于成和，張若鵬，吳　睿，張麗蓉，朱　莉，董金玉，李　娟，阿周存（大理大學(xué)附屬醫(yī)院，云南大理　671000）

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斷尾鼠精放置不同時(shí)間行ICSI對胚胎發(fā)育的影響

于成和，張若鵬，吳睿，張麗蓉，朱莉，董金玉，李娟，阿周存*
（大理大學(xué)附屬醫(yī)院，云南大理671000）

［摘要］目的:鼠精斷尾放置不同時(shí)間后注射入卵，評價(jià)其對胚胎發(fā)育潛能的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為10組：以立即注射為對照組，以分別放置0.5、1、2、3、4、5、6、12、24 h后注射為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組有關(guān)原核形成率、2-細(xì)胞形成率、4-細(xì)胞形成率、桑葚胚形成率、囊胚形成率的差異。結(jié)果：放置6 h開始，原核形成率（68.4% vs. 82.5 %）、2-細(xì)胞形成率（83.3% vs. 96.0%）顯著地低于對照組（P < 0.05）；放置4 h開始，4-細(xì)胞形成率（59.8% vs. 79.8 %）顯著地低于對照組（P < 0.05）；放置2 h開始，桑葚胚形成率（47.9% vs. 67.7 %）顯著地低于對照組（P < 0.05）；放置0.5 h開始，囊胚形成率（38.9% vs. 53.5%）顯著地低于對照組（P < 0.05），1 h開始，囊胚形成率（17.0% vs. 53.5%）極顯著地低于對照組（P < 0.01），放置3 h，無囊胚形成。結(jié)論：鼠精斷尾放置一段時(shí)間后注射入卵，降低鼠胚發(fā)育潛能。

［關(guān)鍵詞］斷尾鼠精；不同時(shí)間；胚胎發(fā)育潛能

［DOI］10. 3969/j. issn. 1672-2345. 2016. 02. 005

卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），是通過將單個(gè)精子直接注射到卵子胞漿內(nèi)而使卵子受精的方法。1992年P(guān)alerml首次對人卵子進(jìn)行ICSI操作，成功分娩了首例ICSI嬰兒〔1〕。1996年，中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心通過ICSI技術(shù)為一對少精癥不育夫婦助孕，成功分娩我國第一例ICSI嬰兒，為我國ICSI行業(yè)做出突破性貢獻(xiàn)。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，ICSI己經(jīng)成為一種不可缺少的治療不孕不育技術(shù)，廣泛應(yīng)用于嚴(yán)重少弱精、梗阻性無精癥、圓頭（頂體缺乏）精子、常規(guī)IVF受精失敗、死精子、凍融卵子、體外成熟卵子、種植前遺傳學(xué)篩查、種植前遺傳學(xué)診斷等治療。隨著技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，ICSI技術(shù)越來越廣泛，全世界通過ART（輔助生殖技術(shù)）出生的孩子已經(jīng)超過了400萬〔2〕。

而由于倫理問題，許多ICSI方面的實(shí)驗(yàn)研究不能在人身上進(jìn)行。因此，一些合適的動物模型為評估輔助生殖技術(shù)（ART）在胚胎發(fā)育和后代健康狀況方面的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供了重要的研究工具〔3〕。國內(nèi)外眾多學(xué)者對人、鼠、兔、馬、羊、牛、豬和猴等進(jìn)行ICSI，均得到正常后代〔4〕。由于小鼠的卵比人卵小很多且卵子細(xì)胞膜本身具有易脆性，小鼠精子和人的精子不同，小鼠精子頭部呈勾形，尾部長且硬，用人類ICSI方法，達(dá)不到較好的效果。1995年，Kimu?ra等建立在通過Piezo產(chǎn)生的高頻振動進(jìn)行透明帶穿刺及卵膜穿入的小鼠ICSI技術(shù)后，小鼠卵子存活率得以顯著提高〔5〕。近年來，苗聰秀等對持卵管的改良而建立了一種新的小鼠ICSI技術(shù)，通過延伸穿刺凹陷深度顯著提高卵子存活率〔6〕。一直以來，IC?SI是輔助生殖界的熱點(diǎn)話題。在臨床工作中，絕大部分工作者認(rèn)可ICSI技術(shù)并廣泛應(yīng)用于實(shí)踐工作中，但也有部分學(xué)者對其安全性持有懷疑態(tài)度。畢竟ICSI是一種被動授精方式，整個(gè)操作過程人為因素較多，不可避免地對卵子、精子造成損害。國內(nèi)外眾多學(xué)者對ICSI的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率等相關(guān)因素進(jìn)行大量研究，但從未報(bào)道過精子制動后隨著放置時(shí)間延長，影響胚胎發(fā)育的情況。本實(shí)驗(yàn)是利用苗聰秀等人改良的小鼠ICSI新技術(shù)，精子實(shí)施斷尾后，在體外PVP環(huán)境中放置不同時(shí)間，再注射入卵子，研究隨時(shí)間的改變，對胚胎發(fā)育潛能的影響。本研究對提高ICSI胚胎質(zhì)量及臨床妊娠率提供理論依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1動物清潔級8～12周齡的昆明白雌雄鼠，購自大理大學(xué)動物房。

