張牧臣　高海娜,2　趙圣國(guó)*　王珊珊,3　鄭　楠　王加啟

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

乳腺內(nèi)氨基酸調(diào)控乳蛋白合成的分子作用機(jī)制

張牧臣1高海娜1,2趙圣國(guó)1*王珊珊1,3鄭楠1王加啟1

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

摘要：作為維持哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)重要的“生物工廠”，乳腺利用從流經(jīng)血液中攝取的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為底物合成乳蛋白。研究證實(shí)，氨基酸還可作為一種信號(hào)因子，通過乳腺內(nèi)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)通路，調(diào)控乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程，從而影響乳腺中乳蛋白的合成。酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號(hào)通路和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路是乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的主要調(diào)控路徑。本文綜述了乳腺JAK-STAT和mTOR信號(hào)通路的分子機(jī)制及氨基酸通過這些通路調(diào)控乳蛋白合成的研究進(jìn)展，旨在進(jìn)一步闡明氨基酸調(diào)控乳蛋白合成的作用機(jī)理。

關(guān)鍵詞：氨基酸；乳蛋白；調(diào)控；JAK-STAT；mTOR

對(duì)于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多細(xì)胞真核生物，局部環(huán)境中的可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是細(xì)胞生存的主要決定因素，它們通過細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路被感知，整合進(jìn)入細(xì)胞的合成代謝程序，支持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。在多變的環(huán)境下，動(dòng)物通過營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)感知機(jī)制、生長(zhǎng)因子調(diào)控機(jī)制以及激素網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)控自身生長(zhǎng)發(fā)育[1]。

乳腺作為維持哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)重要的生物工廠，可攝取流經(jīng)血液中多種小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸入乳腺細(xì)胞內(nèi)，作為乳成分合成前體物合成乳糖、乳脂、乳蛋白等重要乳成分[2]。乳腺是奶牛泌乳期間對(duì)氨基酸凈利用率最高的組織[3]，它可利用攝入的氨基酸為底物，以乳蛋白基因?yàn)槟０搴铣山M織中90%以上的乳蛋白，如酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白[4]。近年來的研究證實(shí)，氨基酸不僅是乳蛋白合成最為重要的前體物質(zhì)，還可以作為一種信號(hào)分子，通過乳腺細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)通路[5]，調(diào)控乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯進(jìn)程，在轉(zhuǎn)錄和翻譯2個(gè)水平上共同影響乳蛋白合成，其中作用最顯著的是酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路(圖1)。

1JAK-STAT通路

酪氨酸蛋白激酶(Janus kinase，JAK)是一類與細(xì)胞因子受體相連的非受體型胞質(zhì)酪氨酸蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物中，該家族由Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2組成，它們都具有相似的JAK同源結(jié)構(gòu)域(JAK homology domain，JH)，主要包括作為激酶區(qū)的JH1，具有抑制活性的假激酶區(qū)Jp、受體結(jié)合區(qū)JH6和JH7等[6]。在研究促紅細(xì)胞生成素受體所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)發(fā)現(xiàn)，JAK的作用底物中有一類相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)，在細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)錄激活過程中起關(guān)鍵作用；STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(STAT5a及STAT5b)、STAT6組成了哺乳動(dòng)物STAT家族[7]。STAT蛋白一般包括一個(gè)對(duì)其活化重要的酪氨酸殘基、與細(xì)胞因子受體結(jié)合的Sp結(jié)構(gòu)域、與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)等重要功能區(qū)段[7]。

cytokines：細(xì)胞因子；JAK2：酪氨酸蛋白激酶2 Janus kinase 2；STAT5:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子5 signal transducer and activator of transcription 5；AA：氨基酸 amino acid；casein gene：酪蛋白基因；casein：酪蛋白；energy：能量；TSC：結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物 tuberous sclerosis complex；Rheb：腦內(nèi)富含的小G蛋白R(shí)as同系物 Ras homolog enriched in brain；mTORC1：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1 mammalian target of rapamycin complex 1；4EBP1：真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein；eIF4E：真核翻譯起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E；eIF4G：真核翻譯起始因子4G eukaryotic translation initiation factor 4G；eIF4A：真核翻譯起始因子4A eukaryotic translation initiation factor 4A；eIF4B：真核翻譯起始因子4B eukaryotic translation initiation factor 4B；eIF3：真核翻譯起始因子3 eukaryotic translation initiation factor 3；S6K1：核糖體蛋白S6激酶1 ribosomal protein S6 kinase 1；rpS6:核糖體蛋白S6 ribosomal protein S6；eEF2 真核延伸因子2 eukaryotic elongation factor 2；40S：核糖體40S小亞基；60S：核糖體60S大亞基。

