陳兆貴，張 蒙，肖軍委，胡成來（.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 56007；.廣東九華馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 惠州 56007）

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惠州市冬種馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生、鑒定及氣象影響因子研究

陳兆貴1，張 蒙1，肖軍委2，胡成來2
（1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東 惠州 516007；2.廣東九華馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 惠州 516007）

摘 要：以惠州冬種馬鈴薯為研究對(duì)象，探索不同氣象條件對(duì)冬種馬鈴薯卷葉病毒的影響。以田間調(diào)查的形式統(tǒng)計(jì)了不同時(shí)期冬種馬鈴薯卷葉病毒的發(fā)病情況，并對(duì)馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行分子鑒定，分析了惠州市冬季氣溫、相對(duì)濕度及降水等氣象條件對(duì)冬種馬鈴薯卷葉病毒病的影響。結(jié)果表明：3次調(diào)查馬鈴薯卷葉病毒病的平均發(fā)病率依次為2.48%、12.6%、70.18%，呈上升趨勢(shì)；分子鑒定結(jié)果顯示確為馬鈴薯卷葉病毒的感染；氣象條件對(duì)冬種馬鈴薯卷葉病毒的發(fā)生有著重要的影響，其中高溫、少雨，相對(duì)濕度在70%～80%的氣象條件易造成馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生和傳播。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；氣象條件；影響；RT-PCR

馬鈴薯是是繼水稻、玉米和小麥之后的世界第四大糧食作物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)兼糧食作物；我國(guó)是世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)，種植面積約460萬hm2，占世界馬鈴薯生產(chǎn)總面積25%；產(chǎn)量約6 000萬t，占世界馬鈴薯總產(chǎn)量的20%［1］。

惠州市地處廣東省東南部，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，北回歸線橫穿中部，日照時(shí)間長(zhǎng)，熱量豐富，雨量充足，發(fā)展冬種馬鈴薯具有得天獨(dú)厚的自然優(yōu)勢(shì)［2］，2013年種植面積已達(dá)1萬hm2。隨著冬種馬鈴薯種植面積的擴(kuò)大，馬鈴薯卷葉病毒發(fā)病情況已日益嚴(yán)重。影響馬鈴薯卷葉病發(fā)生和流行因素有許多，主要包括馬鈴薯種薯帶毒、氣象條件和田間管理措施等。氣象條件對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的發(fā)生有著重要的影響。由于廣東省冬季氣溫高、濕度大，蚜蟲飛遷傳播病毒使馬鈴薯卷葉病毒侵染速度更快，再加上冬種馬鈴薯生產(chǎn)中后期受霜凍和陰雨的影響，產(chǎn)量本身就不高。因此，一旦染病往往導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至失收［3］。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于氣象條件對(duì)冬種馬鈴薯卷葉病毒影響的研究不多［3-5］。黃新碧等［3］指出，影響廣東冬種馬鈴薯種植的主要?dú)庀笠蜃邮?月的低溫霜凍和2月中旬開始的春雨過多，尤其是高溫高濕的天氣。筆者擬通過不同時(shí)期冬種馬鈴薯卷葉病毒發(fā)病情況的調(diào)查，總結(jié)出惠州馬鈴薯冬種季節(jié)的氣溫、濕度及降水等氣象條件對(duì)馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生的影響，為防控馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種費(fèi)馬瑞它種植于惠州市惠東縣平海鎮(zhèn)大水坑、徑口村、官田村，磜頭村和鐵涌鎮(zhèn)溪美村的馬鈴薯基地，播種時(shí)間均為2013年11月。從田間采集疑似感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株，同時(shí)采集健康植株作為對(duì)照，儲(chǔ)存于超低溫冰箱（-86℃左右）中備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1田間調(diào)查法 調(diào)查地點(diǎn)為惠東縣平海鎮(zhèn)的大水坑、徑口村、磜頭村、官田村和鐵涌鎮(zhèn)溪美村。根據(jù)馬鈴薯的生長(zhǎng)周期，分別于2014年1月7日、19日，2014年2月17日進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)種植點(diǎn)隨機(jī)抽取3塊田地，采取五點(diǎn)取樣的方法，調(diào)查100株馬鈴薯植株，即每個(gè)地點(diǎn)共調(diào)查300株，統(tǒng)計(jì)疑似感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株數(shù)量。

