李冬梅，張元媛，徐　麗，曹軍平

武警總醫(yī)院a.藥劑科，b.消毒供應(yīng)科，北京 100039

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*通信作者

槲皮素對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

李冬梅a，張元媛a，徐麗a，曹軍平b*

武警總醫(yī)院a.藥劑科，b.消毒供應(yīng)科，北京 100039

[摘要]目的探討槲皮素(QU)對心肌缺血再灌注(MI/R)損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法采用結(jié)扎左冠脈前降支30 min再灌注2 h的方法復(fù)制MI/R損傷大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、QU組(25、50、100 mg/kg)，每組10只，各組于術(shù)前1周開始灌胃給藥，1次/d。再灌注后取心臟，染色法測定心肌梗死面積；免疫組化法測定心肌組織NF-κB和ICAM-1表達(dá)情況；取心肌勻漿，髓過氧化物酶(MPO)法測定中性粒細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果QU高、中劑量可分別縮小心肌梗死面積至25.00%、25.31%，與模型組(32.55%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；QU各劑量組心肌MPO活力分別降低至185.70、190.66、210.03 U/g，與模型組(311.72 U/g)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；QU各劑量組心肌組織ICAM-1陽性區(qū)面積百分比分別降至32.08%、32.65%、36.42%，與模型組(42.67%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；QU高、中劑量可使心肌NF-κB的表達(dá)水平分別降低至55.23%、54.90%，與模型組(61.05%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論QU預(yù)處理可保護(hù)MI/R所致心肌損傷，其機(jī)制與抑制中性粒細(xì)胞浸潤、下調(diào)NF-κB和ICAM-1的表達(dá)等有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]槲皮素；心肌缺血再灌注損傷；中性粒細(xì)胞；細(xì)胞間黏附分子-1；核因子-κB

0引言

槲皮素(Quercetin，QU)屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中，具有多種生物學(xué)活性和重要的藥用價值，其已知藥理作用包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫抑制和心血管保護(hù)等[1]，最近研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗衰老、降血糖、抗抑郁等作用[2]，在醫(yī)藥、保健等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。近年研究證實(shí)，QU在體內(nèi)外對心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的心肌組織具有保護(hù)效應(yīng)[3-4]，然而其機(jī)制尚不清楚。本研究應(yīng)用MI/R損傷大鼠模型，擬探討QU心肌保護(hù)作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥品和試劑QU(純度≥95%)購自Sigma公司，用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成所需濃度。氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。核因子-κB(NF-κB)p65多克隆一抗、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)多克隆抗體試劑盒、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法免疫組織化學(xué)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1建立MI/R損傷模型采用冠脈結(jié)扎法建立MI/R損傷模型，參照文獻(xiàn)[5]加以改進(jìn)。取大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢連接ECG-1350P型十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)。頸部分離氣管，插入氣管插管，連接DW-3000型動物人工呼吸機(jī)(呼吸頻率60次/min，潮氣量2 mL/100 g)。順肋間隙方向于胸骨左旁第3、4肋間開胸，分別在第3、4肋上環(huán)繞1根0號手術(shù)線，牽拉手術(shù)線使肋骨撐開，暴露心臟，沿左心耳下緣冠脈前降支起始部3～4 mm處用4-0帶線縫合針穿過，進(jìn)針深度控制在0.1 cm左右，將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于結(jié)扎線下，收緊結(jié)扎線以造成心肌缺血，約30 min后(冠脈結(jié)扎成功的標(biāo)志：心電圖ST段明顯抬高或T波高聳)，松開結(jié)扎線再灌注2 h(再灌注成功的標(biāo)志：抬高的ST段下降1/2以上或高聳的T波下降)。結(jié)扎前心電圖不正常者，未到觀察終點(diǎn)而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分組和給藥將成模大鼠隨機(jī)分為QU低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg)及模型組，每組10只。另取10只大鼠，開胸但不結(jié)扎冠脈，作為假手術(shù)組。各組于術(shù)前1周開始灌胃給藥，1次/d，假手術(shù)組和模型組給予等體積0.5% CMC-Na。

1.3.3心肌梗死面積的測定取心臟，用PBS緩沖液洗后，去除心房、血管及脂肪組織，在冠脈結(jié)扎線下，從心尖起將心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌則呈藍(lán)色，圖像采集后，通過軟件ImagePro Plus 7.0測算梗死區(qū)面積和心室總面積，計算心肌梗死面積(%)[6]。

