廖源林， 蔡仕珍， 李　西， 林　瑞

( 四川農(nóng)業(yè)大學 風景園林學院， 成都 611130 )

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野鴉椿種子內源抑制物活性初探

廖源林， 蔡仕珍*， 李西， 林瑞

( 四川農(nóng)業(yè)大學 風景園林學院， 成都 611130 )

摘要：以野鴉椿(Euscaphis japonica)種殼和胚為材料，甲醇浸提得到種殼浸提液和胚浸提液，配制浸提液濃度梯度為原浸提液濃度的10%、20%、30%、40%，研究不同濃度的種殼和胚浸提液對白菜、小麥、綠豆種子底物酶活性、發(fā)芽率、幼苗根長和苗高的影響，萃取和分離種殼和胚甲醇浸提液中的內源抑制物質，探討野鴉椿種子內源抑制物質的活性與成分。結果表明：隨著種殼和胚浸提液濃度的增加，白菜種子酸性磷酸酶活性和發(fā)芽率均顯著降低(P<0.05)，表現(xiàn)為抑制作用遞增，種殼的抑制作用小于胚，而幼苗的根長和苗高則表現(xiàn)為低促高抑，在10%浸提液處理下根長和苗高達最大值，種殼的促進效果弱于胚；小麥種子淀粉酶活性及幼苗的根長和苗高遞減(P<0.05)，表現(xiàn)為抑制作用遞增，而發(fā)芽率則在濃度≤20%時差異不明顯(P>0.05)，濃度為30%時顯著降低(P<0.05)，40%時發(fā)芽率為0，種殼的抑制作用大于胚；綠豆種子蛋白酶活性、發(fā)芽率、幼苗根長和苗高均在浸提液濃度≥20%時顯著下降(P<0.05),且種殼的作用效果小于胚。種子內源抑制物萃取及分離表明，外殼中含酚酸類較胚多，含堿類較胚少。綜上認為，野鴉椿種殼和胚中均含有較高活性的內源抑制物，但性質、成分及含量存在差異，外殼內源抑制物主要作用對象為淀粉類物質，胚乳內源抑制物主要作用于油脂類和蛋白類物質。

關鍵詞：野鴉椿， 甲醇浸提液， 內源抑制物質， 生物測定

野鴉椿(Euscaphisjaponica)，又名雞眼睛、雞腎果、山海椒、芽子木，為省沽油科(Staphyleaceae)野鴉椿屬(Euscaphis)的落葉小喬木或灌木，同屬在我國的還有福建野鴉椿(E.fukienensis)和圓齒野鴉椿(E.konishii)(中國科學院中國植物志編輯委員會，1981；中國科學院華南植物研究所，1995)。野鴉椿株型優(yōu)美，高為3～6 m，小枝及芽紅紫色，春夏開花，秋、冬及來年的春季掛果，是一種理想的“一季觀花，三季觀果”樹種。此外，野鴉椿兼具藥用價值，有理氣止痛、消腫散結、抗炎鎮(zhèn)痛等功效(李先輝 等，2009)。種子繁殖是野鴉椿的主要繁殖途徑。然而，野鴉椿種子具有深度休眠特性，萌發(fā)時間長、發(fā)芽率低。如果不對種子進行預處理，種子萌發(fā)非常困難。在野生環(huán)境中，野鴉椿以單株形式存在于林緣、荒坡、溪邊群落中，且植株附近不見小苗。近年來，隨著對野鴉椿屬價值的認可，野鴉椿野生資源受到嚴重破壞，瀕臨滅絕危險。目前，基于對野鴉椿資源的保護及利用，國內已率先在其藥理和繁殖方面進行了研究(左敏等，2008；葛玉珍，2004)，但較少涉及休眠機理方面。