圖1氨基酸通過JAK-STAT及mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳蛋白合成

Fig.1Regulation of milk protein synthesis by amino acids through JAK-STAT and mTOR signaling pathway

該通路可以被諸如白介素、干擾素、促紅細(xì)胞生成素以及催乳素、生長(zhǎng)激素等超過50種的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子活化[8-10]，介導(dǎo)多種細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核傳遞的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控核內(nèi)特定基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用[9](圖1)。其具體作用機(jī)制為：信號(hào)傳導(dǎo)開始于細(xì)胞外細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與相應(yīng)的跨膜受體的結(jié)合，促使與受體相連的JAK被反式激活：使得JAK空間上相互接近并發(fā)生構(gòu)象改變，使它們的激酶區(qū)疏遠(yuǎn)具有抑制活性的假激酶區(qū)；被激活的JAK反過來進(jìn)一步磷酸化“潛伏”的STAT單體分子，這導(dǎo)致STAT分子的二聚化，并經(jīng)核轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與特異DNA序列結(jié)合。這些序列有一部分位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，但更多的是位于起始位點(diǎn)遠(yuǎn)端，與一些增強(qiáng)子或者其他的順式作用元件有關(guān)聯(lián)的序列，較典型的是γ干擾素激活位點(diǎn)(IFN-γ activation site，GAS)，STAT二聚體與相應(yīng)位點(diǎn)的結(jié)合可調(diào)控核內(nèi)相應(yīng)特異基因的轉(zhuǎn)錄[9](圖1)。

2氨基酸通過乳腺JAK2-STAT5通路影響乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄

研究表明，在乳腺中對(duì)乳蛋白合成起到重要作用的主要是JAK2和STAT5，以及兩者共同構(gòu)成的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路。體內(nèi)試驗(yàn)表明：敲除小鼠STAT5a基因，小鼠乳腺腺泡發(fā)育不良，第1次妊娠后不泌乳；且STAT5b蛋白濃度降低，酪氨酸磷酸化作用減弱；敲除小鼠STAT5b基因，小鼠乳腺腺泡發(fā)育能力也有所降低[11]。JAK2和STAT5基因?qū)τ诰S持妊娠期小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖和分化是必需的[12]，缺失JAK2基因的小鼠，分娩時(shí)不能形成乳腺分泌腺泡而且由激素處理誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞增殖量減少了95%[2]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)表明，β-乳球蛋白基因和乳清酸性蛋白基因中啟動(dòng)子附近含有STAT5的結(jié)合位點(diǎn)GAS特異序列，是促進(jìn)這些乳蛋白分泌所必需的位點(diǎn)[11-13]。在體外培養(yǎng)奶牛乳腺組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，催乳素可以通過激活STAT5，從而激活β-酪蛋白基因(CSN2)中含有GAS元件的啟動(dòng)子序列，促進(jìn)β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄[14]。抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞STAT5a基因的表達(dá)，可降低細(xì)胞內(nèi)β-酪蛋白基因mRNA豐度，STAT5a基因的過表達(dá)可提高β-酪蛋白基因mRNA豐度[15]。另外在小鼠乳腺中研究表明，催乳素通過激活JAK2，繼而磷酸化STAT5，激活的STAT5可促進(jìn)多種乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄，并最終提高乳蛋白分泌量[16]。同時(shí)，生長(zhǎng)激素及其他泌乳相關(guān)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子，對(duì)奶牛乳腺乳蛋白基因的表達(dá)也有類似的作用機(jī)制[17]。

近年來，在研究氨基酸影響乳蛋白合成的分子機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種氨基酸可通過影響JAK-STAT通路中主要信號(hào)分子(JAK2、STAT5)的基因轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響乳蛋白合成(圖1)。