1.3.4心肌髓過氧化物酶(MPO)活力的測定取部分心臟，生理鹽水洗后，上自動勻漿機(jī)制成勻漿，3 500 r/min離心10 min得上清，采用比色法分光光度計460 nm下測定OD值，并計算MPO活力，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5心肌組織NF-κB和ICAM-1表達(dá)的測定取心臟，生理鹽水洗后，在冠脈結(jié)扎線下取心肌行冰凍切片，厚度8 μm，采用免疫組化法檢測NF-κB和ICAM-1的表達(dá)情況，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對照。圖像采集后，通過軟件ImagePro Plus 7.0分析圖像，其陽性追蹤點(diǎn)為表達(dá)于胞漿或胞核的棕黃色顆粒狀物，測量陽性染色區(qū)面積，結(jié)果用陽性區(qū)面積百分比(陽性染色區(qū)面積/視野面積)表示。

2結(jié)果

2.1QU對心肌梗死面積的影響假手術(shù)組不納入統(tǒng)計學(xué)比較；模型組大鼠心肌梗死面積達(dá)32.55%，QU高、中劑量組可分別使心肌梗死面積縮小至25.00%、25.31%，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組心肌梗死面積比較(n=10)

2.2QU對中性粒細(xì)胞浸潤的影響缺血30 min再灌注2 h后，模型組大鼠心肌MPO活力顯著升高至311.72 U/g，與假手術(shù)組(27.60 U/g)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；QU各劑量組心肌MPO活力分別降低至185.70、190.66、210.03 U/g，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，提示QU可減輕中性粒細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2　各組心肌MPO活力比較(n=10)

2.3QU對心肌ICAM-1和NF-κB表達(dá)的影響缺血30 min再灌注2 h后，模型組大鼠心肌組織ICAM-1、NF-κB的表達(dá)水平分別升高至42.67%、61.05%，與假手術(shù)組(分別為11.73%、6.29%)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；QU各劑量組心肌組織ICAM-1陽性區(qū)百分比分別降低至32.08%、32.65%、36.42%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；QU高、中劑量可使心肌組織NF-κB的表達(dá)水平分別降至55.23%、54.90%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　各組心肌ICAM-1和NF-κB表達(dá)比較(n=10)

3討論

藥物預(yù)處理可保護(hù)MI/R損傷的心肌組織，研究發(fā)現(xiàn)，此作用主要通過促使機(jī)體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)心臟對缺血、缺氧的耐受而實(shí)現(xiàn)的[7]。本研究采用缺血前給藥的方式觀察QU預(yù)處理對MI/R損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，QU(50、100 mg/kg)能顯著縮小心肌梗死面積，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示QU對MI/R損傷大鼠具有一定的心肌保護(hù)作用。

MI/R損傷是一個包括中性粒細(xì)胞活化、多種細(xì)胞因子及黏附分子過度表達(dá)、伴有多種炎性介質(zhì)及信號傳導(dǎo)分子參與的復(fù)雜過程，研究表明，以中性粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥是造成MI/R損傷的重要因素之一[8]，更有學(xué)者認(rèn)為MI/R損傷是“中性粒細(xì)胞依賴”[9]。MI/R發(fā)生時激活的中性粒細(xì)胞聚集到心肌組織，通過一系列病理機(jī)制造成心肌細(xì)胞的損傷和功能的喪失，如：釋放炎性介質(zhì)、細(xì)胞毒性產(chǎn)物，直接損傷心肌；黏附于微循環(huán)，阻塞毛細(xì)血管，造成“無復(fù)流現(xiàn)象”；釋放氧自由基，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等[10]。通過對大鼠MI/R心肌組織的中性粒細(xì)胞進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其含量較正常心肌組織顯著升高，且在再灌注2 h時達(dá)到峰值[11]。研究證實(shí)，抑制中性粒細(xì)胞浸潤能顯著降低MI/R損傷的程度，抗中性粒細(xì)胞治療有可能成為防治MI/R的有效措施[8,12]。MPO酶為中性粒細(xì)胞所特有，通過分析該酶的活力，可判斷中性粒細(xì)胞浸潤的程度。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注后MPO活性顯著升高，提示中性粒細(xì)胞浸潤明顯；QU預(yù)處理可使心肌MPO活性明顯下降(P<0.05，P<0.01)，提示QU可通過抑制心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤、減輕炎癥反應(yīng)來保護(hù)受損的心肌組織。