1.1.2主要藥物、試劑、耗材、儀器孕馬血清促性腺激素（杭州動物藥品廠）、人絨毛膜促性腺激素（杭州動物藥品廠）、MHTF（AIM）、CZB培養(yǎng)液（Sigma）、PVP（IS）、SSS（IS）、透明質(zhì)酸酶（SIGMA）、Falcon3001、Falcon3037、Falcon3037、巴德斯管、拉針儀、斷針儀、Olympus倒置顯微鏡及操作系統(tǒng)等。

1.2方法

1.2.1注射針和持卵管的制備

1.2.1.1注射針用于人卵的尖口顯微注射針（Humagen）。

1.2.1.2持卵管制作過程參見相關(guān)文獻(xiàn)〔7〕，具體如下：將G-100型玻璃毛細(xì)管通過拉針儀加熱，手動拉長、拉細(xì)局部毛細(xì)管管壁，使管徑為50～70 μm的部分較長，置于燒針儀上，在內(nèi)徑約為60 μm處加熱，使其收縮并變彎至約25°，轉(zhuǎn)動毛細(xì)管180°，使對側(cè)被加熱收縮并變直，再轉(zhuǎn)動90°，重復(fù)上述加熱過程，使得該處管壁內(nèi)徑均勻收縮至約15 μm，在該處向末端方向55～60 μm內(nèi)徑處，用燒針儀拉斷并加熱使斷口鈍化，在近末端約500 μm處加熱使其彎曲至約35°，開口為喇叭形狀的末端內(nèi)徑為45～55 μm的持卵管制作完成。

1.2.2卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備參見曾明有關(guān)文獻(xiàn)〔8〕并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)情況，具體如下：對70小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）（10 IU/只），48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）（10 IU/只），12.5～ 14 h后頸椎脫臼法處死小鼠，取出卵巢和子宮雙側(cè)輸卵管，置于37℃預(yù)熱的體外操作液MHTF中，解剖鏡下撕開輸卵管的壺腹部（膨大、透亮）并剝開卵巢上較大的卵泡，找到卵丘復(fù)合體，轉(zhuǎn)移至裝卵皿中并計(jì)數(shù)，共獲取1 503個(gè)卵丘復(fù)合體，用巴斯德管將卵丘復(fù)合體吸到37℃預(yù)熱含透明質(zhì)酸酶液的體外操作液MHTF（按3：10的體積比，酶消化l min）中反復(fù)吹打分散卵丘復(fù)合體，并轉(zhuǎn)移至不含透明質(zhì)酸酶的37℃預(yù)熱操作液MHTF中，用口徑更小的拆蛋針反復(fù)吹打以除盡卵子周圍的顆粒細(xì)胞，獲取1 487個(gè)去顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到生長皿中待注射。

1.2.3精子的準(zhǔn)備參見曾明有關(guān)文獻(xiàn)〔8〕并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)情況，頸椎脫臼法處死3～6月齡的性成熟公鼠，取其雙側(cè)附睪尾（連著輸精小管）置于體外操作液，解剖顯微鏡下從附睪尾端開始擠出輸精小管中的精子團(tuán)，將精子團(tuán)置于裝有1 mL體外操作液MHTF的圓底小管底部，37℃恒溫上游15 min吸取上游液于新管中備用。

