毛敬，韓志敏，周木蘭，董玲玲

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持續(xù)性牽張力在高糖狀態(tài)下對子宮平滑肌細胞收縮蛋白表達的影響

毛敬，韓志敏，周木蘭，董玲玲

【摘要】目的：探討持續(xù)性牽張力在高糖環(huán)境下對大鼠子宮平滑肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠子宮平滑肌細胞，高糖作用不同時間后，觀察高糖狀態(tài)下大鼠子宮平滑肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達變化情況。對高糖狀態(tài)下的肌細胞施加持續(xù)性牽張力，明確牽張力對肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達的影響以及高糖和牽張力之間的協(xié)同作用，同時采用晚期糖基化終末產物（AGEs）抑制劑（sRAGE）拮抗高糖作用作為對照，比較加入抑制劑后，催產素受體和前列腺素受體表達變化情況。結果：單獨高糖培養(yǎng)或單獨持續(xù)性牽張力都可導致大鼠子宮平滑肌細胞裂解液中催產素受體和前列腺素受體表達量上升，二者同時施加，可使催產素受體和前列腺素受體表達進一步上升，并有一定的協(xié)同效應。加入sRAGE后均可使催產素受體和前列腺素受體表達部分下降，但仍高于生理糖濃度組。結論：高糖狀態(tài)及牽張力均可促進肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達增加，并有一定協(xié)同作用，AGEs參與了這一過程，但并不是唯一途徑。

【關鍵詞】應力，物理；葡萄糖；子宮；肌細胞，平滑肌；收縮蛋白質類；受體，催產素；受體，前列腺素

作者單位：200126上海，同濟大學附屬第一婦嬰保健院

（J Int Obstet Gynecol，2016，43：230-233）

妊娠期糖尿病是目前婦產科臨床上常見的一種疾病，國內統(tǒng)計其發(fā)生率將近占全部孕婦的20%［1］，并有逐年上升趨勢，對孕婦和胎兒均有不同程度的危害，其并發(fā)癥的發(fā)生率與孕婦妊娠期糖尿病的嚴重程度成正比。平滑肌是子宮最主要的成分，妊娠期糖尿病患者子宮平滑肌組織處于一個特殊的環(huán)境，不僅受高糖環(huán)境的影響，也受妊娠時子宮膨大的牽張力的影響，子宮肌肉組織收縮活性的異常，易引發(fā)流產、早產、胎盤功能不全和胎兒發(fā)育異常等并發(fā)癥。目前研究表明高糖環(huán)境或牽張力可導致多種細胞增殖活性降低，引發(fā)凋亡現象［2-4］，但關于高血糖對子宮肌肉組織收縮蛋白有何影響、是通過何種途徑實現的以及牽張力在其中的作用，目前尚少見報道。另有研究表明，高糖狀態(tài)下晚期糖基化終末產物（AGEs）聚集，與晚期糖基化終末產物受體（RAGE）結合，進而可以通過多種方式激活下游因子并影響細胞功能，可溶性RAGE（sRAGE）可競爭性與AGEs結合，從而阻斷AGEs與RAGE的結合，抑制AGEs的功能［5-6］，包括細胞增殖、分化及凋亡等。本實驗通過體外培養(yǎng)大鼠子宮平滑肌細胞，闡明在高糖環(huán)境和牽張力雙重作用下，子宮平滑肌細胞相關收縮蛋白催產素受體和前列腺素受體表達的變化情況，并進一步明確AGEs抑制劑對此過程的調控作用，以期為降低妊娠期糖尿病并發(fā)癥提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器胎牛血清（美國Gibco公司），細胞培養(yǎng)基（DMEM，美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），Triton X-100（美國Sigma公司），乙二胺四乙酸（EDTA，美國Amresco公司），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海研域化學試劑有限公司），細胞培養(yǎng)箱（美國ThermoForma公司），ELx800 uv型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek公司），TDZSWS型自動平衡高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），溫控超速離心機（德國Eppendorf公司），FV500激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2大鼠肌細胞預處理分離培養(yǎng)正常大鼠子宮平滑肌細胞，噻唑藍（MTT）比色法觀察細胞增殖情況并繪制細胞生長曲線，細胞接種于96孔培養(yǎng)板，從次日開始每天取出一個培養(yǎng)板，共檢測7 d。每孔加入MTT溶液20 mL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 mL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，使甲瓚充分溶解，用Synergy HT多功能酶標儀選擇490 nm波長，測定吸光度值（A值），并以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線。因對數生長期細胞是細胞增殖最活躍的時期，各項指標表達相對顯著并且穩(wěn)定，因此本研究采取對數生長期細胞進行試驗。1.3高糖狀態(tài)對肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達的影響采用對數生長期細胞，生理糖濃度（5.5 mmol/L）進行細胞培養(yǎng)24 h，在細胞培養(yǎng)基中加入葡萄糖，使培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度達到35 mmol/L，高糖狀態(tài)下對大鼠子宮平滑肌細胞進行體外培養(yǎng)，時間分別為0，6，12，24 h，然后采用蛋白質印跡法（Western-blot法）檢測各時間點細胞裂解液中催產素受體和前列腺素受體的濃度變化情況。