早期在研究亮氨酸補(bǔ)給對(duì)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，給大鼠灌注亮氨酸可以提高骨骼肌蛋白的合成量[18]，以不同劑量給泌乳期荷斯坦奶牛十二指腸灌輸亮氨酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)40 g/d劑量組顯著提高乳中乳蛋白含量，但不添加及低于或高于此添加量的試驗(yàn)組，乳蛋白含量均顯著下降。在研究亮氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成的影響及機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.9 mmol/L亮氨酸時(shí)可顯著提高κ-酪蛋白(CSN3)基因mRNA水平，低于或高于此濃度，這種效果均減弱；不同處理下細(xì)胞內(nèi)JAK2、STAT5基因的mRNA水平變化趨勢(shì)與酪蛋白基因相似，且均在0.9 mmol/L時(shí)達(dá)到最大[19]。此外，體內(nèi)研究表明奶山羊乳腺?gòu)难褐袛z取的精氨酸的量，遠(yuǎn)高于所分泌的乳蛋白中精氨酸的含量[20]。隨后在體外研究精氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不改變培養(yǎng)基中其他氨基酸含量，僅分別添加0、69.5、139、278 mg/L精氨酸時(shí)，隨著添加量的增加，細(xì)胞內(nèi)αs2-酪蛋白(CSN1S2)、κ-酪蛋白基因的mRNA豐度有升高的趨勢(shì)，高濃度添加組(556、1 112、2 224 mg/L)，隨添加量增大，αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白基因mRNA豐度有降低的趨勢(shì)；當(dāng)添加556 mg/L時(shí)2種酪蛋白合成量均達(dá)到最大值，顯著高于其他各組；所有精氨酸添加組與未添加組相比均顯著上調(diào)了乳腺上皮細(xì)胞JAK2、STAT5基因的mRNA豐度，且存在隨精氨酸濃度增加先升高后降低的趨勢(shì)，同樣在556 mg/L精氨酸添加組達(dá)到峰值，說明精氨酸能夠通過影響JAK2-STAT5通路調(diào)控乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄[21]。賴氨酸和蛋氨酸被認(rèn)為是飼喂以秸稈為主要粗料來源的飼糧時(shí)奶牛的主要限制性氨基酸[2]。Nan等[22]在研究賴氨酸與蛋氨酸的不同配比對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的影響時(shí)指出：賴氨酸、蛋氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成能力的影響同樣具有劑量依賴性，隨培養(yǎng)基中賴氨酸、蛋氨酸濃度的增加，細(xì)胞總酪蛋白分泌量均表現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，分別在以1.2、0.5 mmol/L濃度添加時(shí)效果最佳；當(dāng)分別以2種氨基酸的最佳作用濃度處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、JAK2、STAT5基因mRNA水平均顯著高于未添加組；隨后作者以篩選出的2種氨基酸最佳濃度配比(賴氨酸∶蛋氨酸=3∶1)處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比同樣顯著促進(jìn)了JAK2、STAT5基因的轉(zhuǎn)錄。Nan等[22]由此認(rèn)為賴氨酸和蛋氨酸對(duì)奶牛泌乳的影響，與JAK2-STAT5通路密切相關(guān)。王立娜[15]研究表明氨基酸與STAT5a基因互作共同對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，最佳濃度配比氨基酸能夠顯著促進(jìn)JAK2、STAT5a基因轉(zhuǎn)錄，顯著提高總STAT5a、磷酸化STAT5a蛋白水平，并最終顯著提高β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平和β-酪蛋白分泌量。還有研究表明以蛋氨酸-蛋氨酸形成的寡肽替代培養(yǎng)基中15%的自由蛋氨酸后，可顯著提高所培養(yǎng)的乳腺組織αs1-酪蛋白基因mRNA表達(dá)水平及αs1-酪蛋白的合成量，同時(shí)使得細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中蛋氨酸的吸收量顯著增加，且JAK2、STAT5基因的mRNA水平與未替換組相比顯著提高，作者認(rèn)為蛋氨酸寡肽可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)底物的可利用性以及激活乳腺JAK2-STAT5通路促進(jìn)酪蛋白的合成[23]。除此之外，有報(bào)道稱氨基酸還可能通過與其他催乳激素的相互作用，共同作用于乳腺JAK2-STAT5通路，調(diào)控乳蛋白合成[24]。