種子休眠的原因大致包括胚未成熟、種皮構造特殊和含有內源抑制物質三個方面(中山包，1988；卡恩，1989)。前人通過對種子內源抑制物活性研究，為研究種子破眠技術和休眠機理提供了科學依據(jù)。宋會興等(2012)通過對四川牡丹種子內源抑制物活性的研究，發(fā)現(xiàn)內源抑制物是導致四川牡丹種子休眠的重要原因；年慧慧等(2012)通過研究不同方法處理后的南方紅豆杉種子內源抑制物的活性，找到了科學的破除休眠的方法；李兵兵等(2013)研究不同藥劑處理下的麻花秦艽種子內源抑制物活性的變化，發(fā)現(xiàn)高錳酸鉀可減弱其種子內源抑制物活性；覃嘉佳等(2011)發(fā)現(xiàn)內源抑制物的存在是引起野鴉椿屬種子休眠的原因之一。本文通過研究野鴉椿種子不同部位的內源抑制物對油脂類、淀粉類及蛋白類種子的化感作用，進一步討論野鴉椿內源抑制物的活性、總類及分布，旨在為野鴉椿種子破休眠技術及休眠機理的深入研究提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

供試的野鴉椿種子于2012年9月采自四川省宜賓馬家林場，陰干后常溫儲藏備用。生物活性的測定材料采用市售白菜(Brassicapekinensis)、小麥(Triticumaestivum)、綠豆(Vignaradiata)的種子。試驗在成都市溫江區(qū)四川農(nóng)業(yè)大學風景園林重點實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 內源抑制物的生物測試(1)甲醇浸提液的制備:參照戴萍(2011)和程漢亭等(2012)，將野鴉椿種子小心砸開，分離種殼和胚，各稱取5 g粉碎后分別置于錐形瓶中，用50 mL 80%的甲醇浸提，保鮮膜封口，放入0 ℃冰箱中，每隔一定時間震蕩1次，36 h后取出過濾，得到種殼和胚的甲醇浸提液。再將甲醇浸提液分別稀釋，使其濃度為原濃度的10%、20%、30%、40%(相當于質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04 g·mL-1的甲醇浸提液濃度)，同時分別取5、10、15、20 mL的80%甲醇稀釋到50 mL作為以上梯度對照。(2)種子內源抑制物活性測定:用上述不同濃度的種殼、胚甲醇浸提液和甲醇稀釋溶液浸泡一批大小、形狀、色澤基本一致且飽滿的白菜、小麥及綠豆種子，蒸餾水浸種作為對照。隨機選取，每個處理設3個重復，每個重復100粒，浸種白菜(3 h)、小麥(5 h)、綠豆(5 h)后，將浸泡好的種子放于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃(白菜、綠豆)、20 ℃(小麥)恒溫培養(yǎng)箱內進行發(fā)芽實驗，48 h后統(tǒng)計白菜、小麥、綠豆籽的發(fā)芽率(以露出子葉為發(fā)芽的標準)，5 d后將苗拔出測其苗高和根長。(3)白菜、小麥及綠豆種子底物酶活性的測定:用上述浸泡好的白菜、小麥及綠豆種子，隨機選取，參照劉子凡(2011)和王學奎(2006)，測定酸性磷酸酶(白菜)、淀粉酶(小麥)、蛋白酶(綠豆)的活性。

圖 1　野鴉椿種子內源抑制物的分離流程Fig. 1　Procedure for separating endogenous inhibitors from Euscaphis japonica seeds

1.2.2 內源抑制物提取及分離(1)野鴉椿種子內源抑制物的提?。簠⒖纪跣∑降?1998)和覃嘉佳等(2011)的方法,取水浸24 h的野鴉椿種子450粒，分種殼(23.91 g)、胚(4.53 g)兩部分，分別用80%甲醇在0 ℃下浸泡，每隔一定時間震蕩1次，36 h后過濾。其中80%甲醇用量，按1 g鮮重組織用10 mL溶劑提取的比例來計算(Hillman，1983)。(2)內源抑制物的萃取分離：參照鄭彩霞等(1991)，將上訴得到的含內源抑制物的浸提液，按照圖1的分離流程進行分離,將分離得到的7個組分，分別減壓濃縮至干，稱取重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計與分析。