1.2.2RNA提取及引物設(shè)計(jì) 采用試劑盒法提取材料的總RNA，通過凝膠電泳檢測(cè)RNA提取效果。根據(jù)已有的馬鈴薯卷葉病毒的基因序列及其保守序列的報(bào)道設(shè)計(jì)1對(duì)引物［6］，P1和P2引物序列分別為5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3′，5′-CTATTTGGGGTTTTGC AAAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為627 bp，由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄 （1）變性、退火反應(yīng)體系（10.0 μL）：dNTP Mixture 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Template RNA 5.0 μL，RNase Free ddH2O 3.0 μL。（2）變性、退火反應(yīng)程序：變性65℃ 5 min，退火4℃ 15 min。（3）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20.0 μL）：變性、退火后反應(yīng)液 10.0 μL，5×RT Buffer 4.0 μL，RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor 40 U/μL） 0.5 μL，RNA反轉(zhuǎn)錄酶（PrimeScriptTM RTase ）1.0 μL，RNase Free ddH2O 4.5 μL。（4）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：45℃ 45 min，95℃ 5min，4℃15 min。

1.2.4PCR擴(kuò)增 （1）PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，特異上游引物0.5 μL，特異下游引物0.5 μL，Taq DNA polynarase 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2.0 μL，RNase Free ddH2O 39.5 μL。（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94℃變性30 s， 60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min， 4℃ Forever。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并測(cè)序。

1.2.5馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與氣象條件的關(guān)系 根據(jù)田間調(diào)查的時(shí)間以及馬鈴薯的生長(zhǎng)周期特點(diǎn)，前期以一個(gè)月為一個(gè)周期，中后期以10 d為一個(gè)周期，將這幾個(gè)時(shí)間段馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的氣象條件與馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生情況調(diào)查

從表1中可以看出，前期調(diào)查中，每塊田地只有零星的幾株馬鈴薯感染了卷葉病，第一次調(diào)查時(shí)發(fā)病率均在4%以下；但隨著時(shí)間的推移，到中后期馬鈴薯卷葉病迅速蔓延，各田塊的發(fā)病率均超過了50%，感病嚴(yán)重的田塊發(fā)病率甚至高達(dá)90%以上。

表1　馬鈴薯卷葉病毒病田間發(fā)病情況調(diào)查

如圖1所示，采用試劑盒法提取的RNA在電泳時(shí)呈現(xiàn)出清晰的3條帶，從上至下依次為28 S rRNA、18 S rRNA、5 S rRNA，說明提取的RNA比較完整，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　RNA電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖2所示，健康植株中提取的RNA未擴(kuò)增出特異性條帶，而感染了馬鈴薯卷葉病的植株RNA擴(kuò)增出目的條帶，大小在500 ～750 bp之間，與目標(biāo)片段627 bp相一致。

圖2　RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

PCR 產(chǎn)物由大連寶生物工程有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為627 bp 片段，與設(shè)計(jì)的結(jié)果一致，擴(kuò)增的片段序列如下：ATGAGTACGGTCGTGGTTAA AGGAAATGTCAATGGT GGTGTACAACAACCAAGA AGGCGAAGAAGGCAATCCCTTCGCAGGCGCGCTA ACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGCCCC TGGGCAACCCAGGCGCCGAAGACGTAGAAGAGG AGGCAATCGCCGCTCAAGAAGAACTGGAGTTCCC CGAGGACGAGGCTCAAGCGAGACATTCGTGTTTA CAAAGGACAACCTCATGGGCAACTCCCAAGGAA GTTTCACCTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGTCCG GCATTCAAGGATGGAATACTCAAGGCCTACCATGA GTATAAGATCACAAGCATCTTACTTCAGTTCGTCA GCGAGGCCTCTTCCACCTCCTCCGGCTCCATCGCT TATGAGTTGGACCCCCATTGCAAAGTATCATCCCT CCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAATTACGAAG GGCGGCGCCAAAACTTATCAAGCGCGGATGATAA ACGGGGTAGAATGGCACGATTCTTCTGAGGATCAG TGCCGGATACTGTGGAAGGGAAATGGAAAATCTTC AGATACCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAGGG TGGCTTTGCAAAACCCCAAATAG。經(jīng)序列分析和同源性比較，確認(rèn)這個(gè)序列就是馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因組序列片段。

2.5馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與氣象條件的關(guān)系

2.5.1馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與溫度的關(guān)系 從表2中可以看出，2013年12月的平均氣溫為13.8℃，比較穩(wěn)定；2014年1月1～10日的平均氣溫為15.4℃，氣溫出現(xiàn)了小幅度的上升，一些植株開始患?。唤酉聛韮蓚€(gè)時(shí)間段的平均溫度分別為12.3、13.6℃，氣溫恢復(fù)到12月時(shí)的溫度，都保持在13℃左右，比較穩(wěn)定，發(fā)病率較之前稍微有一些上升；而2014年1月31日至2月9日的平均氣溫由之前的12.3℃上升到16.4℃，最高溫度達(dá)到22℃左右，之后又大幅度地降溫，平均氣溫只有11℃，最低溫達(dá)到了8.7℃，這種短時(shí)間內(nèi)的冷熱交替天氣使得馬鈴薯植株的自身防御能力大大降低，進(jìn)而導(dǎo)致卷葉病毒病大面積爆發(fā)，植株感病率大幅度上升。