3mTOR信號(hào)通路

哺乳動(dòng)物細(xì)胞生存環(huán)境中生長(zhǎng)因子、能量狀態(tài)、環(huán)境壓力、氨基酸供應(yīng)等因素的改變均可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)mTOR活性，它通常以所組成蛋白磷酸化的形式被激活，然后通過促進(jìn)下游的多條并行效應(yīng)通路，促進(jìn)諸如蛋白質(zhì)翻譯等的合成代謝過程按序進(jìn)行，并抑制如自噬等的分解代謝，從而避免不對(duì)等的合成和降解活動(dòng)所造成的無效循環(huán)，以此調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和新陳代謝[1]。mTOR是一個(gè)非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可分別與多種蛋白質(zhì)組成2個(gè)復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1[含有DEP結(jié)構(gòu)域的mTOR相互作用蛋白(mTOR complex 1，mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTOR complex 2，mTORC2)。mTORC1由支架亞基mTOR調(diào)控關(guān)聯(lián)蛋白(regulatory-associated protein of mTOR，raptor)、正向調(diào)節(jié)蛋白LST8類似物(mammalian ortholog of LST8，mLST8)、2個(gè)內(nèi)源的激酶抑制劑[含有DEP結(jié)構(gòu)域的mTOR相互作用蛋白(DEP-domain-containing mTOR-interacting protein，DEPTOR)和40ku富含脯氨酸的AKT底物(proline-rich AKT substrate 40 ku，PRAS40)]組成[1]。

mTORC1可被腦內(nèi)富含的小G蛋白R(shí)as同系物(Ras homolog enriched in brain，Rheb)調(diào)控[25]，Rheb存在于溶酶體表面[26]，是mTORC1激酶活性的有效刺激物，可使mTORC1復(fù)合物特定位點(diǎn)上的絲氨酸或蘇氨酸發(fā)生磷酸化，從而被激活。Rheb反過來又被結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex，TSC)負(fù)調(diào)控，TSC是由TSC1、TSC2及TBC1D7組成的異源三聚體復(fù)合物[27]。TSC中的TSC2組件是Rheb的GTP酶活化蛋白，可以使Rheb從活化的GTP結(jié)合狀態(tài)改變成失活的GDP結(jié)合狀態(tài)；TSC復(fù)合物在mTORC1上游發(fā)揮中央集線器的作用，向細(xì)胞內(nèi)輸入包括細(xì)胞分裂信號(hào)和生長(zhǎng)因子、能量水平、氧氣可得性、基因毒性壓力等信號(hào)，它們都可以通過調(diào)節(jié)TSC復(fù)合物的活性共同地影響mTORC1信號(hào)通路[1](圖1)。最近的研究表明存在多種上游分子介導(dǎo)氨基酸對(duì)mTOR復(fù)合物發(fā)揮作用，包括SLC38A9、亮氨酰tRNA合成酶、調(diào)節(jié)子(Ragulator)、Rag GTP酶(Rag GTPase)、GATOR等[25-28]，現(xiàn)處于進(jìn)一步的研究中。

在研究氨基酸對(duì)骨骼肌蛋白合成的效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，氨基酸可刺激大鼠、新生嬰兒骨骼肌蛋白的合成，其中作用最突出的就是亮氨酸[28]，并且發(fā)現(xiàn)該過程是通過mTORC1調(diào)節(jié)肌蛋白翻譯進(jìn)程實(shí)現(xiàn)的[28]。具體機(jī)制為：mTORC1復(fù)合物被氨基酸激活后主要通過調(diào)節(jié)包括真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein，4EBP1)、核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase，S6K1)、真核細(xì)胞延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2，eEF2)等在內(nèi)的翻譯調(diào)控因子的磷酸化狀態(tài)而發(fā)揮作用，4EBP1被激活后會(huì)釋放真核起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)。eIF4E一旦被釋放，就會(huì)與真核起始因子4G(eukaryotic translation initiation factor 4G，eIF4G),真核起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A，eIF4A)及真核起始因子4B(eukaryotic translation initiation factor 4B，eIF4B)形成eIF4F復(fù)合物，該復(fù)合物會(huì)綁定40S核糖體亞基形成43S前體起始復(fù)合物，從而起始翻譯進(jìn)程；同時(shí)被mTOR磷酸化激活的S6K1反過來磷酸化核糖體蛋白S6(ribosomal protein S6，rpS6)，增強(qiáng)rpS6的活動(dòng)(rpS6是40S復(fù)合物的一部分，rpS6活動(dòng)的增強(qiáng)也會(huì)促進(jìn)40S復(fù)合物的活動(dòng))，并抑制真核生物延伸因子2激酶(eEF2 kinase，eEF2K)活動(dòng)，阻止eEF2K對(duì)eEF2的抑制，進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA的翻譯進(jìn)程[24]。