2結果與分析

2.1 野鴉椿種子甲醇浸提液對白菜、小麥、綠豆種子萌發(fā)的影響

由圖2可知，白菜、小麥和綠豆種子發(fā)芽率都隨著浸提液濃度的增加而呈降低趨勢。其中白菜種子發(fā)芽率隨著種殼和胚浸提液濃度的增加顯著降低，當濃度為40%時，發(fā)芽率依次比對照降低了84%、91%，比相同濃度的甲醇降低了18%、25%。胚較種殼對白菜種子萌發(fā)的抑制效果更顯著。

在濃度低于20%時，小麥種子發(fā)芽率隨著濃度增加下降不明顯，在濃度高于20%，發(fā)芽率大幅度降低，濃度為30%時，種殼和胚的發(fā)芽率依次比對照降低了80%、76%，比同濃度的甲醇降低了24%、20%，濃度40%時發(fā)芽率為0。種殼較胚對小麥種子萌發(fā)的抑制效果更明顯。

綠豆種子的發(fā)芽率隨著甲醇濃度、種殼及胚浸提液濃度的增加而下降，在濃度范圍為0%～10%時下降不明顯，在濃度為10%～40%時下降明顯。相比甲醇，在濃度范圍為10%～20%條件下，胚和種殼的甲醇浸提液對綠豆種子的萌發(fā)有促進作用，且胚的促進作用更顯著；而在濃度范圍為30%～40%時，胚和種殼的浸提液對綠豆種子的萌發(fā)具有抑制效果，且胚的抑制效果更為明顯。

圖 2　野鴉椿種子甲醇浸提液對白菜、小麥及綠豆種子萌發(fā)的影響　不同大寫字母表示相同物質不同濃度處理間差異顯著 (P<0.05)。不同小寫字母表示相同濃度不同物質處理間差異顯著。下同。Fig. 2　Effects of methanol extract of Euscaphis japonica seeds on germination of Chinese Cabbage,Triticum aestivum and Vigna radiate　Different capital and lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) among different concentrations with same substance, and of different substance treatments at the same concentration,respectively. The same below.

2.2 野鴉椿種子甲醇浸提液對白菜、小麥、綠豆種子幼苗生長的影響

由圖3可知，隨著處理濃度的增大，野鴉椿種殼和胚浸提液對白菜幼苗根長和苗高均呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，而且都在濃度為10%時根長和苗高達最大值，即種殼浸提液的根長和苗高分別為2.0 cm和2.2 cm，胚浸提液上述兩個指標依次為3.3 cm、3.7 cm；在同濃度下，種殼和胚浸提液處理的根長和苗高均大于甲醇，種殼浸提液處理的根長和苗高較胚低，表明兩者對白菜幼苗生長均存在促進作用，胚的促進作用較種殼的顯著。

小麥根長和苗高隨著種殼和胚浸提液濃度的升高而顯著降低，在種殼和胚浸提液濃度為40%時均無變化。在同濃度下，種殼和胚浸提液處理的根長和苗高均小于甲醇，種殼浸提液的根長和苗高較胚低，表明野鴉椿種殼和胚浸提液對小麥幼苗生長均存在抑制作用，種殼的抑制作用較胚的明顯。

隨著處理濃度的增加，綠豆幼苗的根長和苗高呈降低的趨勢，在濃度范圍為10%～20%時，種殼和胚浸提液處理的根長和苗高均大于甲醇，種殼浸提液處理下根長和苗高較胚低；在濃度高于20%時，根長大幅度的降低，即在種殼和胚浸提液處理下分別由1.4cm、2.9cm在30%降至為0，在濃度范圍為30%～40%時，種殼和胚浸提液處理下的苗高均低于甲醇，種殼浸提液處理的苗高較胚高。這表明在濃度范圍為10%～20%時，種殼和胚浸提液對綠豆幼苗生長均存在促進作用，胚的促進作用更顯著；而在濃度范圍為30%～40%時，兩者對綠豆幼苗生長存在抑制作用，胚的抑制效果更明顯。

