羅　旋，胡昌猛，沈遠(yuǎn)娟，張紹飛，羅秋林，鄧都尉，白　麗，2*（.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理　67000；2.大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理　67000）

?

艾葉多糖對小鼠免疫功能影響的研究

羅旋1，胡昌猛1，沈遠(yuǎn)娟1，張紹飛1，羅秋林1，鄧都尉1，白麗1，2*
（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

［摘要］目的：研究艾葉多糖對小鼠免疫功能的影響，進(jìn)而探討艾葉多糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用機(jī)制。方法：將小鼠隨機(jī)分為艾葉多糖高、低劑量組和對照組，連續(xù)灌胃10 d后，處死測定小鼠體重、脾臟及胸腺重量，計(jì)算脾指數(shù)與胸腺指數(shù)，觀察小鼠免疫器官重量的變化；采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬白假絲酵母菌試驗(yàn)測試艾葉多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；采用脾T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測試艾葉多糖對小鼠細(xì)胞免疫的影響；采用ELISA測試艾葉多糖對小鼠抗體生成的影響。結(jié)果：艾葉多糖能夠增加小鼠免疫器官重量，提高巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力及增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖能力。結(jié)論：艾葉多糖具有調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的作用，對非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有一定的增強(qiáng)作用。

［關(guān)鍵詞］艾葉多糖；小鼠；免疫功能

［DOI］10. 3969/j. issn. 1672-2345. 2016. 02. 004

艾葉（Folium Artemisiae Argyi），別名大艾葉、杜艾葉、萎蒿。為菊科植物艾的葉，具有濃烈香氣。其藥用歷史悠久最早記載于《中醫(yī)別錄》。艾葉除了含有主要成分揮發(fā)油外，還含有鞣質(zhì)、黃酮、甾醇、多糖、微量元素及其他有機(jī)成分等〔1〕，具有抗菌、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、利膽、抗過敏性休克等作用〔2〕。大量的藥理和臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的免疫功能，而對正常細(xì)胞幾乎沒有毒副作用〔3-4〕。但艾葉多糖對免疫功能的影響是不清楚的，本研究觀察了艾葉多糖對正常小鼠免疫功能的影響，旨在探討艾葉多糖對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑生理鹽水、95%乙醇、氯仿、正丁醇、臺盼藍(lán)、瑞氏染液、Hank’s液（pH 7.2～7.4）；四噻唑鹽（MTT，Sigma公司產(chǎn)品），RPMI-l640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；植物血凝素（PHA，上海疾控生物科技有限公司產(chǎn)品）；三聯(lián)液（實(shí)驗(yàn)室配制）；磷酸鹽緩沖液PBS（pH 7.4）；IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、IgM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、IgA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（MABTECH生物公司）；脫脂牛奶（美國BD公司）；pNPP（Sigma公司產(chǎn)品）。

1.1.2儀器SHH·W21·Cr600三用恒溫水浴箱（北京長源儀器設(shè)備廠）、RE300A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）、LC-4012低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國BIC-TEK）、JA2103電子天平（上海民橋電子儀器廠）。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物SPF級昆明小鼠30只，雌雄各半，6～8周齡，體重（20±2）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)部提供。

1.1.4艾葉購于大理中藥材市場，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院楊永壽老師鑒定。

1.2方法

1.2.1艾葉多糖的提取浸提溫度95℃，浸提時(shí)間2 h，超聲波作用30 min，液料比為20：1。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，高速離心去沉淀，得到艾葉粗提液；saveg法除蛋白，重復(fù)4次；用95%乙醇沉淀多糖，收集沉淀，恒溫干燥箱60℃干燥90 min，研磨后即得艾葉粗多糖粉末。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物分組共30只小鼠，隨機(jī)分為3組，每組各10只，分別為艾葉多糖低劑量組（150 mg/kg）、艾葉多糖高劑量組（300 mg/kg）和正常對照組（生理鹽水），連續(xù)灌胃10 d。