2.5.2馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與相對(duì)濕度的關(guān)系 由表2可知，在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育階段，惠州市的空氣相對(duì)濕度總體上表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，但變化并不大，均在70%～85%范圍內(nèi)，比較較穩(wěn)定。在田間調(diào)查的前期（2014年1月1日），相對(duì)濕度為75.1%左右，田間感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株非常少，只有零星的幾株；田間調(diào)查中期相對(duì)濕度維持在78.5%上下，田間的病株增至30～40株，卷葉病發(fā)病率小幅度上升到12.6%；而到后期相對(duì)濕度達(dá)到80%以上，田間的馬鈴薯卷葉病發(fā)病率高達(dá)90%。由此可知，隨著時(shí)間的推移，空氣相對(duì)濕度有所提高，而馬鈴薯卷葉病的發(fā)病率也有不同程度的上升，表明馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與相對(duì)濕度之間存在一定相關(guān)性。

表2　馬鈴薯生長(zhǎng)周期的氣象條件

2.5.3馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與降水的關(guān)系 如表2所示， 2013年12月惠州地區(qū)的降雨相對(duì)較多，而其他時(shí)間段降雨非常少，有時(shí)連續(xù)10 d不曾下雨。3次的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，前期的總降水量為1.2 mm，田間感病植株只有零星的幾株；中期的降水量?jī)H為0.2 mm，卷葉病發(fā)病率有所上升；后期總降水量為1.0 mm，而馬鈴薯卷葉病毒迅速蔓延傳播，發(fā)病率高達(dá)90%。雖然各段時(shí)間的降水量有一些小差異，但近3個(gè)月的總降雨量?jī)H為2.2 mm，非常少。因此，干旱少雨的氣象環(huán)境對(duì)馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生和傳播有一定的影響。

2.5.4馬鈴薯卷葉病毒發(fā)生與日照的關(guān)系 如表2所示，在調(diào)查期間， 以1月11～20，21～30這兩個(gè)時(shí)間段的日照最強(qiáng)，總幅射分別達(dá)到31 920和35 201 W/m2，而2月10～19日，日照總幅射只有13 791 W/m2，比1月大大降低，加之同時(shí)期氣溫過低，馬鈴薯生長(zhǎng)緩慢也是馬鈴薯卷葉病毒病流行的原因之一。

3　討 論

影響馬鈴薯卷葉病毒病發(fā)生與流行的因素很多，如種薯帶毒、栽培管理、氣象條件及蚜蟲的數(shù)量等。影響惠州冬種馬鈴薯卷葉病毒病發(fā)生的氣象因素包括溫度、降雨量、日照、相對(duì)濕度等。賈小琴等［7］研究指出日照和降水條件是引起臨夏地區(qū)馬鈴薯病毒病發(fā)生的關(guān)鍵氣候因子。在惠州冬種季節(jié)，降水一直較少，馬鈴薯種植主要通過田間灌水方式保證馬鈴薯正常生長(zhǎng)所需。因此，降水與馬鈴薯卷葉病毒病發(fā)生之間的關(guān)系并不密切。日照和氣溫對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的發(fā)生有重要的影響，如果處于低溫和日照不足的環(huán)境，馬鈴薯生長(zhǎng)速度減慢，有可能導(dǎo)致馬鈴薯卷葉病毒病的流行。

氣象條件除了直接影響馬鈴薯卷葉病毒的發(fā)生以外，還有一個(gè)重要的方面是影響蚜蟲的數(shù)量。馬鈴薯卷葉病毒主要通過蚜蟲以持續(xù)性方式傳播，其中桃蚜是傳播該病毒的主要中間介體。雖然種薯帶毒率影響著田間初始病株的數(shù)量，但蚜蟲數(shù)量仍是馬鈴薯生長(zhǎng)后期發(fā)病率的決定性因素。多數(shù)蚜蟲適宜生長(zhǎng)溫度在14～25℃之間，而馬鈴薯喜陰涼，不耐高溫，25℃以上高溫會(huì)降低宿主對(duì)病毒的抵抗力，也有利于傳播媒介蚜蟲的繁殖、遷飛和傳病，從而有利于該病蔓延，加重受害程度［7］?；葜莸貐^(qū)在1月1～10日氣溫有小幅度回升，1月31日至2月9日氣溫有大幅度提升，均導(dǎo)致后期馬鈴薯卷葉病毒病的大規(guī)模發(fā)生。雖然伴隨升溫后馬上有降溫，蚜蟲傳播沒有之前迅速，但是馬鈴薯植株本身對(duì)這種高低溫的急劇變化也不適應(yīng)，一方面降低了宿主對(duì)病毒的抵抗力，另一方面還可能引發(fā)其他病蟲害。

