì)入選的肝癌病人進(jìn)行了為期3年的隨訪。結(jié)果顯示：原發(fā)性肝癌抑郁組病人的生存期(5.24個(gè)月±0.15個(gè)月)較原發(fā)性肝癌非抑郁組病人(8.12個(gè)月±0.21個(gè)月)顯著降低(P<0.05)，并且呈負(fù)相關(guān)(r=-0.592,P<0.05)。進(jìn)一步分析氧化應(yīng)激指標(biāo)及VEGF與病人生存時(shí)間的相關(guān)性：原發(fā)性肝癌病人ROS和VEGF均與病人的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.782,-0.845,SOD與病人的生存時(shí)間呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.692(P<0.05)。以上結(jié)果提示原發(fā)性肝癌病人抑郁程度及血清中氧化應(yīng)激及VEGF指標(biāo)可能作為病人的預(yù)后的影響因素。

3討論

隨著國民素質(zhì)及病人認(rèn)知度的提高,腫瘤科護(hù)士的護(hù)理對(duì)象中絕大多數(shù)對(duì)自己的病情有充分的認(rèn)知,這使病人可以更好地了解疾病轉(zhuǎn)歸并積極配合治療。另一方面對(duì)于那些惡性程度高、預(yù)后差的腫瘤病人,疾病確診的同時(shí),病人的心理也會(huì)產(chǎn)生急劇變化,常見抑郁等不良情緒。

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化防御之間的不平衡引起。該過程引發(fā)氧化損傷,促進(jìn)ROS依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控而導(dǎo)致細(xì)胞表型的特異性改變等[11-12]。這一過程參與了細(xì)胞的凋亡、壞死及細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生的多種病理生理過程[13]。在肝臟組織中氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡及肝細(xì)胞的再生,從而直接導(dǎo)致肝臟中具有高度增殖活性、基因組不穩(wěn)定性、高遷移性及高度成血管活性等致癌性的優(yōu)勢(shì)克隆出現(xiàn)[9]。而氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤血管生成的促進(jìn)作用[4]越來越受到人們的重視[14-16]。研究認(rèn)為ROS對(duì)血管形成的促進(jìn)作用源于在蛋白及mRNA水平上調(diào)了VEGF的表達(dá)[9]。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的生長(zhǎng)因子,不僅能刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增殖和存活,增加血管通透性,參與腫瘤血管生成,還直接與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān),是迄今所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)、最特異的促血管生成因子之一,在腫瘤新生血管形成過程中起關(guān)鍵作用[17-18]。它由腫瘤細(xì)胞或侵入腫瘤的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生,可以通過自分泌方式作用于腫瘤細(xì)胞本身,直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),或通過旁分泌方式結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)新生血管生成[19]。肝癌是一種典型的富血供的實(shí)體腫瘤,腫瘤血管生成和血管侵犯是肝癌的重要病理學(xué)特點(diǎn)之一,具有生長(zhǎng)快、惡性程度高、易發(fā)生肝內(nèi)播散、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后差等臨床病理特征,與其有較強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤血管生成能力有關(guān)[20]。除了在肝癌組織中VEGF高表達(dá),肝癌病人的血清和血漿中也存在高濃度的VEGF[21]。一項(xiàng)有60例肝癌病人入組的實(shí)驗(yàn)表明：血清VEGF含量和血小板計(jì)數(shù)的比值與腫瘤細(xì)胞中VEGF含量呈明顯正相關(guān),同時(shí)還發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中VEGF含量、血清 VEGF含量及血清VEGF含量和血小板計(jì)數(shù)比值越高意味著肝癌病人的臨床分期越晚[22]。另外一項(xiàng)有105例肝癌病人入組的實(shí)驗(yàn)表明,血清VEGF含量與肝癌門脈浸潤和臨床分期密切相關(guān),具有高水平VEGF(>245.0 pg/mL)的病人無病生存期較低水平VEGF病人短,總體預(yù)后差[23]。因此,VEGF 在肝癌血管生成中發(fā)揮了重要作用,是肝癌血管生成的中心環(huán)節(jié),同時(shí)也是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子[24]。

眾所周知,癌癥作為機(jī)體組織病變,腫瘤相關(guān)基因異常等環(huán)境因素和心理因素相互作用的疾病已得到廣泛的認(rèn)可,其中不良心理因素及應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腫瘤的進(jìn)展具有一定的促進(jìn)作用。同時(shí),癌癥病人在接受治療過程中,心理因素起著不可忽視的作用。然而目前對(duì)癌癥病人確診初期,治療過程及臨終整個(gè)過程的心理護(hù)理及疏導(dǎo)仍然不夠全面與普及。本研究闡述了原發(fā)性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人氧化應(yīng)激水平與癌癥進(jìn)展相關(guān)因素血管生成的關(guān)系,對(duì)個(gè)體化的臨床診療及護(hù)理提供理論依據(jù)和量化指標(biāo)。

本研究證實(shí)了抑郁與肝癌腫瘤病人的預(yù)后相關(guān),提示肝癌伴抑郁的病人中,較高的氧化應(yīng)激水平,使得病人具有更強(qiáng)的腫瘤血管生成活性,由此影響病人的無進(jìn)展生存期及總的生存期。值得注意的是原發(fā)性肝癌伴抑郁病人血清氧化應(yīng)激水平與病人血清VEGF相關(guān),說明了肝癌抑郁情緒與腫瘤血管生成之間的關(guān)系,并有望為心身疾病的發(fā)生、發(fā)展提供新的研究方向。

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(本文編輯孫玉梅)

Correlation study between depression and angiogenesis in patients with primary liver cancer

Zhang Yu,Xie Juan,Xu Rui,et al

(Shaanxi Provincial Tumor Hospital,Shaanxi 710061 China)

基金項(xiàng)目陜西省科技廳社發(fā)公關(guān)項(xiàng)目,編號(hào):2013K12-03-15。

作者簡(jiǎn)介張彧,主管護(hù)師,碩士研究生，單位：710061,陜西省腫瘤醫(yī)院;謝娟、徐瑞、李麗娜單位:710061,陜西省腫瘤醫(yī)院;阮之平(通訊作者)單位：710061,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院。

中圖分類號(hào)：R473.73

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-6493.2016.16.032

文章編號(hào)：1009-6493(2016)06A-2018-04

(收稿日期:2015-06-30;修回日期:2016-05-08)