吳卓穎，邵威平，張永玲,楊富民，田常慶

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.臨夏州人民醫(yī)院,甘肅 臨夏　731100;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

?

重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)青霉素G酰化酶的條件優(yōu)化

吳卓穎1，邵威平1，張永玲2,楊富民1，田常慶3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.臨夏州人民醫(yī)院,甘肅 臨夏731100;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】研究提高PGA酶活力及穩(wěn)定性.【方法】 以重組枯草芽孢桿菌10397(pMA5-PGA)產(chǎn)PGA酶活力為研究對象，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計，對重組菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了研究.【結(jié)果】 以葡萄糖20.39 g/L、胰蛋白胨15.48 g/L、糊精6.1 g/L為培養(yǎng)基，在三角瓶裝液量16.23%、接種量4.32%、溫度35.43 ℃、時間48.34 h、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min的條件下，所產(chǎn)PGA的酶活力為14.167 U/mL，比初始發(fā)酵條件下發(fā)酵重組菌產(chǎn)PGA的酶活提高了1.14倍.【結(jié)論】 通過條件優(yōu)化，可提高重組枯草芽孢桿菌PGA的酶活力，并為工業(yè)化生產(chǎn)PGA提供科學(xué)依據(jù).

關(guān)鍵詞：重組枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；青霉素G?；福还に噧?yōu)化

青霉素G?；?Penicillin G Acylase，簡稱PGA)是一種重要的工業(yè)用酶，不僅可以催化青霉素水解生產(chǎn)6-APA和7-ADCA，還能催化6-APA、7-ADCA與側(cè)鏈化合物縮合生成各種高效的半合成類抗生素[1-2].并且，作為關(guān)鍵的生物催化劑，PGA在許多具有潛在價值的反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[3].

目前關(guān)于PGA的研究，在分離提純、PGA菌種篩選、構(gòu)建重組工程菌等方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但對產(chǎn)酶菌種的最適發(fā)酵條件、產(chǎn)酶活性與穩(wěn)定性、工程菌的高效表達(dá)等有待進(jìn)一步提高，以便為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持[4-5].戴易興等[6]對重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)PGA發(fā)酵條件作了研究，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化了培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，與初始條件相比將PGA的酶活力提高了85%.楊海波等[7]對產(chǎn)PGA重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在溫度22 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、裝液量60%、發(fā)酵時間96 h的培養(yǎng)條件下，酶活力可達(dá)到94 U/100mL.梁鵬飛等[8]對重組PGA的培養(yǎng)條件作了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不添加任何誘導(dǎo)劑的情況下，將重組菌在28 ℃下培養(yǎng)40 h時，PGA酶活性最大，可達(dá)1.4 U/L.黃鶴等[9]構(gòu)建了基因工程枯草芽孢桿菌菌株，它能分泌表達(dá)巨大芽孢桿菌PGA，還對其表達(dá)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示PGA的表達(dá)量由3～6 U/mL提高至35～40 U/mL，是目前生產(chǎn)用巨大芽孢桿菌表達(dá)量的6倍.Lin Y H等[10]利用重組枯草芽孢桿菌表達(dá)大腸桿菌PGA的絕對酶活力已經(jīng)達(dá)到37.500 U/L等.

為提高重組菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的最佳發(fā)酵工藝條件，本試驗以重組枯草芽孢桿菌10397(pMA5-PGA)產(chǎn)PGA酶活力為研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計，對重組菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，旨在提高PGA酶活力及穩(wěn)定性，更為工業(yè)化生產(chǎn)PGA提供技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1試驗材料

重組菌株枯草芽孢桿菌10397(pMA5-PGA)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗室保存；胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、葡萄糖、糊精、蔗糖等購于試劑公司，均為分析純或生化試劑.

1.2試驗儀器

試驗所用主要儀器為：高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、電子天平、pH計、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、分光光度計、恒溫震蕩搖床.

1.3試驗方法

1.3.1斜面培養(yǎng)基蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、MnSO4·H2O 5 mg、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，調(diào)pH值至7.0.