1.2.3艾葉多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響灌胃結(jié)束后次日，眼底靜脈取血后將小鼠斷頸處死，無菌操作取出腹腔液，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，用Hank’s液調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，用8×106/mL的白假絲酵母菌懸液和調(diào)好的巨噬細(xì)胞懸液各20 μL涂片，濕盒內(nèi)37℃孵育30 min，室溫干燥后瑞氏染液染色。顯微鏡下觀察吞噬情況，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率=（吞噬白假絲酵母菌的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)）× 100%；吞噬指數(shù)=巨噬細(xì)胞吞噬白假絲酵母菌的總數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4艾葉多糖對小鼠免疫器官重量的影響無菌操作取出小鼠的胸腺和脾臟，剪去脂肪和筋膜組織，置于無菌培養(yǎng)皿中用電子天平精確稱取小鼠胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾（胸腺）指數(shù)，脾（胸腺）指數(shù)=脾（胸腺）質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.2.5艾葉多糖對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響采用MTT法測定。用Hank’s液沖洗出脾細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度為2×106/mL。將調(diào)好的脾細(xì)胞懸液和植物凝集素（PHA）（終濃度為50 μg/mL）各100 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)3 d，終止培養(yǎng)前4 h加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入三聯(lián)液100 μL，過夜后用酶標(biāo)儀測量OD570值。1.2.6艾葉多糖對小鼠抗體生成的影響采用ELISA雙抗體夾心法測定血清IgG，IgM，IgA水平：使用瑞典MABTECH公司的ELISA for mouse IgG， IgM，IgA kit測定，按照說明書進(jìn)行。并在酶標(biāo)儀上于405 nm處測OD值。使用ELISACalc軟件分別擬合出小鼠血清抗體IgA、IgG、IgM的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擬合方程，OD值經(jīng)擬合方程分別換算出小鼠血清抗體含量。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析，數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件。

2　結(jié)果

2.1艾葉多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響見表1。

表1　艾葉多糖對小鼠吞噬指數(shù)、吞噬百分率的影響（±s，n=10）

表1　艾葉多糖對小鼠吞噬指數(shù)、吞噬百分率的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較*P < 0.01；高劑量組與低劑量組比較**P<0.05。

組別對照組低劑量組高劑量組吞噬指數(shù)18.125±2.216 32.416±6.250*27.760±7.270**吞噬百分率15.156±2.099 24.946±4.193*21.719±2.246**

與對照組比較，艾葉多糖高、低劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)均增大（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤以低劑量組增加明顯。

2.2艾葉多糖對小鼠免疫器官重量的影響見表2。

表2　艾葉多糖對小鼠免疫器官重量/體重比值的影響（±s，n=10）

表2　艾葉多糖對小鼠免疫器官重量/體重比值的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較*P < 0.01，**P < 0.05；高劑量組與低劑量組比較***P>0.05。

組別對照組低劑量組高劑量組脾指數(shù)/(mg/g) 1.701±0.320 2.050±0.148**2.231±0.257***胸腺指數(shù)/(mg/g) 1.221±0.132 2.354±0.476*2.585±0.546***

艾葉多糖高、低劑量組與對照組比較，小鼠脾指數(shù)增大（P<0.05）、胸腺指數(shù)增大（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并隨劑量增大作用增強(qiáng)。

2.3艾葉多糖對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響見表3。艾葉多糖高、低劑量組與對照組比較，小鼠脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)OD值增大（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3　艾葉多糖對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n=10）

表3　艾葉多糖對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n=10）

注：與對照組相比*P<0.01；高劑量組與低劑量組比較**P>0.05。

組別對照組低劑量組高劑量組1 0.352 0.449 0.468 2 0.359 0.431 0.435 3 0.345 0.453 0.388 OD5704 0.396 0.451 0.446 5 0.376 0.404 0.402 6 0.369 0.425 0.403 7 0.365 0.391 0.405 8 0.345 0.449 0.435 9 0.376 0.431 0.402 10 0.361 0.428 0.442 xˉ±s 0.365±0.016 0.429±0.023 0.424±0.028

