冉來虎，馬紅珍（.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州30053；.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江杭州30006）

?

黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及其機制

冉來虎1，馬紅珍2
（1.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江杭州310006）

摘要目的：觀察黃芪甲苷（AS-IV）對糖尿病腎病（DN）大鼠血糖、尿微量白蛋白、血清總蛋白、白蛋白、血清脂聯(lián)素水平的影響及對腎臟的保護作用。方法：40只清潔級雄性SD大鼠分為正常組、模型組、黃芪甲苷低劑量組及黃芪甲苷高劑量組各10只。予鏈脲佐菌素造模，治療8 w后處死大鼠取材及采血，取腎皮質(zhì)行電鏡觀察，并檢測血糖、尿微量白蛋白、血清總蛋白、白蛋白及脂聯(lián)素水平。結(jié)果：與模型組比較，治療后黃芪甲苷組血糖、尿微量白蛋白水平明顯下降（P＜0.05），血清總蛋白、白蛋白及血清脂聯(lián)素水平明顯增加。結(jié)論：AS-IV對DN腎臟有明顯保護作用，能降低血糖和尿白蛋白排泄量，改善低蛋白血癥，升高血清脂聯(lián)素水平，從而延緩糖尿病腎病的進展，其作用機制可能與上調(diào)血清脂聯(lián)素水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞糖尿病腎病；黃芪甲苷；脂聯(lián)素；足細胞

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及到遺傳背景、糖代謝紊亂、血流動力學、血液流變學、炎癥、氧化應(yīng)激及其他因素如足細胞損傷等［1-3］。有研究表明糖尿病腎病患者尿中丟失的足細胞數(shù)和尿蛋白量呈正相關(guān)［4］，這提示足細胞對腎小球基底膜的黏附失常與脫落，是DN蛋白尿發(fā)生的主要原因之一。近幾年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素水平的降低與足細胞損傷及丟失在糖尿病腎病進展過程中起著重要作用。因此，本實驗通過黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）對糖尿病腎病大鼠進行干預(yù)，探討其對DN病變時血糖、蛋白尿及血清脂聯(lián)素水平的影響及血清脂聯(lián)素與糖尿病腎病之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物健康清潔級雄性Sprague-DawLey （SD）大鼠，共40只，體重（250±10）g，購于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，醫(yī)學動物許可證號碼：SCXK（滬）2013-0016，全封閉SPF狀態(tài)下隔離標準飼料飼養(yǎng)。

1.1.2藥品與儀器黃芪甲苷購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（98%干粉，MB1955），鏈脲佐菌素（98%干粉，批號Sigma S0130）購自Sigma公司。血糖儀為羅氏（Roche）產(chǎn)品，7020全自動生化分析儀為日立股份有限公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1造模與給藥40只SD大鼠購回后飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心清潔級動物房，先予標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，稱重，經(jīng)尿糖及尿蛋白試紙測試陰性后隨機分為4組：正常組、模型組、黃芪甲苷低劑量組及黃芪甲苷高劑量組各10只。參照文獻［5-7］的方法，造模前予禁食不禁水12 h，正常組10只腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其余30只予鏈脲佐菌素（STZ）按65 mg/kg一次性腹腔注射，注射前在4℃環(huán)境下將1 000 mg STZ粉末溶解于50 mL 0.1 M無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH= 4.5），現(xiàn)用現(xiàn)配，避光，15 min內(nèi)用完。72 h后大鼠尾尖采血測空腹血糖，連續(xù)3 d，空腹血糖＞16.7 mmoL/L，或隨機血糖＞22.2 mmoL/L，尿糖定性強陽性，尿量大于正常組的150%，并持續(xù)上述指標保持不變，確定糖尿病模型形成。模型形成后開始干預(yù)治療：黃芪甲苷低、高劑量組分別予黃芪甲苷懸浮液灌胃，用量為2.5 mg/（kg·d）和5 mg/（kg·d），每日1次。正常組和模型組每日1次予等體積的蒸餾水灌胃。實驗期間，所有實驗動物均給予標準飼料飲食及飲水，自由攝取。在治療過程中模型組有1只因不能耐受而死亡，其余各組大鼠未出現(xiàn)死亡情況。