1.2.4ICSI程序

1.2.4.1上針，配注射盤先上持卵管，再上注射針，調(diào)節(jié)持卵管和注射針的平面。根據(jù)卵子多少，用MHTF液制若干滴，中央加入PVP，迅速覆蓋油，使液面全部覆蓋。

1.2.4.2分組及ICSI操作

1.2.4.2.1分組丟棄17個(gè)形態(tài)異常的卵母細(xì)胞，隨機(jī)將1 470個(gè)卵子平均為10組。分別放入已標(biāo)記的注射盤內(nèi)的注射滴中（1枚/滴），將精子吸入邊緣長形液滴中。以精子斷尾后立即注射為對照組，以精子斷尾放置0.5 h注射為實(shí)驗(yàn)1組，以精子斷尾放置1 h注射為實(shí)驗(yàn)2組，以精子斷尾放置2 h注射為實(shí)驗(yàn)3組，以精子斷尾放置3 h注射為實(shí)驗(yàn)4組，以精子斷尾放置4 h注射為實(shí)驗(yàn)5組，以精子斷尾放置5 h注射為實(shí)驗(yàn)6組，以精子斷尾放置6 h注射為實(shí)驗(yàn)7組，以精子斷尾放置12 h注射為實(shí)驗(yàn)8組，以精子斷尾放置24 h注射為實(shí)驗(yàn)9組。

1.2.4.2.2ICSI操作根據(jù)每組ICSI時(shí)間安排卵子準(zhǔn)備時(shí)間，每組卵子準(zhǔn)備結(jié)束后，用注射針挑選活力好、形態(tài)正常的精子，壓住頸部，朝精子頭的方向刮動，即可從頸部將精子頭拉斷。將斷尾的精子頭部吸入顯微注射針內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵子使得紡錘體區(qū)處于6或12點(diǎn)鐘位置，在其9點(diǎn)鐘位置用新制作持卵管將卵子固定，將精子推至注射針尖口，從卵子的3點(diǎn)鐘方向插入卵子，先淺吸持后淺穿刺，再進(jìn)一步深吸持并深穿刺，插入深度約90 μm，抽吸胞質(zhì)至觀察到胞質(zhì)流動突然加劇而提示胞膜破裂時(shí)，停止抽吸并以正壓將精子頭注入卵胞質(zhì)內(nèi)再以輕微的負(fù)壓小心抽出顯微注射針，持卵管釋放卵子。精子斷尾由專人完成并計(jì)時(shí)，注射卵子由3名技術(shù)嫻熟實(shí)驗(yàn)室人員完成。

1.2.5胚胎培養(yǎng)與觀察參見曾明有關(guān)文獻(xiàn)〔8〕，IC?SI操作結(jié)束后，在CZB培養(yǎng)液滴中洗滌2～3次后轉(zhuǎn)換至與標(biāo)記相對應(yīng)的CZB生長皿中，置于37℃、5.0% CO2箱培養(yǎng)，ICSI（當(dāng)天記為D0.5）后7 h觀察受精及卵子的存活情況（有變黑、漏漿等特征判為死亡），ICSI后次日中午（記為Dl.5）觀察受精卵是否卵裂及胚胎情況，ICSI后第3天中午（記為D3.5）觀察桑甚胚情況，ICSI后第4天中午（記為D4.5）觀察囊胚情況。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用精確概率法的雙側(cè)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

總MⅡ率、總卵子存活率分別為87.2%（1 282/ 1 470）、90.0%（1 154/1 282）。對照組原核出現(xiàn)率、2-細(xì)胞形成率、4-細(xì)胞形成率、桑葚胚形成率、囊胚形成率分別為82.5%、96.0%、79.8%、67.7%、53.5%，提示卵子質(zhì)量及技術(shù)操作正常。各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，精子斷尾后放置6 h及以上組，原核出現(xiàn)率、2-細(xì)胞形成率顯著性降低（P<0.05）；放置4 h及以上組，4-細(xì)胞形成率顯著性降低（P<0.05）；放置2 h及以上組，桑葚胚形成率顯著性降低（P<0.05）；放置0.5 h及以上組，囊胚形成率顯著性降低（P<0.05），放置3 h，無囊胚形成，見表1。