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.2.1最佳碳源的確定取5個250 mL搖瓶，分別加入10 g/L的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、糊精、果糖作為碳源，在蛋白胨10 g/L、糊精2 g/L的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)；按重組菌1%的接種量接種到含上述營養(yǎng)物質(zhì)的120 mL液體培養(yǎng)基中，恒溫震蕩搖床發(fā)酵36 h，發(fā)酵完成后，參照Balasingham K等[11]的方法測定酶活，測定PGA酶活力，確定最佳碳源.

1.3.2.2最佳碳源質(zhì)量濃度的確定取5個搖瓶，以步驟(1)確定的最佳碳源作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，分別按照10、15、20、25、30 g/L加入碳源，再以蛋白胨10 g/L、糊精2 g/L為基礎(chǔ)，補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)操作同步驟(1)，測定PGA酶活力，確定最佳碳源質(zhì)量濃度.

1.3.2.3最佳氮源的確定取5個搖瓶，根據(jù)步驟(1)所得最佳碳源及步驟(2)所得最佳碳源質(zhì)量濃度向培養(yǎng)基中加入碳源，以糊精2 g/L為基礎(chǔ)，分別加入10 g/L的蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨、酸水解酪蛋白、硝酸銨作為氮源，補(bǔ)充其他基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)操作同步驟(1)，測定PGA酶活力，確定最佳氮源.

1.3.2.4最佳氮源質(zhì)量濃度的確定取5個搖瓶，根據(jù)上述步驟確定的最佳碳源及質(zhì)量濃度與最佳氮源，向培養(yǎng)基中添加適宜的碳源、氮源，再以糊精2 g/L為基礎(chǔ)，分別按照5、10、15、20、25 g/L加入該氮源，補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)操作同步驟(1)，測定PGA酶活力，確定最佳氮源質(zhì)量濃度.

1.3.2.5最佳糊精質(zhì)量濃度的確定取5個250 mL搖瓶，根據(jù)上述步驟確定的最佳碳源質(zhì)量濃度與最佳氮源質(zhì)量濃度，分別按照2、4、6、8、10 g/L質(zhì)量濃度向搖瓶中加入糊精，補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)操作同步驟(1)，測定PGA酶活力，確定最佳糊精質(zhì)量濃度.

1.3.2.6響應(yīng)面設(shè)計依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)、胰蛋白胨質(zhì)量濃度(g/L)、糊精質(zhì)量濃度(g/L)3個因素作為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計方法，以酶活力為響應(yīng)值，對重組菌產(chǎn)PGA培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化.

1.3.3發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1單因素試驗參考徐志南等[5]的方法，以接種量6%、溫度30 ℃、裝液量12%、發(fā)酵時間36 h、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min為基礎(chǔ)，固定其他條件，設(shè)置溫度25、30、35、40、45 ℃，接種量2%、4%、6%、8%、10%，裝液量8%、12%、16%、20%、24%，發(fā)酵時間12、24、36、48、72 h，重復(fù)3次，以酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行單因素對比試驗.

1.3.3.2響應(yīng)面設(shè)計依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇溫度(℃)、發(fā)酵時間(h)、裝液量(%)、接種量(%)4個因素作為自變量，按照Box-Behnken設(shè)計方法，以酶活力為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素五水平響應(yīng)面試驗，對重組菌產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.3.4對照組試驗取葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，糊精6 g/L，補(bǔ)充其他營養(yǎng)物質(zhì)，作為發(fā)酵培養(yǎng)基；在接種量6%、溫度30 ℃、裝液量12%、發(fā)酵時間36 h、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min的條件下發(fā)酵重組菌株，重復(fù)進(jìn)行3次，測其PGA酶活.

1.3.5青霉素G?；府a(chǎn)量及活力測定酶活力測定：參考Balasingham K等[11]的方法，6-氨基青霉烷酸顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及酶活力測定具體方法如下：準(zhǔn)確稱取6-氨基青霉烷酸50.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用0.05 mol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度；用0.05 mol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖液配置20 mg/mL的青霉素G鉀鹽溶液，37 ℃預(yù)熱10 min；按表1將各成分加入到1.5 mL離心管中；37 ℃水浴中反應(yīng)30 min；反應(yīng)液于13 000 r/min離心1 min，吸取上清液1 mL加入各試管中，試管中預(yù)先加入3 mL終止液(20%乙酸與0.05 mol/LNaOH溶液2∶1體積混合)，加入0.5 mL顯色液(0.5%對二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液)；用0號管調(diào)零點(diǎn)，在415 nm波長處，測出1～6號管的光密度值.以光密度值為縱坐標(biāo)，6-APA質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制6-APA標(biāo)準(zhǔn)曲線.