1.2.2檢測指標血、尿指標：實驗過程中剪尾采血測血糖及留取24 h尿液測定24 h尿微量白蛋白，實驗8 w結(jié)束時大鼠麻醉后腹主動脈取血留取血標本，分離血清，-20℃保存檢測血清脂聯(lián)素及其他指標。腎臟組織電鏡觀察：對腎皮質(zhì)行透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)情況。

1.3統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件包進行處理，計量資料采用單因素方差分析（one way ANOVA），進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1治療前后各組大鼠血糖變化

結(jié)果見表1。

表1　治療前后各組大鼠血糖變化情況（mmol/L?±s）

由表1可見，與正常組比較，模型組大鼠血糖升高（P＜0.01），表明造模成功。與模型組比較，黃芪甲苷低、高劑量組血糖水平明顯降低（P＜0.05），說明黃芪甲苷對血糖有一定的控制作用。

2.2治療后各組大鼠24 h尿微量白蛋白、總蛋白、白蛋白、血清脂聯(lián)素變化比較

結(jié)果見表2。

表2　治療后各組大鼠24 h尿微量白蛋白水平變化情況?。?±s）

與正常組比較，各組大鼠24 h尿微量白蛋白含量上升，總蛋白、白蛋白含量下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；黃芪甲苷低、高劑量組血清脂聯(lián)素含量顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組血清脂聯(lián)素含量亦上升，但差異無統(tǒng)計學意義。

與模型組比較，黃芪甲苷低、高劑量組24 h尿微量白蛋白明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組總蛋白、白蛋白、血清脂聯(lián)素含量明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組上述指標亦上升，但差異無統(tǒng)計學意義。表明黃芪甲苷能降低24 h尿微量白蛋白水平，升高血清脂聯(lián)素水平，改善低蛋白血癥。

2.3透射電鏡腎臟組織結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡下可見正常組大鼠足細胞結(jié)構(gòu)完整，足突清晰附著于毛細血管基膜上，分布均勻，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無融合及脫落。模型組見腎小球系膜細胞及系膜基質(zhì)增生，基膜皺縮，初級突起變短，足突消失，有些見足突融合。黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷高劑量組上述病變不同程度得到改善。結(jié)果見圖1。

3討　論

圖1　透射電鏡腎臟組織結(jié)構(gòu)觀察

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因，其發(fā)病機制涉及廣泛，至今尚未完全闡明，其中足細胞在糖尿病腎病進展過程中的作用越來越受到人們的重視，足細胞的損傷及丟失能夠?qū)е碌鞍啄虻陌l(fā)生及糖尿病腎病的進一步惡化。足細胞是附著于腎小球基底膜外高度分化的細胞，其作為腎小球濾過屏障中重要的組成部分，具有濾過屏障及修復(fù)腎小球基底膜作用［8］。相鄰足細胞的足突彼此交叉嵌合，構(gòu)成約40 nm的裂孔，裂孔隔膜相互連接裂孔，構(gòu)成阻止蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)濾過的最后屏障。其中，裂孔隔膜是連接相鄰足細胞足突間的特殊蛋白復(fù)合體，Nephrin是裂孔隔膜上的一個跨膜蛋白分子，具有維持足細胞結(jié)構(gòu)及維持濾過屏障的作用［9］。另一種裂孔隔膜跨膜蛋白CD2AP與Nephrin共同維持足細胞的結(jié)構(gòu)功能。大量臨床及實驗研究表明，在糖尿病腎病患者中這兩種蛋白分子及Nephrin mRNA的表達顯著下降［10］。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素的缺乏會引起足細胞的損害及丟失，導(dǎo)致蛋白尿的增加及糖尿病腎病的惡化［11］。