2.3 野鴉椿種子甲醇浸提液對3種底物酶活性的影響

由圖4可知，白菜種子酸性磷酸酶活性隨著濃度的增加顯著降低。在同濃度下，種殼和胚浸提液處理下的酸性磷酸酶活性較甲醇低，種殼浸提液處理下的酸性磷酸酶活性較胚高。說明種殼和胚浸提液對白菜種子酸性磷酸酶活性存在抑制作用，胚的抑制作用更為顯著。

隨著處理濃度的增加，小麥種子淀粉酶活性顯著降低。在同濃度下，種殼和胚浸提液處理下淀粉酶活性較甲醇低，種殼浸提液處理下的淀粉酶活性較胚低。說明種殼和胚浸提液對小麥淀粉酶活性存在抑制作用，種殼的抑制效果更為明顯。

綠豆蛋白酶活性隨著各處理濃度的增加呈逐漸降低的趨勢。在同濃度下，當濃度范圍為10%～20%時，種殼和胚浸提液處理下蛋白酶活性較甲醇高，種殼浸提液處理下的蛋白酶活性較胚低；而在濃度為30%～40%時，種殼和胚浸提液下的蛋白酶活性較甲醇低，且在濃度30%時，種殼浸提液處理下的蛋白酶活性較胚低，但差異不明顯(P>0.05)，而在濃度為40%時， 種殼浸提液處理下的蛋白酶活性較胚高，差異顯著(P<0.05)。由此表明，在濃度范圍10%～20%時，種殼和胚的浸提液對綠豆蛋白酶活性具有促進作用，胚的促進作用更明顯，而在濃度范圍30%～40%時，種殼和胚的浸提液對綠豆蛋白酶活性具有抑制作用，胚的抑制作用更顯著。

圖 4　野鴉椿種子甲醇浸提液對3種底物酶活性的影響Fig. 4　Effects of methanol extract of Euscaphis japonica seeds on activities of acid phosphatase, aamylase and proteases

種殼浸提液對白菜種子萌發(fā)及酶的抑制效果較胚弱；對小麥的抑制作用較胚強；而對綠豆，則在濃度低時，種殼浸提液的促進作用較胚弱，在濃度高時，種殼浸提液的抑制作用較胚弱。由此說明，野鴉椿種殼和胚中都存在較高活性的內源抑制物質，且在種類、性質及含量上均存在差異，其中外殼的抑制物主要作用對象為淀粉類類物質，而胚乳的抑制物作用于油脂類和蛋白類物質。

2.4 野鴉椿種子內源抑制物的分離結果

分離結果表明，野鴉椿種子的種殼和胚中均含有內源抑制物，且其種類繁多，成分復雜；其中，種殼和胚中含有的內源抑制物在種類和含量上存在差異。如表1所示，野鴉椿種殼和胚的分離組分中E、F、G三類物質含量相對其它4類較高，胚中的A、B類物質明顯比種殼的多，其中B類為堿性物質；種殼中的C、D類物質較胚中的多，C、D分別為酸性物質和酚性物質。

表 1　野鴉椿種子種殼和胚中內源抑制物的分離結果

3討論與結論

種子萌發(fā)是一個復雜的過程，脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，在不同種類的種子萌發(fā)過程中扮演重要角色。脂肪在脂肪酶作用下降解為脂肪酸，再經(jīng)β-氧化過程，轉化為蔗糖供胚利用；淀粉在淀粉酶作用下水解為糊精與麥芽糖，再進一步分解為葡萄糖和果糖運送到胚部作為呼吸原料；蛋白質在萌發(fā)過程中，經(jīng)蛋白酶的降解作用生成各種游離氨基酸，以供重組蛋白質利用和脫氫后轉化為糖類供胚利用(鄭光華，2004)。酶的功能會由于化感物質的存在而受到抑制(Turk & Tawaha，2002)，影響種子萌發(fā)。