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的試劑添加量

酶活力測定步驟：取1 mL菌液，13 000 r/min離心1 min，棄上清液，用1 mL 0.05 mol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，取50～500 μL重懸菌液，補(bǔ)加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)至體積為500 μL；重懸菌液中加入600 μL 37 ℃預(yù)熱10 min的底物(用0.05 mol/LpH7.5的磷酸鹽緩沖液配20 mg/mL青霉素G鉀鹽溶液)；37 ℃水浴反應(yīng)30 min；反應(yīng)液于13 000 r/min離心1 min，吸取上清液1 mL加入各試管中，試管中預(yù)先加入3 mL終止液(20%乙酸與0.05 mol/L NaOH溶液2∶1體積混合)，加入0.5 mL顯色液(0.5%對二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液)；靜置15 min，在415 nm波長處測定光吸收值.

酶活力計算公式：

Activity(U/L)= 106xC6-APAxV反/M6-APAxtxV菌

式中:M6-APA:6-氨基青霉烷酸分子量，為216；t:反應(yīng)時間，通常為30 min；V菌:參與反應(yīng)的菌液體積，mL；V反:反應(yīng)體系體積，mL；C6-APA:6-氨基青霉烷酸的質(zhì)量濃度，g/L.

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

6-氨基青霉烷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.線性回歸方程為y=0.582 9x+0.006 2，R2=0.998 9，表明線性關(guān)系較好.在測定酶活力時，將測定的吸光值代入上述回歸方程求出6-氨基青霉烷酸濃度，再依據(jù)酶活力定義計算酶活力大小.

2.2.1單因素試驗

2.2.1.1不同碳源對PGA酶活力的影響由圖2可以看出，當(dāng)以葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA酶活達(dá)到最高，為12.967 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；而以麥芽糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時，PGA酶活力最低，為6.596 U/mL；可能是由于重組枯草芽孢桿菌比較容易代謝單糖，從而使PGA酶活達(dá)到最高.

圖1　6-氨基青霉烷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　6-APA standard curve

圖2　不同碳源對PGA酶活力的影響Fig.2　Effect of different carbon sources on the PGA activity

2.2.1.2葡萄糖質(zhì)量濃度對PGA酶活力的影響由圖3可以看出，隨著PGA酶活力增大葡萄糖質(zhì)量濃度先升高，到達(dá)一定值時有所降低，直至保持平穩(wěn)狀態(tài)的規(guī)律.即當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L時，PGA的酶活達(dá)到最高13.038 U/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為10～20 g/L時，PGA的酶活迅速增高；但當(dāng)進(jìn)一步加大葡萄糖質(zhì)量濃度時，PGA酶活有輕微下降趨勢.故最適宜葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L.

2.2.1.3不同氮源對PGA酶活力的影響如圖4所示，在使用有機(jī)氮源的培養(yǎng)液中PGA酶活明顯高于使用無機(jī)氮源的培養(yǎng)液；且當(dāng)以胰蛋白胨為氮源時，PGA酶活力最高，為12.808 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；以無機(jī)氮源硝酸銨作為氮源時，發(fā)酵液中的PGA酶活才達(dá)到9.94 U/mL.

圖3　葡萄糖和胰蛋白胨濃度對PGA酶活力的影響Fig.3　Effect of different glucose and tryptone concentrationon on the PGA activity

圖4　不同氮源對PGA酶活力的影響Fig.4　Effect of different nitrogen sources on the PGA activity

2.2.1.4胰蛋白胨質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)PGA的酶活力的影響由圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中胰蛋白胨質(zhì)量濃度為15 g/L時，PGA的酶活力最高，達(dá)到13.532 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05).而當(dāng)胰蛋白胨質(zhì)量濃度在10～20 g/L時，PGA酶活隨著胰蛋白胨質(zhì)量濃度的升高而迅速升高.進(jìn)一步增加胰蛋白胨質(zhì)量濃度時，PGA表達(dá)則緩慢下降.