在人體脂聯(lián)素（adiponectin，APN）以三聚體、六聚體及多聚體的形式存在于血漿之中，其活性形式為高分子量聚合物。脂聯(lián)素通過脂聯(lián)素受體1和脂聯(lián)素受體2作用于機體［12］。脂聯(lián)素受體1在所有組織中整體表達，其中，骨骼肌的表達是最豐富的。脂聯(lián)素受體2存在于肝臟、腎臟、骨骼肌，而以肝臟中表達最豐富［13］。Guo X等［14］研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素可減少糖尿病腎病小鼠因血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）刺激引起的腎組織TGF-β1、纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）、纖連蛋白（FN）表達水平，減輕腎小球病變。?？鞓返龋?5］研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦聯(lián)合貝那普利可顯著提高早期糖尿病腎病患者血清脂聯(lián)素水平，保護腎功能，降低24 h尿蛋白定量水平。另有實驗發(fā)現(xiàn)，ADPN基因敲除的小鼠可出現(xiàn)足細胞數(shù)目的減少，足突的融合、消失，并且出現(xiàn)蛋白尿；而ADPN的增加可通過激活A(yù)MPK途徑，減輕足細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少足細胞的損失，并進一步修復(fù)足細胞的功能，減少蛋白尿［16］。此外，有研究證實，脂聯(lián)素能夠通過多種通路如抑制糖基化終末產(chǎn)物［17］、改善胰島素抵抗和糖代謝紊亂緩解足細胞損傷，保護腎臟［18］。

黃芪甲苷為黃芪的單體，是其主要作用成分。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾、肝、腎經(jīng)，據(jù)《本草綱目》記載黃芪具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿之功。黃芪能擴張腎血管，增加腎血流量，保護腎臟血管內(nèi)皮細胞功能，減少蛋白尿［19］，是治療各種腎臟病的常用中藥。以黃芪為主藥的補中益氣湯、參芪地黃湯等均是治療慢性腎臟病的常用方劑。陳紅波等［20］研究發(fā)現(xiàn)以黃芪為君藥的參芪地黃湯能夠通過上調(diào)腎組織Nephrin和Podocin表達，減輕足細胞損傷，起到保護腎臟的作用。而糖尿病腎病大鼠血清脂聯(lián)素水平及腎組織AdiopR1表達的降低與足細胞損傷及尿蛋白排泄率增加有直接關(guān)系。黃芪是參芪地黃湯君藥，黃芪甲苷是黃芪的主要作用成分。因此，通過深入研究黃芪甲苷治療糖尿病腎病的機制及途徑可為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。本實驗研究顯示，經(jīng)過黃芪甲苷治療后，高劑量治療組大鼠模型24 h尿微量白蛋白定量及血糖下降，血清脂聯(lián)素水平明顯升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜上所述，黃芪甲苷有效改善尿蛋白、糾正低蛋白血癥等方面作用可能與上調(diào)血清脂聯(lián)素水平有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

參考文獻

［1］Kato M，Zhang J，Wang M，et al.MicroRNA-192 in diabetic kidneyglomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（9）：3 432-3 437.

［2］Krupa A，Jenkins R，Luo D D，et al.Loss of MicroRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（3）：438-447.

［3］Putta S，Lanting L，Sung，et al.Inhibiting microRNA-192 ameliorates renal fibrosis in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（3）：458-469.

［4］郭維文，黎帥，陳玲玲，等.黃芪甲苷對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及其機制［J］.中國病理生理雜志，2014（6）：351-354.

［5］李偉，張紅，殷松樓，等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)SD大鼠糖尿病腎病模型的研究［J］.徐州醫(yī)學院學報，2006（5）：52-55.

［6］賴潔梅，周玖瑤.糖尿病腎病動物模型的研究進展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014（8）：112-115.

［7］李志杰，張悅.糖尿病腎病動物模型的研究進展［J］.生命科學，2011（9）：90-95.

［8］Satchell S C，Braet F.Glomerular endothelial cell fenestrations：an integral component of theglomerular filtration barrier［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2009，296（7）：F947-956.