不同類型的種子對內源抑制物質的感受性不同(中山包，1988；唐鳳鸞等，2014)，選取的白菜、小麥和綠豆種子分別代表了油脂類、淀粉類和蛋白類種子。本研究中，酸性磷酸酶和淀粉酶活性受到顯著的抑制作用，蛋白酶隨著處理濃度的增加逐漸受到抑制作用。其中酸性磷酸酶活性受胚的浸提液的抑制效果最明顯，淀粉酶活性受種殼的抑制作用最強，蛋白酶則在濃度大于20%時才出現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象。這表明野鴉椿種子種殼和胚含有的內源抑制物質存在成分差異，且本研究內源抑制物的分離結果也佐證了這一點。

內源抑制物質在休眠性種子中普遍存在，種類繁多，且存在于種子的不同部位，影響種子萌發(fā)和幼苗生長。其中，生物堿在低濃度下可促進萌發(fā)，在高濃度則表現(xiàn)強抑制作用(Evenari，1949；中山包，1988)。本研究中綠豆的萌發(fā)情況、生長狀況和內源抑制物的分離結果表明，野鴉椿種子中含有堿性或其他類似物質，且胚中的含量高于種殼中的含量，這與覃嘉佳等(2011)的研究結果一致。阿魏酸是由纖維素酶的作用所產(chǎn)生的酸，會與小麥胚芽鞘的非維管細胞壁的碳水化合物締合，是一種常見的萌發(fā)抑制劑(鄭光華 等，1990)，本研究從小麥萌發(fā)情況、生長狀況及內源抑制物的分離結果可推測，野鴉椿種子中含有的酚類物質可能為阿魏酸等類似抑制物質，且種殼中的含量多于胚中的含量，這與黃云等(2014)的研究結果一致。而對白菜種子萌發(fā)受到抑制，幼苗生長則受到促進作用的原因可能是在白菜種子發(fā)芽時，由于化學變化，抑制物質變成了促進物質所致(中山包，1988)。

在種子休眠和萌發(fā)機理研究上，Amen(1968)提出休眠與萌發(fā)取決于抑制物資與促進物質的平衡，這一理論在Webb & Wareing(1972)對歐槭種子休眠的研究中得到證實，即胚中的ABA和中性化合物的存在導致種子萌發(fā)受到抑制，種子休眠依賴于細胞分裂素和抑制劑的相對水平。野鴉椿種子的休眠機理具有復雜性。游雙紅等(2013)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過層積9月后的圓齒野鴉椿種子的內源抑制物質的活性仍較強，楊燕凌(2008)認為低溫沙藏和GA都能顯著提高圓齒野鴉椿種子的萌發(fā)，這表明通過低溫層積，野鴉椿種子的內源抑制物質的含量可能并無顯著減少，而主要促進種子萌發(fā)的原因是低溫促進了胚的生長，同時使促進物質(如GA)增加，從而抑制物質的作用被抵消，萌發(fā)開始。本研究從野鴉椿種子中分離出的C類酸性物質可能為ABA類，這與鄭彩霞等(1991)的研究結果一致。由此可推測，外源施加促進物質(如GA、CK等)可在一定程度上打破野鴉椿種子的休眠。

