孫凱建，陳琳琳，王雅文

沈陽市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽 110021

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*通信作者

貝伐單抗抑制角膜新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究

孫凱建*，陳琳琳，王雅文

沈陽市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽 110021

[摘要]目的觀察貝伐單抗在抑制角膜新生血管形成中的作用，并探討其機(jī)制。方法將64只新西蘭大白兔分為實(shí)驗(yàn)組(32只)及對照組(32只)，采用堿燒傷法進(jìn)行角膜新生血管形成(CNV)造模,實(shí)驗(yàn)組給予角膜下注射貝伐單抗，對照組給予生理鹽水角膜下注射，觀察角膜水腫程度、CNV面積及長度，Western印跡法檢測VEGF、IL-8及PIGF在角膜中的表達(dá)水平。結(jié)果角膜水腫程度：在造模24 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模21 d后，實(shí)驗(yàn)組輕于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模3、7、14及21 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組CNV面積、平均長度均明顯小于對照組(P<0.05或P<0.01)。Western blot顯示，VEGF在角膜中蛋白水平表達(dá)，對照組高于實(shí)驗(yàn)組(t=11.516，P<0.01)；對照組與實(shí)驗(yàn)組PIGF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.29，P>0.05)；IL-8在對照組中表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組(t=4.49，P<0.05)。結(jié)論貝伐單抗可通過降低角膜中VEGF及IL-8表達(dá)有效抑制角膜水腫及新生血管形成。

[關(guān)鍵詞]貝伐單抗；角膜新生血管形成；堿燒傷法

0引言

角膜新生血管(Corneal neovascularization,CNV)以角膜內(nèi)病理性血管生成為特點(diǎn)，對視力可能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，也是多種外眼疾病共同的病理轉(zhuǎn)歸[1]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)無論在正常機(jī)體還是在病理情況下，均是血管生成的重要誘發(fā)及刺激因子，有研究認(rèn)為，VEGF在CNV病理過程中可能也發(fā)揮重要作用[2]。貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin)是一種抗VEGF藥物，其在CNV中應(yīng)用的研究較少。本研究通過堿燒傷法建立大鼠CNV模型，給予貝伐單抗結(jié)膜下注射，并通過Western blot法對角膜VEGF蛋白水平表達(dá)進(jìn)行檢測，觀察貝伐單抗對VEFG表達(dá)的影響及CNV的作用，并探其機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康新西蘭大白兔64只，無眼部疾病，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供并飼養(yǎng)，體重(2.01±0.93)kg。貝伐單抗(美國基因技術(shù)研究公司)，VEGF多克隆抗體、IL-8單克隆抗體、PIGF多克隆抗體、辣根過氧化物酶，BCA蛋白定量試劑盒，均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程均符合國家科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，無倫理學(xué)爭議。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立、干預(yù)及標(biāo)本采集64只兔隨機(jī)分為對照組及實(shí)驗(yàn)組，每組32只，均取右眼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CNV模型兔制備方法參照文獻(xiàn)方法[3]。模型對照組及貝伐單抗組32只兔采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的丁卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉，對眼前段表面進(jìn)行充分顯露，徑5.0 mm的單層圓形濾紙片以1 mol/L NaOH溶液浸濕至飽和狀態(tài)，濾紙片置于大鼠角膜中央，灼燒40 s，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊1 min。依據(jù)Meeh-Rubner方法計(jì)算劑量，造模后實(shí)驗(yàn)組立即給予貝伐單抗0.1 mg球結(jié)膜下注射，對照組給予生理鹽水0.1 mg球結(jié)膜下注射，所有實(shí)驗(yàn)兔每日給予妥布霉素滴眼液點(diǎn)眼3次，預(yù)防感染。裂隙燈每日觀察CNV生長情況，于造模后3、7、14、21 d測量計(jì)算CNV生長面積(A)，計(jì)算公式：A=C/12×3.141 6[r2-(r-l)2]，C是新生血管累及角膜圓周鐘點(diǎn)數(shù)，l是新生血管自角膜緣長入角膜最長一直血管長度，r是角膜的半徑。于造模后21 d處死所有動(dòng)物，取兔角膜，行Western blot。采用Dickey標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行角膜水腫分級。所有動(dòng)物無實(shí)驗(yàn)中脫落。