［9］Roselli S，Heidet L，Sich M，et al.Earlyglomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice［J］.Mol Cell Biol，2004，24（8）：550-560.

［10］Jim B，Ghanta M，Qipo A，et al.Dysregulated nephrin in diabetic nephropathy of type 2 diabetes：a cross sectional study［J］.Plos One，2012，7（9）：e36 041.

［11］Stitt-Cavanagh E，MacLeod L，Kennedy C.The podocyte in diabetic kidney disease［J］.Scientific World Journal，2009，9（4）：1 127-1 139.

［12］Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects［J］.Nature，2003，423（7）：762-769.

［13］BaLsang A，Vieira J L，OLiveira A M，et al.Relationship between adiponectin，obesity and insulin resistance［J］.Rev Assoc Med Bras，2015，61 （10）：72-80.

［14］Guo X，Zhoug，Guo M，et al.Adiponectin retards the progression of diabetic nephropathy in db/db mice by counteracting angiotensin II［J］.Physiol Rep，2014，2（5）：e00230.

［15］?？鞓?，王海昌，孫璐，等.氯沙坦聯(lián)合苯那普利對早期糖尿病腎病患者血漿APN及hs-CRP的影響［J］.西南國防醫(yī)藥，2013（12）：830-832.

［16］Ohashi K，Iwatani H，Kihara S，et al.Exacerbation of albuminuria and renal fibrosis in subtotal renal ablation model of adiponectin-knockout mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（9）：1 910-1 917.

［17］鄧翔，沈元瓊，游詠，等.脂聯(lián)素抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的HUVEC-12細胞CD40高表達［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2010（3）：2 612-2 615.

［18］Wang Y，Tian J，Guo H，et al.Effects of adiponectin on endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis and cell cytoskeleton and its mechanism of podocytes cultured in highglucose［J］.Chinese Medical Journal，2014，94（14）：1 092-1 096.

［19］Li M，Wang W，Xue J，et al.Meta-analysis of the clinical value of Astragalus membranaceus in diabetic nephropathy［J］.J Ethnopharmacol，2011，133 （11）：412-419.

［20］陳紅波，馬紅珍，莊英，等.參芪地黃湯對IgA腎病大鼠腎組織Nephrin表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2013（10）：1 753-1 755.

（編輯：梁葆朱）

Protective effect of astragaloside IV on kidney of diabetic nephropathy rats

Ran Laihu1，Ma Hongzhen2
（1.The First Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou Zhejiang 310053；2.Department of Nephropathy，The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou Zhejiang 310006）

AbstractObjective：To investigate effects of astragaloside IV（AS-IV）on contents of bloodglucose，24 h urine microalbumin，serum total protein，serum albumin protein nd serum adiponectin of rats with diabetic nephropathy（DN）and its renal protective effect.Methods：Male SD rats（n=40）were divided into normalgroup，modelgroup，AS-IVgroup of low dose and AS-IVgroup of high dose，10 rats in eachgroup.The rats in modelgroup and interventiongroup were injected with streptozotocin to induce DN models.After treatment for 8 weeks，the rats were sacrifice，and the blood samples and the renal cortex were collected.Electron microscopy was applied for observing the pathological changes of the renal tissues.The contents of bloodglucose，urine microalbumin，serum total protein，serum albumin protein and serum adiponectin were detected.Results：At the end of the 8th weeks，compared with modelgroup，the amount of bloodglucose and urine microalbumin in AS-IV interventiongroup were significantly decreased（P＜0.05），the levels of serum total protein，serum albumin and serum adiponectin were increased.Conclusion：AS-IV has a renal protective effect on DN rats and could delay the development of DN.The mechanism may be related to up-regulate the level of serum adiponectin.Key words diabetic nephropathy；astragaloside IV（AS-IV）；adiponectin；podocyte

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0022-04

［基金項目］浙江省中醫(yī)藥科學研究基金項目（2016A060）

［作者簡介］冉來虎，在讀碩士，E-mail：755005875@qq.com

［通訊作者］馬紅珍，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：mahongzhen0515@163.com