表1　精子斷尾放置不同時(shí)間后注射卵子存活、受精及胚胎發(fā)育的比較

3　討論

ICSI技術(shù)雖已在臨床治療中得到廣泛影響，但仍有很多問題待研究，特別是ICSI特有的過程，例如精子制動對精子、卵子及胚胎發(fā)育的影響，外界環(huán)境對制動后的精子影響，PVP對胚胎發(fā)育潛能的影響等。

對于試管嬰兒來說，胚胎發(fā)育潛能極其重要。影響ICSI胚胎潛能的因素很多，例如精子因素、技術(shù)操作、卵子因素、體外環(huán)境等。在精子因素上，雖然ICSI對精子的要求幾乎沒有限制：活精子、死精子、不運(yùn)動的精子、附睪精子和睪丸精子都可被用于ICSI操作〔9〕。但臨床工作中，不同來源的精子對胚胎質(zhì)量的影響不同。實(shí)驗(yàn)采用“改良的非Piezo依賴的小鼠ICSI新技術(shù)”解決卵子胞膜脆性等問題，通過斷尾解決精子尾部長等問題，科室實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作技術(shù)均嫻熟且隨機(jī)參與到每組實(shí)驗(yàn)中，減低人員之間的誤差，保證數(shù)據(jù)的可靠性。此外，促排卵藥物及外界溫度、濕度、光線均可影響胚胎發(fā)育潛能，這些因素對實(shí)驗(yàn)組和對照組的影響等同并實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，故不考慮其影響。

研究結(jié)果表明，隨著精子斷尾后在PVP停留時(shí)間延長，對原核形成率、正常卵裂率、桑葚胚形成率、囊胚形成率的影響逐步顯著，與Kaoruko Mizuno報(bào)道〔10〕類似。在評價(jià)體系上，胚胎發(fā)育越到后期，越能反應(yīng)胚胎發(fā)育的潛能，放置0.5 h后，囊胚形成率顯著性降低，放置1 h極顯著性降低，并與0.5 h組相比較顯著性降低（P < 0.05），放置3 h，無囊胚形成。鼠精斷尾后，放置在外界環(huán)境中，導(dǎo)致其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能的改變，可能與染色體降解或中心粒失活有關(guān)。因此在ICSI臨床工作中，精子制動后，應(yīng)盡快注射入卵，減少精子的損傷，保障胚胎發(fā)育潛能。

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（責(zé)任編輯董杰）

Effect of Different Standing Time of Mouse Docking Sperm in ICSI on Mouse Embryonic Development

Yu Chenghe, Zhang Ruopeng, Wu Rui, Zhang Lirong, Zhu Li, Dong Jinyu, Li Juan, A Zhoucun*
（Affiliated Hospital of Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

〔Abstract〕Objective: To evaluate the effect of different standing time of mouse docking sperm in intracytoplasmic sperm injection （ICSI）on embryo development potential. Methods: Ten groups were divided by docking sperm standing time（0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24 h）. The rates of pronucleus formation, 2-cell formation, 4-cell formation, morulation and blastocysts formation were compared between each experimental group and the control group. Results: The pronucleus formation rate（68.4% vs. 82.5%）, and the 2-cells formation rate（83.3% vs. 96.0%）were significantly lower in the standing 6 h group than those in the control group（P<0.05）. The 4-cells formation rate（59.8% vs. 79.8%）was significantly lower in the standing 4 h group than that in the control group（P<0.05）. Morulation rate（47.9% vs. 67.7%）was significantly lower in the groups with standing 2 h group than that in the control group（P< 0.05）. The average blastocyst formation rate（38.9% vs. 53.5%）was significantly lower in all standing groups than that in the control group（P<0.05）. The Blastocyst formation rate dropped significantly as the standing time extension. No blastocyst was observed when standing time longer than 3 h. Conclusion: Delay of mouse docking sperm ICSI reduced the development potential of mouse embryo.

〔Key words〕docking sperm; different time; embryo development potential

［中圖分類號］R321.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］1672-2345（2016）02-0019-04

［基金項(xiàng)目］大理學(xué)院青年教師科研基金資助項(xiàng)目（KYQN201316）

［收稿日期］2015-05-11［修回日期］2015-07-01

［作者簡介］于成和，檢驗(yàn)師，主要從事生殖醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究.

*通信作者：阿周存，教授.