2.2.1.5糊精質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)PGA酶活力的影響由圖5可以看出，當(dāng)糊精質(zhì)量濃度為2～6 g/L，隨著糊精質(zhì)量濃度的增加，PGA酶活力緩慢上升；當(dāng)糊精質(zhì)量濃度為6 g/L時，PGA的酶活達(dá)到最高，為14.538 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)糊精質(zhì)量濃度達(dá)到6～10 g/L時，酶活力則迅速降低.故培養(yǎng)基適宜的糊精質(zhì)量濃度為6 g/L.

圖5　糊精質(zhì)量濃度對PGA酶活力的影響Fig.5　Effect of strach concentration on the PGA activity

2.2.2響應(yīng)面試驗響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2、3、4.

試驗結(jié)果采用Design-Expert Trial軟件的ANOVA程序，進(jìn)行二次回歸分析，得到酶活力的變化對A(葡萄糖質(zhì)量濃度)、B(胰蛋白胨質(zhì)量濃度)、C(糊精質(zhì)量濃度)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

酶活=14.25+0.26A+0.33B+0.25C-0.16AB-0.44AC-0.32BC-0.51A2-0.58B2-0.83C2

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表3　ANOVA分析結(jié)果

**極顯著水平(P<0.01)；*顯著水平(P<0.05)；ns不顯著.

表4　方差分析表

如表3、4所示，二次響應(yīng)面回歸模型的P=0.000 9，R2=0.950 0，RADJ=0.885 8，該模型能解釋95%響應(yīng)值的變化，且該模型擬合程度較好，試驗誤差小.從模型的方差分析可以看出，失擬項(P=0.942 0>0.05)差異不顯著，說明該模型較穩(wěn)定.

葡萄糖與胰蛋白胨之間的交互作用對重組菌產(chǎn)PGA酶活力的影響如圖6所示，葡萄糖和胰蛋白胨用量對PGA均有一定影響.當(dāng)糊精質(zhì)量濃度固定時，PGA的酶活力隨著葡萄糖和胰蛋白胨用量的增加，呈明顯的上升趨勢.隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，酶活力的上升趨勢變的較為平緩，即影響較小；但隨著胰蛋白胨質(zhì)量濃度的持續(xù)增加，酶活力呈明顯的上升趨勢，即影響較顯著.

圖6　葡萄糖與胰蛋白胨交互作用對PGA酶活力的影響Fig.6　Effect of interaction between glucose and tryptone on the PGA activity

從圖7可以得出，葡萄糖質(zhì)量濃度與糊精質(zhì)量濃度對PGA的酶活力均有相當(dāng)大的影響.研究表明，當(dāng)固定作為氮源的胰蛋白胨質(zhì)量濃度時，隨著糊精質(zhì)量濃度的增加，PGA的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；而隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的不斷增大，與糊精相比，酶活力呈現(xiàn)的先上升后下降的趨勢較為平緩.

由圖8可以看出，胰蛋白胨質(zhì)量濃度與糊精質(zhì)量濃度對PGA的酶活力均有較顯著的影響，而且兩個因素之間也存在著很明顯的交互作用；研究表明，這二者對PGA酶活力的增加產(chǎn)生相互促進(jìn)作用.

通過對重組菌產(chǎn)PGA的二次多項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20.39 g/L，胰蛋白胨15.48 g/L，糊精6.1 g/L，并得到在上述發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，PGA酶活力的預(yù)測值為14.322 U/mL.

為了檢驗上述模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，用最優(yōu)培養(yǎng)基做了三次平行試驗，其酶活力平均值可達(dá)到14.167 U/mL.說明該模型較理想.

2.3重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1單因素試驗

2.3.1.1發(fā)酵時間發(fā)酵時間對重組菌產(chǎn)PGA酶活力的影響見圖9A.