野鴉椿種子的內源抑制物質是野鴉椿種子深度休眠的主要原因。首先，野鴉椿種殼和胚中均含有較高活性的內源抑制物物質，且性質存在差異，外殼內源抑制物主要作用對象為淀粉類類物質，胚乳內源抑制物主要作用于油脂類和蛋白類物質；其次，野鴉椿種子內源抑制物種類繁多，其在外殼和胚中存在成分及含量差異，外殼中含酚酸類抑制物較胚多，胚中含堿類抑制物較外殼多，且其成分還需進一步的鑒定。種子萌發(fā)是一個復雜的過程，野鴨椿種子萌發(fā)除酶活化程度影響外，還受吸脹吸水、呼吸等作用影響，白菜、小麥及綠豆種子的萌發(fā)受到野鴉椿種子甲醇浸提液的影響，可能影響種子的吸脹吸水，隨著浸提液濃度的增加，測試種子對水的吸收會受到顯著的抑制作用(Han et al，2008；Turk & Tawaha，2003)；也可能與呼吸作用有關，在大多數(shù)情況下，抑制物質會使呼吸發(fā)生障礙，如在氰氫酸的作用下，呼吸作用會受到顯著的影響(中山包，1988)。因此，在種子萌發(fā)的吸水、呼吸等階段還應研究，以求了解其抑制的機理；且野鴉椿種子的內源抑制物與促進物質的平衡關系也有待進一步探究。

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Preliminary study of endogenous inhibitors activity ofEuscaphisjaponicaseeds

LIAO Yuan-Lin， CAI Shi-Zhen*， LI Xi， LIN Rui

(SchoolofLandscapeArchitecture,SichuanAgriculturalUniversity, Chengdu 611130, China )

Abstract:We studied the substrate enzyme activity, germination rate, seedling root length and seedling height of Brassica pekinensis seeds, Triticum aestivum seeds and Vigna radiate seeds, through the methanol extract the shell and embryo of Euscaphis japonica, with different original extract concentrations of 10%, 20%, 30% and 40% and extracted and separated the endogenous inhibitors in methanol leaching liquid of shell and embryo, the activity and ingredients of endogenous inhibitors in Euscaphis japonicaseeds. The results showed that with the increase of leaching solution concentration, the acid phosphatase activity and germination rate of Brassica pekinensis seeds significantly decreased (P<0.05), the inhibitory effects were showed increasing, and the inhibitory effects of shell were less than that of embryo; the root length and seedling heights promotion in low concentrations and inhibitory in high concentrations, and the maximum at the concentration of 10%, the promotion of shell less than embryo. The amylase activity, germination rate, root length and seedling height of Triticum aestivum seeds decreased gradually(P<0.05), the inhibitory effects were showed increasing gradually, while the germination rate was not significantly different at the concentration less than 20% (P>0.05)and it significantly decreased at 20% concentration(P<0.05), it was 0 at 40% concentration, the inhibitory effects of shell were than that of embryo. The protease activity, germination rate and seedling root length and shoot height of Vigna radiata seeds significantly decreased in the leaching solution concentration higher than 20%(P<0.05), and the effects of shell less than embryo. The results of extraction and separation of endogenous inhibitors showed that there were more phenolic acids and less alkaloids in shell than in embryo. It was concluded that high activating endogenous inhibitors existed in shell and embryo of Euscaphis japonica, which showed differences on properties, composition and content. Endogenous inhibitors in shell were mainly starchy materials, which in embryo mainly affected oil and protein materials.

Key words:Euscaphis japonica, methanol extract, endogenous inhibitor, bioassay

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408031

收稿日期:2014-08-25錄用日期： 2014-12-01

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAC09B05)；四川省科技支撐計劃項目(2012ZA0116)[Supported by the National Technology R & D Program during the 12th Five-Year Period(2011BAC09B05); Technology R & D Program of Sichuan Province(2012ZA0116)]。

作者簡介：廖源林(1989-)，女，四川資陽人，在讀碩士研究生，研究方向為野生觀賞花木馴化與培育，(E-mail)1063734909@qq.com。*通訊作者： 蔡仕珍，碩士，高級實驗師，研究方向為野生觀賞花木馴化與培育，(E-mail)415455088@qq.com。

中圖分類號：Q945.34, S686

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0600-07

廖源林，蔡仕珍，李西，等. 野鴉椿種子內源抑制物活性初探[J]. 廣西植物， 2016， 36(5)：600-606

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