4氨基酸通過乳腺mTOR通路影響乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄后翻譯過程

體內(nèi)研究表明，mTOR信號(hào)通路在奶牛乳蛋白合成翻譯過程的起始及延伸階段均發(fā)揮不可替代的作用，并受到氨基酸供給水平的影響：Doepel等[3]稱給奶牛皺胃灌輸全部必需氨基酸提高了乳產(chǎn)量和乳蛋白產(chǎn)量；Rius等[29]給泌乳期奶牛靜脈灌注亮氨酸后，促進(jìn)了乳腺mTOR、S6K1的磷酸化和乳蛋白的合成；對(duì)從孕期到泌乳全期奶牛乳腺的生理變化跟蹤研究表明：與孕期相比，泌乳期乳腺氨基酸運(yùn)載體基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，特別是一些轉(zhuǎn)運(yùn)必需氨基酸的載體；同時(shí)作為奶牛乳腺編碼mTOR的基因——FRAP1在整個(gè)泌乳期間的表達(dá)變化與乳蛋白的分泌曲線相符[24]；與妊娠期奶牛乳腺相比，泌乳期乳腺mTOR及其下游eIF4E的表達(dá)量顯著提高，且在整個(gè)泌乳期，核糖體40S、60S亞基mRNA的水平和eEF2基因mRNA水平、蛋白合成量都是上調(diào)的[24]。

體外研究氨基酸調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種氨基酸均可以通過調(diào)控mTOR通路主要信號(hào)分子(mTOR、4EBP1、S6K1、eEF2)的基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白磷酸化水平(圖1)，影響乳蛋白合成，且不同的氨基酸類型、不同的氨基酸濃度、不同的氨基酸配比之間存在差異：高海娜等[30]研究表明：添加不同濃度亮氨酸或組氨酸培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，乳蛋白基因及mTOR通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，與空白對(duì)照組相比，分別添加0.45～10.80 mmol/L亮氨酸及0.15～4.80 mmol/L組氨酸6 h時(shí)，αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白基因mRNA豐度均被顯著上調(diào)；不同亮氨酸及組氨酸添加濃度對(duì)mTOR、raptor、GβL、rpS6、4EBP1基因mRNA豐度影響不同；亮氨酸添加濃度為0.45～5.40 mmol/L時(shí)，mTOR、raptor、GβL基因mRNA豐度顯著高于未添加組，且均在1.35 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值；與陰性對(duì)照組相比，raptor、GβL、4EBP1、eEF2、eIF4E和rpS6基因mRNA豐度隨著組氨酸濃度(0.15～9.60 mmol/L)的增加而有增加的趨勢(shì)；添加0.45～10.80 mmol/L亮氨酸顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總酪蛋白分泌量及mTOR(Ser2 481)、raptor(Ser792)、eEF2(Thr56)、eIF4E(Ser209)磷酸化水平，添加0.15～9.60 mmol/L組氨酸顯著促進(jìn)αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白分泌量及mTOR(Ser2 481)、raptor(Ser792)、S6K1(Thr389)、4EBP1(Thr37)、eEF2(Thr56)、eIF4E(Ser209)磷酸化水平[31]。Appuhamy等[32]研究表明，去除奶牛乳腺上皮細(xì)胞、乳腺組織切片培養(yǎng)基中的全部必需氨基酸后，細(xì)胞及組織mTOR(Ser2 448)、S6K1(Thr389)、4EBP1(Thr37/46)磷酸化水平均顯著降低，eEF2(Thr56)磷酸化水平顯著增加，mTOR、S6K1、4EBP1磷酸化水平與乳腺組織蛋白質(zhì)合成率呈正相關(guān)，可利用必需氨基酸通過翻譯起始和延伸的關(guān)鍵控制點(diǎn)調(diào)控乳腺蛋白質(zhì)合成。Appuhamy等[33]隨后又證實(shí)了亮氨酸和異亮氨酸可促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織、乳腺上皮細(xì)胞mTORC1的磷酸化激活，進(jìn)而促進(jìn)S6K1和4EBP1的磷酸化激活，從而提高乳腺組織及乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成率；當(dāng)培養(yǎng)基中不含亮氨酸和異亮氨酸時(shí)，所培養(yǎng)乳腺組織分別少合成了59%和61%的乳蛋白，同時(shí)mTOR的磷酸化水平均下降了40%以上；而添加mTOR上游通路抑制劑后，顯著降低了奶牛乳腺上皮細(xì)胞S6K1的磷酸化水平，同時(shí)乳蛋白分泌量減少[34]。Nan等[22]在研究賴氨酸與蛋氨酸的不同配比對(duì)乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白的影響時(shí)指出：當(dāng)以促進(jìn)酪蛋白合成的最適濃度賴氨酸(1.2 mmol/L)和蛋氨酸(0.5 mmol/L)處理細(xì)胞時(shí)，mTOR基因的mRNA豐度顯著高于空白對(duì)照組，對(duì)S6K1基因mRNA豐度影響并不顯著，但顯著降低了4EBP1基因mRNA表達(dá)量；兩者以不同比例混合時(shí)，對(duì)酪蛋白合成的影響不同，存在最佳濃度配比(賴氨酸∶蛋氨酸=3∶1)，此配比顯著促進(jìn)了細(xì)胞中mTOR、4EBP1基因轉(zhuǎn)錄，而且單獨(dú)添加最適濃度賴氨酸及最佳濃度配比時(shí)，細(xì)胞內(nèi)總mTOR蛋白水平及其磷酸化水平均顯著被提高，作者認(rèn)為適宜濃度的賴氨酸、蛋氨酸均可以通過激活乳腺上皮細(xì)胞mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)乳合成。