圖7　葡萄糖與糊精交互作用對PGA酶活力的影響Fig.7　Effect of interaction between glucose and starch on the activity of PGA

圖8　糊精與胰蛋白胨交互作用對PGA酶活力的影響Fig.8　Effect of interaction between tryptone and glucose on the PGA activity

圖9　各因素對青霉素G?；富盍Φ挠绊慒ig.9　Effect of different factors on the PGA activity

隨著發(fā)酵時間的逐漸增加，PGA酶活力迅速升高.當(dāng)發(fā)酵時間到達(dá)48 h時，PGA的酶活力達(dá)到最高，為13.947 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05).隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步增加，PGA酶活力緩慢下降.所以，重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的最適宜發(fā)酵時間是48 h.

2.3.1.2裝液量由圖9A可以看出，隨著發(fā)酵裝液量的逐漸增加，PGA的酶活力也在逐漸增強(qiáng)；當(dāng)發(fā)酵裝液量為16%時，PGA的活力最高，達(dá)到14.838 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；隨著發(fā)酵裝液量的進(jìn)一步增加，PGA酶活力有所下降.所以，重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的最適宜發(fā)酵裝液量是16%.

2.3.1.3溫度由圖9B可知，在一定溫度范圍內(nèi)，重組菌產(chǎn)PGA的酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高而迅速升高；而當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃時，PGA的酶活力達(dá)到最高，為12.967 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05)；隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高，PG的活力緩慢下降.故重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的最適宜的發(fā)酵溫度為35 ℃.

2.3.1.4接種量由圖9B得出，隨著發(fā)酵接種量的增加，PGA的活力迅速增大.當(dāng)發(fā)酵接種量達(dá)到4%時，PGA的活力最高，達(dá)到15.05 U/mL，與其他水平有顯著性差異(P<0.05).但是隨著發(fā)酵接種量的持續(xù)增大，酶活力呈現(xiàn)緩慢下降趨勢.結(jié)果表明：重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的發(fā)酵最適誼的接種量為4%.

2.3.2響應(yīng)面試驗響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5、6、7.

試驗結(jié)果采用Design-Expert Trial軟件的ANOVA程序，進(jìn)行二次回歸分析，得到酶活力變化對A(溫度)、B(時間)、C(接種量)、D(裝液量)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

酶活力=14.40+0.40A+0.19B+0.25C+0.34D+0.055AB-0.17AC-0.11AD+0.30BC-0.32BD-0.56CD-0.85A2-0.63B2-0.62C2-0.73D2

表5　響應(yīng)面試驗結(jié)果

表6　ANOVA分析結(jié)果

**極顯著水平(P<0.01)；*顯著水平(P<0.05)；ns不顯著.

表7　方差分析表

由表6和7的方差分析可知，P<0.000 1說明所得回歸方程極顯著.由F值可知，4個因素的影響順序依次是A>D>C>B.失擬檢驗P=0.659 2>0.05不顯著，說明此回歸模型比較理想，可信度較高.模型校正系數(shù)R2為0.932 9>0.9，說明該模型能解釋93.29%的試驗結(jié)果.模型精密度為12.412>4，說明試驗精度很高.綜合以上分析得知，該模型能準(zhǔn)確地模擬溫度、時間、接種量、裝液量4個因素對PGA酶活力的影響，模型與實(shí)際情況擬合較好.

在模型中，四因素之間交互作用對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的影響如圖10所示.

圖10　四因素之間交互作用對PGA酶活力的影響Fig.10　Effect of four-factors interaction on the PGA activity

由圖10a可以看出，重組菌產(chǎn)PGA的酶活力隨著溫度的升高、發(fā)酵時間的延長，呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢.圖10b表明，在發(fā)酵液中裝液量較少的情況下，PGA的酶活力隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但下降幅度并不大.如圖10c所示，PGA酶活力隨著溫度與發(fā)酵接種量的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度固定在一定的范圍內(nèi)時，接種量對PGA活性的影響并不顯著.從圖10d可以看出，發(fā)酵時間與裝液量之間的交互作用比較顯著.圖10e表明，當(dāng)發(fā)酵裝液量處于較低水平時，酶活力隨著發(fā)酵接種量的增大先上升后下降.圖10f顯示，當(dāng)發(fā)酵接種量較低時，酶活力隨時間的延長先上升后下降，但趨勢線比較平滑，說明裝液量與發(fā)酵時間之間的交互作用不顯著.