1.4牽張力和高糖協(xié)同作用下肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達的變化采用對數生長期細胞，生理糖濃度（5.5 mmol/L）進行細胞培養(yǎng)24 h，本實驗共分6組，對照組（C組）采用生理糖濃度繼續(xù)培養(yǎng)24 h；高糖組（G組）采用高糖濃度（35 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；高糖＋抑制劑組（G+sRAGE組）細胞在其培養(yǎng)液中加入AGEs的抑制劑sRAGE（濃度為1mg/L），于加入葡萄糖的同時加入，作用時間同為24 h，拮抗高糖作用；牽張力組（F組）細胞采用美國Flexercell公司細胞拉伸加載裝置對細胞進行應力加載，根據參考文獻及預實驗［4］，力值大小為細胞表面拉伸力的20%，性質為持續(xù)性牽張應力，持續(xù)時間24 h；高糖＋牽張力組（G+F組）細胞加入高糖的同時施加牽張力，作用時間同為24 h；高糖＋牽張力＋抑制劑組（G+ F+sRAGE組）細胞加入高糖的同時施加牽張力，并同時加入AGEs的抑制劑sRAGE（濃度為1 mg/L），作用時間同為24 h； Western-blot法檢測細胞裂解液中催產素受體和前列腺素受體的濃度變化情況。

1.5Western-blot法測定催產素受體和前列腺素受體含量每組細胞收集1×107個細胞，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，裂解后常規(guī)提取總蛋白，繪制蛋白標準曲線，聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，化學發(fā)光法檢測每組樣本中催產素受體和前列腺素受體蛋白含量，并分別與各自內參（Actin）對比，即比較目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值，檢測相對含量并進行統(tǒng)計分析。

1.6統(tǒng)計學方法用SPSS 17.0軟件對所得數據進行分析。定量資料用均數±標準差（±s）表示，高糖狀態(tài)不同時間點對受體表達影響采用重復測量資料的方差分析；牽張力和高糖作用對受體表達的影響為2×2析因設計資料，采用析因方差分析；加入sRAGE后對受體表達的影響采用兩獨立樣本均數比較的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

MTT法檢測大鼠子宮平滑肌細胞生長曲線呈S型，細胞第1～2天處于靜止期，無明顯增長，從第3天開始進入快速生長期，細胞增殖加速，第6天開始進入平臺期，生長受到抑制，見圖1。本實驗選擇第3天的細胞進行后續(xù)實驗。

圖1　大鼠子宮平滑肌細胞生長曲線

本實驗結果發(fā)現，隨著高糖作用時間增加，細胞裂解液中催產素受體（F時間=22.549，P=0.000）和前列腺素受體（F時間=20.21，P=0.000）表達量上升，差異有統(tǒng)計學意義，見表1、圖2和圖3。