5小結(jié)

乳蛋白含量和組成是構(gòu)成乳重要營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。探究以飼糧營(yíng)養(yǎng)改善乳蛋白含量及組成的方式與機(jī)理，并用于指導(dǎo)奶畜高效養(yǎng)殖的思路正在成為反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)科研究的前沿，而作為蛋白質(zhì)基本組成成分的氨基酸，對(duì)其代謝效價(jià)及營(yíng)養(yǎng)機(jī)制的探究又是分子營(yíng)養(yǎng)研究的一大亮點(diǎn)。乳蛋白合成過程中，氨基酸不僅可以作為前體營(yíng)養(yǎng)物，還可以作為一種信號(hào)分子，通過細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT通路調(diào)控乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，通過以mTOR為中心樞紐的多級(jí)傳導(dǎo)通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，在時(shí)間和空間上相關(guān)聯(lián)的2個(gè)水平共同影響乳蛋白合成。但目前關(guān)于乳腺JAK-STAT通路的研究還主要集中在細(xì)胞因子方面，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)該通路的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探究，而且該通路與mTOR通路之間的關(guān)聯(lián)性并不清楚，同時(shí)關(guān)于乳腺細(xì)胞對(duì)氨基酸的感知、轉(zhuǎn)運(yùn)的研究還較少。本綜述將有助于進(jìn)一步開展氨基酸營(yíng)養(yǎng)在乳腺組織蛋白質(zhì)合成和調(diào)控方面的研究。

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(責(zé)任編輯王智航)

Molecular Mechanisms in Regulation of Milk Protein Synthesis by Amino Acids in Mammary Gland

ZHANG Muchen1GAO Haina1,2ZHAO Shengguo1*WANG Shanshan1,3ZHENG Nan1WANG Jiaqi1

(1.Ministry of Agriculture-Milk Risk Assessment Laboratory, Ministry of Agriculture-Milk and Dairy Product Inspection Center, State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3. College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Abstract:As an important ‘biological factory’ to maintain life activities of mammalian, the mammary gland utilizes nutrients, such as amino acids, that uptake from blood as substrates to synthesize milk protein. Studies confirmed that amino acids also can be used as a signal factor to regulate milk protein gene transcription and translation through the signaling cascade pathways in the mammary gland, which affects milk protein synthesis. Janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathways are the main regulatory pathways in the process of milk protein gene transcription and translation. The molecular mechanism of the JAK-STAT and mTOR signaling pathways in the mammary gland and research progress on regulation of milk protein synthesis by amino acids through these pathways were reviewed in this paper, with the aim to further clarify the mechanism in regulation of milk protein synthesis by amino acids.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1309-1316]

Key words:amino acid; milk protein; regulation; JAK-STAT; mTOR

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.004

收稿日期：2015-12-01

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(nycytx-04-01)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12)

作者簡(jiǎn)介：張牧臣(1991—)，男，吉林白城人，碩士研究生，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: muchen805215099@163.com *通信作者：趙圣國(guó)，助理研究員，E-mail: zhaoshengguo1984@163.com

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)05-1309-08

*Corresponding author, assistant researcher, E-mail: zhaoshengguo1984@163.com