通過對PGA的二次多項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，發(fā)現(xiàn)重組菌產(chǎn)PGA的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35.37 ℃，裝液量16.12%，時間48.5 h，接種量4.44%，得到在該工藝條件下，酶活力的預(yù)測值可到達(dá)14.537 U/mL.

為驗證上述模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，采用最佳條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗，酶活力平均值可達(dá)到13.97 U/mL.所以，證明該模型較理想.

3討論

3.1發(fā)酵培養(yǎng)基對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的影響

培養(yǎng)基中的碳源及碳源質(zhì)量濃度與氮源及氮源質(zhì)量濃度對微生物發(fā)酵是一個非常關(guān)鍵的影響因素.本研究確定的培養(yǎng)基碳源為葡萄糖且適宜質(zhì)量濃度為20 g/L，這與范超等[1]研究的結(jié)果基本一致，葡萄糖質(zhì)量濃度在20 g/L時，PGA的酶活達(dá)到最大，超過或低于該水平時，PGA酶活都呈下降趨勢；這可能是因為添加高質(zhì)量濃度的葡萄糖會形成高滲的培養(yǎng)基從而降低發(fā)酵過程中雜菌污染的機(jī)率.但是，培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度過高又可能會產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)從而抑制了PGA的表達(dá)而導(dǎo)致PGA的酶活力下降.研究確定的培養(yǎng)基氮源為胰蛋白胨且適宜質(zhì)量濃度為15 g/L，而仇晶晶[12]研究的最適氮源為蛋白胨，這可能是因為試驗條件及原料的不同造成的.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胰蛋白胨的質(zhì)量濃度高于15 g/L增加時，PGA的產(chǎn)量呈下降趨勢，這可能是因為胰蛋白胨除了用以提供有機(jī)氮外，還包含有大量菌體所必需的生長因子；所以，在過高胰蛋白胨質(zhì)量濃度下，可能會導(dǎo)致菌體的生長過于旺盛而不適宜菌體的發(fā)酵產(chǎn)酶.

3.2發(fā)酵條件對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PGA的影響

確定最適的發(fā)酵周期，對提高重組菌產(chǎn)酶量和較好的經(jīng)濟(jì)效益都是非常重要的.本研究確定的最佳發(fā)酵時間為48 h及最適發(fā)酵溫度為35 ℃，這分別與范超等[1]和仇晶晶[12]的研究結(jié)果保持一致.研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，PGA的酶活緩慢下降，這是因為發(fā)酵時間的增加會使一些其他代謝產(chǎn)物積累，對PGA的分離純化造成一定影響，同時也不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，甚至造成大量浪費(fèi).而對于發(fā)酵溫度低于35 ℃時，使菌體的生長代謝緩慢，從而導(dǎo)致PGA的產(chǎn)量降低；而當(dāng)溫度高于40 ℃時，使酶的合成受阻，重組菌提前進(jìn)入衰老期而導(dǎo)致菌體自溶速度加快，致使PGA產(chǎn)量降低.

本研究確定的最適接種量為4%及最適裝液量為16%.研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵裝液量的持續(xù)增加，酶活力則逐漸下降；而且過高的裝液量會導(dǎo)致酶活力的下降，這可能是因為供氧氣不充足造成的.對于發(fā)酵接種量的研究發(fā)現(xiàn)，如果接種量過大，會使菌體迅速生長，代謝產(chǎn)物積累過多，使發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，抑制菌體的后期生長；不但影響PGA的產(chǎn)酶量，更不利于工業(yè)生產(chǎn).但是，如果接種量過少，則會延長菌體延遲期、容易污染，增加了遺傳變異的機(jī)會，不利于外源基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，造成浪費(fèi)增加生產(chǎn)成本.

在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件下，PGA的酶活為14.167 U/mL，比初始發(fā)酵條件下發(fā)酵重組菌產(chǎn)PGA的酶活提高了1.14倍.比2013年顏麗等[13]通過巨大芽孢桿菌產(chǎn)PGA的酶活提高了將近6倍.

4結(jié)論

1)重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖20.39 g/L，胰蛋白胨15.48 g/L，糊精6.1 g/L；并在該培養(yǎng)基條件下，PGA酶活力可達(dá)到14.321 6 U/mL.