在濕度較大的情況下，植物生長(zhǎng)旺盛，蚜蟲對(duì)植物的危害相對(duì)較小；相對(duì)濕度較小時(shí)，植物對(duì)吸汁性害蟲較為敏感，易發(fā)生萎蔫，同樣的蟲口密度，造成的危害相對(duì)較大。相對(duì)濕度在50%～80%之間時(shí)，蚜蟲生長(zhǎng)發(fā)育良好，當(dāng)高于90%或低于35%時(shí)，不利于蚜蟲生長(zhǎng)繁殖［8］。該研究也表明，在田間調(diào)查期間，雖然相對(duì)濕度總體上呈上升趨勢(shì)，但基本維持在70%～85%左右，均在蚜蟲的適宜范圍內(nèi)，這也為馬鈴薯卷葉病毒病的發(fā)生提供了有利的環(huán)境。因此，田間的蚜蟲繁殖快，數(shù)量大，危害重。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 伍壯生，張西露，劉明月. 南方冬作馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展與對(duì)策建議［J］.辣椒雜志，2010，（4）：41-43.

［2］ 陳兆貴，林于綿，黃 成. 冬種馬鈴薯卷葉病田間調(diào)查及RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（9）：2134-2137.

［3］ 黃新碧，陳朝慶. 利用自然條件和地理優(yōu)勢(shì)發(fā)展發(fā)展馬鈴薯生長(zhǎng)［J］.馬鈴薯雜志，1994，8（4）：235-238.

［4］ 韋劍峰，吳炫柯，韋冬萍，等. 廣西冬種馬鈴薯的氣候條件分析［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，17（23）：155-157.

［5］ 羅森波. 廣州冬種馬鈴薯氣候適宜性分析與區(qū)劃［J］. 廣東氣象，1992，（4）：25-27.

［6］ 何心鳳，郭寶太，李廣存，等. 馬鈴薯卷葉病毒CP基因的RTPCR擴(kuò)增［J］. 中國(guó)馬鈴薯，2007，21（4）：197-199.

［7］ 賈小琴，劉治國(guó)，傅正濤，等. 臨夏地區(qū)近43年來的日照時(shí)數(shù)變化分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，（2）：354-358.

［8］ 李 慧. 溫濕度降水對(duì)蚜蟲發(fā)生的影響［J］. 新疆氣象，1989，（6）：25-26.

（責(zé)任編輯：成 平）

Occurrence， Identification and Meteorological Influence Factors of Winter-Planting Potato Leaf Roll Virus Disease in Huizhou City

CHEN Zhao-gui1，ZHANG Meng1，XIAO Jun-wei2，HU Cheng-lai2
（1. Huizhou University， Department of Life Sciences， Huizhou 516007， PRC；2. Guangdong Jiuhua Potato Industry Co.，Ltd ， Huizhou 516300， PRC）

Abstract：in order to study the effects of different meteorological conditions on the leaf roll virus of winter-planting potato in Huizhou province. In the form of field survey investigated in different periods of winter-planting potato roll leaf virus incidence， and identified potato leaf roll virus molecular， analyzed the Huizhou City winter air temperature， relative humidity， precipitation and other meteorological conditions effects to winter-planting potato leaf virus disease. The results showed that the average incidence rate of potato leaf roll virus disease was 2.48%， 12.6%， 70.18%， and it was increased in 3 times investigation； the results of molecular identification showed that the infection of potato leaf roll virus was indeed； meteorological conditions have important effects on the occurrence of winter-planting potato leaf roll virus， including high temperature and little rain， the relative humidity in 70%～80% are the meteorological conditions that easy to cause the occurrence and propagation of potato leaf roll virus.

Key words：potato leaf roll virus； meteorological conditions； influence； RT-PCR

中圖分類號(hào)：S435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-060X（2016）03-0065-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.03.021

收稿日期：2016-01-26

基金項(xiàng)目：廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目（KJCX0176）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B090200023）

作者簡(jiǎn)介：陳兆貴（1973-），男，廣西蒙山縣人，教授，主要從事作物遺傳育種研究。