1.2.2Western blot法檢測兔角膜組織中VEGF、IL-8及PIGF蛋白水平的表達(dá)按說明書操作步驟提取角膜組織總蛋白，BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，樣品定量為6 g/L，每條泳道上樣蛋白量為50 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓70 V，電泳80 min，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗，ECL發(fā)光后以凝膠顯像儀顯像。

2結(jié)果

2.1角膜水腫程度造模24 h后，實(shí)驗(yàn)組角膜水腫程度與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.163)，見表1。造模21 d后，實(shí)驗(yàn)組多為Ⅰ、Ⅱ級水腫，對照組多為Ⅱ、Ⅲ級水腫，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)，見表2。

2.2CNV面積及長度造模24 h后，模型對照組角膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)張充血，3 d時(shí)角膜出現(xiàn)侵入血管，血管網(wǎng)狀密集，直徑較為粗大，長度較長，NV侵入部分燒傷區(qū)，8～10 d開始血管生長速度明顯增快，進(jìn)入高峰。12～16 d NV生長減速，回縮。造模24 h后，實(shí)驗(yàn)組角膜血管網(wǎng)出現(xiàn)擴(kuò)張充血，但較模型對照組輕微，3 d時(shí)角膜出現(xiàn)CNV，血管網(wǎng)密度較低，血管直徑較細(xì)。在造模3、7、14及21 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組CNV面積均明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表3；在造模3、7、14及21 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組CNV平均長度均明顯短于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表4。

表1　造模24 h后兩組角膜水腫程度

表2　造模21 d后角膜水腫程度

表3　不同時(shí)間CNV面積

表4　不同時(shí)間CNV平均長度

2.3Western blot法檢測VEGF、IL-8、PIGF的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，在42 kDa處有灰色條帶顯示，為VEGF在角膜中蛋白水平表達(dá)，對照組中表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.516，P<0.01)；18 kDa處有灰色條帶顯示，為PIGF在角膜組織中表達(dá)，對照組與實(shí)驗(yàn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.29，P>0.05)；在8 kDa處有灰色條帶顯示，為IL-8在角膜中蛋白水平表達(dá)，對照組中表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.49，P<0.05)，見圖1。

圖1　Western blot檢測VEGF、PIGF及IL-8在角膜中蛋白水平表達(dá)

3討論

角膜新生血管是導(dǎo)致視力減退及失明的嚴(yán)重眼病之一，其中視力減退的發(fā)生率約為1/10[4]。VEGF是導(dǎo)致角膜新生血管的重要啟動(dòng)及驅(qū)動(dòng)因子，VEGF無論在腫瘤新生血管還是組織病理或生理新生血管形成中均發(fā)揮著重要作用，VEGF、PIGF及IL-8均為重要的促血管生成因子[5]。IL-8及其下游信號(hào)通路可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成反應(yīng)。針對血管生成中靶因子的藥物是抑制新生血管形成的重要治療手段。

貝伐單抗是VEGF抑制劑，是人源化單克隆抗體，目前作為抑制腫瘤血管生成的藥物在多種腫瘤中得到應(yīng)用[6-7]。目前，角膜新生血管的治療無論是局部滴用糖皮質(zhì)激素或非甾體類抗炎藥，或?qū)π律苓M(jìn)行激光、電凝、光凝及光動(dòng)力等物理療法，均不能得到良好的效果，而且，在這些理化因素的刺激下，CNV可能會(huì)進(jìn)一步加重[8-9]。貝伐單抗在CNV中應(yīng)用的研究目前較少。貝伐單抗可與VEGF結(jié)合，并抑制其與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而抑制新生血管的形成、生長及蔓延成網(wǎng)[10]。