表1　高糖作用下肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達變化?。ā纒）

表1　高糖作用下肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達變化?。ā纒）

注：a與0 h比較；b與6 h比較；c與12 h比較，均P＜0.05。

指標名稱　檢測結果0 h　6 h　12 h　24 h催產素受體　0.363±0.074 0.447±0.100 0.687±0.060ab0.850±0.085ab前列腺素受體0.243±0.035 0.313±0.045 0.427±0.047a0.650±0.115abc

析因方差分析示，單獨高糖培養(yǎng)或單獨持續(xù)性牽張力都可導致大鼠子宮平滑肌細胞裂解液中催產素受體（FG=112.94，FF=99.07）和前列腺素受體（FG= 136.91，FF=121.57）表達量上升（P＜0.05）；二者同時施加，可使催產素受體（FG×F=15.77）和前列腺素受體（FG×F=7.91）表達進一步上升，二者存在協(xié)同作用（P＜0.05）。在高糖狀態(tài)下以及高糖和牽張力同時存在時分別加入sRAGE后均可使催產素受體和前列腺素受體表達下降，但仍高于生理糖濃度和單獨牽張力時的催產素受體和前列腺素受體表達水平（P＜0.05），見表2、表3、圖4和圖5。

圖2　高糖狀態(tài)對肌細胞催產素受體的影響

圖3　高糖狀態(tài)對肌細胞前列腺素受體的影響（Western-blot法）

圖4　高糖、牽張力及sRAGE對肌細胞催產素受體的影響

圖5　高糖、牽張力及sRAGE對肌細胞前列腺素受體的影響（Western-blot法）

表2　牽張力和高糖作用下肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達變化?。ā纒）

表2　牽張力和高糖作用下肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達變化?。ā纒）

組別　n　催產素受體　前列腺素受體C組　3　 0.223±0.045　0.213±0.040 G組　3　 0.453±0.049　0.477±0.059 F組　3　 0.417±0.025　0.457±0.055 G+F組　3　 0.903±0.086　0.887±0.049 G+sRAGE組　3　 0.333±0.040　0.333±0.038 G+F+sRAGE組　3　 0.687±0.080　0.653±0.102

表3　各組合分析的統(tǒng)計量值

3　討論

在分娩調節(jié)中，臨產后一個重要變化是一系列炎性介質的釋放［如白細胞介素1（IL-1）、IL-6、IL-8］及收縮相關蛋白在子宮平滑肌細胞膜的協(xié)調表達，臨產后觸發(fā)強烈而協(xié)調的宮縮將胎兒娩出［7-8］。這些收縮蛋白主要包括催產素受體、前列腺素受體、β-腎上腺素受體、促腎上腺皮質激素釋放激素受體以及鉀離子通道蛋白等［9-11］。子宮催產素受體在整個妊娠期逐漸增加，產程開始后子宮平滑肌的催產素受體水平比正常子宮高200多倍。前列腺素可通過前列腺素E受體1和3（EP1和EP3），促進細胞內第二信使磷脂酰肌醇/二酰甘油（IP3/DAG）表達、降低細胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，使細胞質鈣離子濃度升高，從而收縮平滑肌。但在高糖狀態(tài)下，機械牽張力是否會對催產素及其受體途徑產生影響，具體機制如何，少見報道。因此，本研究重點探討催產素受體及前列腺素受體在高糖和牽張力影響子宮平滑肌細胞收縮功能過程中的表達變化情況，為后續(xù)實驗奠定基礎。

Zhang等［12］在實驗中發(fā)現，經過小劑量鏈脲佐菌素處理過的小鼠，胰島素的分泌降低，對照組小鼠表現出明顯的高血糖，而中樞注射催產素的治療組小鼠血糖得到明顯改善，并且血清胰島素水平提高，該研究提示催產素有一定的降血糖作用，而本研究結果也表明子宮肌細胞催產素受體的分泌量隨著高糖作用時間的增加而顯著上升，說明高糖可以呈時間依賴性地促進催產素受體的表達，這與趙軍等［13］研究結果一致。高糖條件下催產素分泌量表達升高，進而起到一定的降血糖作用，可能是自體神經內分泌調控機制起到的保護作用，其具體機制有待于進一步研究，但這一過程可能與腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路有關，研究發(fā)現催產素能夠誘導骨骼肌細胞的葡萄糖攝取，并刺激骨骼肌細胞內鈣離子濃度增加，啟動鈣調蛋白依賴性蛋白激酶，上調AMPK的活性，AMPK可以磷酸化磷酸果糖激酶，增加其活性，進一步增強糖酵解途徑，最終提高對葡萄糖的攝?。?4］。盡管如此，以上研究都沒有涉及到細胞力學刺激在這一過程中的作用。