2)重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)PGA的最優(yōu)發(fā)酵條件為：溫度35.37 ℃，裝液量16.12%，時間48.5 h，接種量4.44%；并在該條件下發(fā)酵可知，PGA的酶活力達(dá)到13.97 U/mL.

3)在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件下，PGA的酶活可達(dá)到14.167 U/mL，比初始發(fā)酵條件下發(fā)酵重組菌產(chǎn)PGA的酶活提高了1.14倍.

參考文獻(xiàn)

[1]范超,黎繼烈,吳浩，等.重組巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；赴l(fā)酵條件的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2011,31(7):124-129

[2]Thomas R M,Barends H Y,Bauke W D.Three-dimensional structures of enzymes useful for P-lactam antibiotic production[J].Current Opinion in Biotechnology,2004,15:356-363

[3]徐威,周麗娜,郭曉艷.胞外青霉素?；府a(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2007,14(4):269-272

[4]崔鵬,萬敏.霉素?；傅纳a(chǎn)與應(yīng)用新進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù),2005,26(6):42-45

[5]徐志南,陳秀奇,陳新愛，等.重組枯草芽抱桿菌生產(chǎn)青霉素G?；赴l(fā)酵條件的研究[J].高效化學(xué)工程學(xué)報,2003,17(3):266-271

[6]戴易興.基因工程菌產(chǎn)PGA發(fā)酵條件的研究[D].無錫：江南大學(xué),2012

[7]楊海波,虞星炬,曲大明，等.含青霉素酰化酶的重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝,2006,15(3):333-336

[8]梁鵬飛.重組青霉素G?；冈诖竽c桿菌中的重組型表達(dá)及其固定化[D].北京：北京化工大學(xué),2008

[9]黃鶴,楊晨,李仁寶，等.重組青霉素G?；冈诳莶菅勘U菌中的表達(dá)條件優(yōu)化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2001,17(2):173-177

[10]Lin Y H,Hsiao H C,Chou C P.Strain improvement to enhance the production of recombinant penicillin acylase in high-cell-density[J].Escherichia colicultures Biotechnology,2002,18(6):1458-1461

[11]Balasingham K,Wathurton D,Dunnili P,et al.The isolation and kincties ofPenicillinAmidasefromEscherichiacoli[J].Biochemical and Biophysical,1972,276:250-256

[12]仇晶晶.響應(yīng)面法優(yōu)化重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G酰化酶[D].杭州：浙江理工大學(xué),2012

[13]顏麗,張永玲,楊富民，等.巨大芽孢桿菌產(chǎn)青霉素G?；傅臈l件優(yōu)化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,48(6):140-148

(責(zé)任編輯趙曉倩)

Optimization of fermentation for Penicillin G acylase with recombinantBacillusmegaterium

WU Zhuo-ying1,SHAO Wei-ping1,ZHANG Yong-ling2,YANG Fu-min1,TIAN Chang-qing3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Linxia First People's Hospital,Linxia 731100,China;3.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】This paper was aimed at improving the activity and stability of Penicillin G acylase.【Method】It was focused on PGA activities of recombinant Bacillus megaterium(10937),the medium and fermentation conditions for Penicillin G acylase production with recombinant Bacillus megaterium were studied basing on single factor test by response surface method.【Result】 The medium should contain glucose 20.39 g/L,tryptone 15.48 g/L,starch 6.1 g/L and the fermentation conditions were determined as volume of liquid 16.23%,the amount of inoculation 4.32%,temperature 35.4 ℃,fermentation time 48.34 h,shaking speed 220 r/min.The activity of Penicillin G acylase reached 14.167 U/mL and increased 1.14 times more than that under initial conditions.【Conclusion】With the optimization of conditions,the activity of PGA from recombinant Bacillus megaterium (10937) can be improved and provide important basis for industrialized production.

Key words：Bacillus megaterium；fermentation ；penicillin G Acylase；process optimization

通信作者：邵威平,男,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事發(fā)酵工程研究.E-mail:shaowp99@163.com

基金項目：甘肅省科技重大專項(1102NKDN058).

收稿日期：2015-02-24；修回日期：2015-04-07

中圖分類號：Q 814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)02-0116-11

第一作者：吳卓穎(1988-),女,碩士研究生,研究方向為食品科學(xué).E-mail:wuzy20126@163.com