本研究建立了兔CNV模型，并采用角膜下注射貝伐單抗的方式觀察其在CNV病理過程中所發(fā)揮的作用，結(jié)果顯示，角膜水腫程度造模24 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無差別，但在造模21 d后，實(shí)驗(yàn)組角膜水腫消退明顯，Ⅲ、Ⅳ級水腫多降為Ⅰ、Ⅱ級水腫，而對照組改善沒有實(shí)驗(yàn)組明顯。有研究表明，VEGF、PIGF及IL-8在損傷早期在組織間液或毛細(xì)血管網(wǎng)中顯著升高，進(jìn)而出現(xiàn)組織充血水腫等病理反應(yīng)[11]。本研究顯示，貝伐單抗在組織損傷早期并不能減輕水腫反應(yīng)，說明VEGF等炎性因子的激發(fā)過程不能被阻斷在組織損傷早期，而且早期VEGF在充血水腫過程中并不是主導(dǎo)因子，但在中后期炎癥因子水平下降后，VEGF的產(chǎn)生被貝伐單抗抑制，從而使組織水腫程度下降。造模后實(shí)驗(yàn)組角膜血管網(wǎng)擴(kuò)張充血程度明顯低于對照組，實(shí)驗(yàn)組CNV血管網(wǎng)密度較低，血管直徑較細(xì)，CNV平均長度明顯短于對照組。說明在貝伐單抗作用下，CNV在口徑、數(shù)量及長度等方面均明顯受到抑制。Western blot顯示，對照組VEGF及IL-8在角膜中蛋白水平表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組，PIGF在對照組與實(shí)驗(yàn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。已經(jīng)有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，貝伐單抗對VEGF有抑制作用[12]，但對IL-8抑制作用的研究較少。本研究顯示，貝伐單抗在抑制VEGF的同時(shí)，對IL-8也具有抑制作用，但該作用是VEGF下游通路導(dǎo)致IL-8受到抑制，還是有其他信號(hào)通路直接參與，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

本研究通過兔CNV模型觀察了貝伐單抗對CNV的抑制作用，實(shí)驗(yàn)表明，貝伐單抗對CNV血管形成具有明顯的抑制作用，通過抑制VEGF及IL-8蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

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Inhibition effect of bevacizumab on corneal neovascularization

SUN Kai-jian*,CHEN Lin-lin,WANG Ya-wen

(Department of Ophthalmology,the Fourth People′s Hospital of Shenyang,Shenyang 110021,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the inhibiting effect of bevacizumab on corneal neovascularization and discuss the mechanism.MethodsA total of 64 New Zealand white rabbits were divided into experimental group (n=32) and control group (n=32),and CNV (corneal neovascularization) model was made by alkaline burning method.Bevacizumab or normal saline was given by subconjunctival injection in experimental group and control group respectively,and then corneal edema degree,CNV area and length were observed.VEGF,IL-8 and PIGF expressed at protein level in cornea were detected by Western blot assay.ResultsNo significant difference was found in the corneal edema degree between experimental group and control group after 24 h(P>0.05).The corneal edema degree in experimental group was milder than that in control group after 21 d(P<0.05)；CNV area and length after 3,7,14 and 21 d in experimental group were smaller than those in control group(P<0.05 or P<0.01).Western blot showed VEGF in control group was higher than those in experimental group(t=11.516，P<0.01)；PIGF expression was the same in the two groups(t =1.29，P>0.05);IL-8 in control group was higher than that in experimental group(t=4.49，P<0.05) ConclusionBevacizumab may inhibit the corneal edema and CNV by decreasing the expression of VEGF and IL-8.

Key words：Bevacizumab;Corneal neovascularization；Alkaline burning method

收稿日期：2015-07-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604007