本研究還發(fā)現，牽張力本身也可以促進催產素受體和前列腺素受體的表達，這完全符合體內妊娠過程的實際生理情況，即在妊娠末期，子宮過度膨大，平滑肌所受的牽張力也達到最大，此時催產素受體和前列腺素受體的表達可協(xié)助啟動分娩過程。但在以往研究中，尚未查閱到有文獻報道牽張力和高糖共同作用對肌細胞收縮相關蛋白的影響，因而本研究正是對這一方面進行了補充，本研究結果表明，牽張力和高糖有一定的協(xié)同作用，表現為牽張力可以加劇高糖狀態(tài)促進肌細胞催產素受體和前列腺素受體表達升高這一過程，說明高糖環(huán)境下妊娠期子宮更易受到牽張力的影響，導致收縮蛋白表達增加。收縮蛋白的異常表達會使得子宮平滑肌收縮異常，進而引發(fā)流產、早產、胎盤功能不良及胎兒發(fā)育異常等并發(fā)癥，糖尿病妊娠者早產發(fā)生率可達到10%～25%，胎兒畸形率也高于非糖尿病孕婦，嚴重畸形發(fā)生率為正常妊娠的7～10倍，且與受孕后最初數周高血糖水平密切相關，是構成圍生兒死亡的重要原因。

本研究還發(fā)現，AGEs的抑制劑sRAGE部分抑制這一過程，但不能完全阻斷，表現為加入sRAGE后，催產素受體和前列腺素受體的表達雖然低于不加入組（即G+sRAGE組低于G組，G+F+sRAGE組低于G+F組），但仍高于對照組（即G+sRAGE組高于C組，G+F+sRAGE組高于F組），說明高糖狀態(tài)下AGEs的聚集雖然可以引起肌細胞催產素受體和前列腺素受體的表達升高，但并不是唯一途徑，高糖狀態(tài)還可能通過其他途徑引起相應收縮蛋白表達升高，因此單一的抑制劑不能完全阻斷這一效果。

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［本文編輯秦娟］

Effect of Continuous Stretch on Contractile Protein Expression of Uterine Smooth Muscle under High Glucose Circumstance

MAO Jing，HAN Zhi-min，ZHOU Mu-lan，DONG Ling-ling. Shanghai First Maternity and Infant Hospital，Tongji University，Shanghai 200126，China

【Abstract】Objective：To analyze the effect of continuous stretch on oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression of uterine smooth muscle cells under high glucose circumstance. Methods：Rat uterine smooth muscle cells were separated and cultured under high glucose circumstance for different durations，then we detected oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression changes of smooth muscle cells. Continuous stretch was forced on cells under high glucose circumstance to determine synergistic effect of stretch and high glucose. At the same time，as a control team，advanced glycation end products（AGEs）inhibitor（sRAGE）was added to antagonize the effect of high glucose，then evaluate the expression of oxytocin receptors and prostaglandin receptors. Results：Both high glucose circumstance and continuous stretch could lead to oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression of rat uterine smooth muscle cells increasing. Exerting high glucose and continuous stretch simultaneously could promote oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions even further and synergistic effect could be detected. After adding sRAGE，oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions decreased to some extend，but not completely，still higher than the normal glucose teams. Conclusions：Both continuous stretch and high glucose could promote oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions and there exist a synergistic effect between them. AGEs was involved in this process，but this is not the only signal pathway.

【Keywords】Stress，mechanical；Glucose；Uterus；Myocytes，smooth muscle；Contractile proteins；Receptors，oxytocin；Receptors，prostaglandin

收稿日期：（2015-09-08）