2.4艾葉多糖對小鼠抗體生成的影響見表4。

表4　艾葉多糖對小鼠血清IgA、IgG、IgM含量的影響（±s，n=10）

表4　艾葉多糖對小鼠血清IgA、IgG、IgM含量的影響（±s，n=10）

注：與對照組比較*P<0.01；高劑量組與低劑量組比較**P<0.01。

組別對照組低劑量組高劑量組IgA/( ng/mL) 134.596±0.953 137.734±0.862*140.344±0.828**IgG/( ng/mL) 107.280±0.994 119.584±0.876*130.483±0.777**IgM/( ng/mL) 277.450±0.835 280.818±0.921*287.649±0.829**

艾葉多糖高、低劑量組與對照組比較，小鼠血清IgA、IgG、IgM含量上升（P<0.01）；高劑量組與低劑量組比較變化相同（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

免疫包括特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫又包括細(xì)胞免疫和體液免疫。機(jī)體的免疫功能包括免疫防御：防止外界病原體的入侵及清除已入侵的病原體；免疫監(jiān)視：發(fā)現(xiàn)和清楚體內(nèi)的“非己”成分，主要是清除衰老、凋亡細(xì)胞和抗腫瘤作用；免疫自身穩(wěn)定：通過自身免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)兩種主要的機(jī)制來達(dá)到免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有十分密切的關(guān)系，當(dāng)宿主免疫功能低下或受抑制時(shí)，易發(fā)生腫瘤，而在腫瘤進(jìn)行性生長時(shí)，腫瘤患者的免疫功能也會受到腫瘤的抑制，兩者互為因果，雙方因素的消長直接影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能可提高免疫防御和免疫監(jiān)視的能力，從而增強(qiáng)機(jī)體抗感染和抗腫瘤的能力。目前，大量的實(shí)驗(yàn)研究證明多糖對機(jī)體的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫有廣泛的影響〔5-10〕。多糖作為生物免疫調(diào)節(jié)劑，主要通過以下幾個(gè)途徑作用于人體的免疫系統(tǒng)：激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活化Tc細(xì)胞，提高B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量與活性等〔11-12〕。

本研究在提取艾葉多糖基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了小鼠體內(nèi)的免疫活性研究。非特異性免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬和清除，因而巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬百分比率的高低可以反映其吞噬功能的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾葉多糖能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，尤以低劑量組增加明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示艾葉多糖能促進(jìn)小鼠非特異性免疫功能。實(shí)驗(yàn)組胸腺、脾臟與對照組相比質(zhì)量均增大，并隨劑量增大作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05～0.01），表明艾葉多糖能夠促進(jìn)小鼠脾臟細(xì)胞的增殖，增加小鼠抗體生成器官脾臟及胸腺的重量，提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。與文獻(xiàn)報(bào)道艾葉多糖能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的非特異性吞噬功能結(jié)果一致〔13〕。脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組OD570均較對照組增高，表明艾葉多糖能促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，提示艾葉多糖可作用于免疫細(xì)胞而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，但高劑量組與低劑量組在實(shí)驗(yàn)所用濃度值時(shí)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過對對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體IgA、IgG、IgM含量的測定，結(jié)果顯示艾葉多糖能增加小鼠抗體生成，表明艾葉多糖能促進(jìn)小鼠的體液免疫功能。

研究結(jié)果提示，艾葉多糖對小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有增強(qiáng)作用，為進(jìn)一步開發(fā)利用艾葉資源提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［參考文獻(xiàn)］

〔1〕梅全喜，徐景遠(yuǎn).艾葉的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（8）：513-514．

〔2〕譚冰，嚴(yán)煥寧，黃鎖義，等.艾葉多糖的提取、含量測定及對羥自由基清除作用的研究〔J〕.中國執(zhí)業(yè)藥師，2012，9 （3）：10-13．