黏附分子ICAM-1(CD54)屬免疫球蛋白超家族成員，存在于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等細(xì)胞表面[13]。ICAM-1在MI/R損傷的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤的最重要因素之一。有研究表明，生理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞僅表達(dá)極少量的ICAM-1，但當(dāng)MI/R發(fā)生時，在多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的作用下，心肌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量會成倍增加[14]。ICAM-1在心肌細(xì)胞的高表達(dá)可刺激中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞對心肌組織的浸潤，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損、死亡[15]。崔世濤等[16]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用ICAM-1單抗可抑制中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，減少中性粒細(xì)胞在心肌內(nèi)積聚，改善心肌灌注，減少心肌損傷。唐旭東等[17]在MI/R損傷家兔模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的表達(dá)在再灌注120 min開始增高，并與中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)升高有相關(guān)性。Benson等[18]認(rèn)為，ICAM-1有可能會成為防治心肌缺血疾病的一個理想靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，冠脈結(jié)扎30 min再灌注2 h后，心肌組織ICAM-1表達(dá)明顯升高，與上述文獻(xiàn)報道結(jié)論一致；QU各劑量可使心肌組織ICAM-1的表達(dá)陽性區(qū)百分比顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，提示QU通過抑制ICAM-1表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞向心肌細(xì)胞浸潤，從而減輕心肌組織損傷。

NF-κB廣泛存在于各種類型細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞)中，作為一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種炎癥相關(guān)蛋白基因的表達(dá)[19]。生理?xiàng)l件下，NF-κB以非活性狀態(tài)存在于胞漿中，當(dāng)MI/R發(fā)生時，NF-κB得以活化，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，如ICAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6等。這些炎癥介質(zhì)可促使中性粒細(xì)胞在心肌缺血區(qū)血管中黏附、聚集，并浸潤心肌組織，造成血管及心肌損傷；上述炎癥介質(zhì)又會進(jìn)一步激活NF-κB，形成惡性循環(huán)[20]。楊銳等[21]觀察了大鼠心肌缺血的不同再灌注時程N(yùn)F-κB p65蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，NF-κB p65蛋白表達(dá)量于再灌注60 min時達(dá)高峰，再灌注120 min時依然維持在高水平。Li等[22]研究表明，抑制NF-κB活性后，MI/R大鼠心肌損傷的程度明顯減輕。由此可見，NF-κB被激活啟動多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)是MI/R損傷的重要機(jī)制之一。本研究觀察顯示，冠脈結(jié)扎30 min再灌注2 h后，心肌組織NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著增加，與模型組比較，QU高、中劑量(50、100 mg/kg)可使心肌組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示QU通過抑制NF-κB活性，抑制其下游調(diào)控基因的表達(dá)，這可能是QU心肌保護(hù)作用機(jī)制的一個方面。

綜上，QU預(yù)處理可下調(diào)黏附分子ICAM-1表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞浸潤，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性，緩解缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對MI/R損傷心肌的保護(hù)作用。

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Study of protective effect and the mechanisms of quercetin on myocardial ischemia/reperfusion injury

LI Dong-meia,ZHANG Yuan-yuana,XU Lia,CAO Jun-pinb*

(a.Department of Pharmacy,b.Department of Sterilization and Supply,General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect and the mechanisms of quercetin (QU) on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury.MethodsRat model of MI/R injury was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.The rats were divided randomly into 5 groups (n=10): sham group,model group,QU groups (25,50,100 mg/kg).QU was orally administered once daily since 7 d before operation.The area of myocardial infarction was recorded after reperfusion.The myocardial ICAM-1 and NF-κB activities were detected by immunohistochemistry.The MPO activity in heart homogenate was detected.ResultsThe area of myocardial infarction in QU (50,100 mg/kg) groups was reduced respectively,there being significant difference between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).The MPO activity in QU groups was lower than that of model group (P<0.05,P<0.01).The ICAM-1 positive rates of heart in QU groups decreased (P<0.05,P<0.01).The NF-κB positive rates in QU (50,100 mg/kg) groups decreased,and there were significant differences between QU (50,100 mg/kg) groups and model group (P<0.05).ConclusionQU pretreatment can protect against MI/R injury by the inhibition of neutrophil infiltration and down-regulation of ICAM-1 and NF-κB expression.

Key words：Quercetin;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Neutrophil;ICAM-1;NF-κB

收稿日期：2015-07-14

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604005