〔3〕黃飛，梁智群.對山楂葉中多糖活性成分的分離提取研究〔J〕.廣西輕工業(yè)，2006（6）：45-46．

〔4〕AHMED H M，YEH J Y，TANG Y C，et al. Molecular screening of Chinese medicinal plants for progestogenic and anti-progestogenic activity〔J〕. Journal of Biosciences，2014，39（3）：453-461．

〔5〕朱茂祥，周平坤.貧鈾的健康影響研究進(jìn)展〔J〕.輻射防護(hù)通，2009，29（5）：25-29．

〔6〕劉晶，李蓉，于水，等.生物樣本鈾的放射化學(xué)分析方法改進(jìn)研究〔J〕.中國輻射衛(wèi)生，2008，17（4）：480-481．

〔7〕LAI C Y，HUNG J T，LIN H H，et al. Immunomodulatory and adjuvant activities of a polysaccharide extract of gano?derma lucidum in vivo and in vitro〔J〕. Vaccine，2010，28 （31）：4945-4954.

〔8〕HOLDERNESS J，SCHEPETKIN I A，F(xiàn)REEDMAN B，et al. Polysaccharides isolated from acai fruit Induce innate immune responses〔J〕. PLoS One，2011，6（2）：17301-17304.

〔9〕WANG H，DENG X，ZHOU T，et al. The in vitro immuno?modulatoryactivityofapolysaccharideisolatedfromkadsura marmorata〔J〕. Carbohydrate Polymers，2013，97（2）：710-715．

〔10〕CHENG B H，CHAN J Y，CHAN B C，et al. Structural characterization and immunomodulatory effect of a poly?saccharide HCP-2 from Houttuynia cordata〔J〕. Carbohy?drate Polymers，2014，103：244-248．

〔11〕何朝勇.多糖的免疫調(diào)節(jié)作用綜述〔J〕.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（4）：62- 64．

〔12〕HAN Q，LING Z J，HE P M. Immunomodulatory and anti?tumor activity of polysaccharide isolated from tea plant flower〔J〕. Progress in Biochemistry and Biophysics，2010，37（6）：646-653．

〔13〕余桂朋，尹美珍，黃志，等.艾葉多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及NO生成的影響〔J〕.湖北理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28（5）：54-58．

（責(zé)任編輯董杰）

Effect of Polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi on Immune Function in Mice

Luo Xuan1, Hu Changmeng1, Shen Yuanjuan1, Zhang Shaofei1, Luo Qiulin1, Deng Duwei1, Bai Li1,2*
（1. Pre-clinical College, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 2. Key Laboratory of Insect Biological and Pharmaceutical Research of Yunnan Province, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

〔Abstract〕Objective：To research the effect and mechanism of polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi Folium on immune function in mice. Methods: Mice were random divided into low dose, high dose and control group; 2 doses of polysaccharide of Folium Artemisiae Argyi and control medicine were administered orally to mice for 10 consecutive days. Then, the mice were executed, the weight of body, spleen and thymus, as well as the spleen and thymus index were measured. The phagocytosis of mice peritoneal macrophage was tested on Candida albicans. The change of cell- mediate immunity in the mice was determinated by splenic T lymphocyte proliferation assay. The serum level of immunoglobulin in the mice was detected by ELISA. Results: The polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi increased the weight of immune organs, strengthened the phagocytosis of macrophage, the ability of B cell to produce antibodies and the proliferative ability of splenic T lymphocytes in mice. Conclusion: The polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi could regulate mice immune function by increasing non-specific immune, cellular immunity and humoral immunity.

〔Key words〕polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi; mouse; immune function

［中圖分類號］R392

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］1672-2345（2016）02-0015-04

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360319）；大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2014062）

［收稿日期］2015-06-17

［作者簡介］羅旋，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)2011級本科生.

*通信作者：白麗，教授，博士．