包蕓+李瓊+唐峰

摘 要 目的：觀察乳腺癌患者術(shù)前短期化療對腫瘤細(xì)胞中P -糖蛋白（P-gp）以及相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，并探討其臨床意義。方法：選擇2002—2007年40例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，均經(jīng)紫杉醇和表阿霉素治療后行改良根治術(shù)。對手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行HE染色，比較患者化療前、后腫瘤大小、組織形態(tài)學(xué)變化及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。采用免疫組化法檢測P-gp及相關(guān)因子[表皮生長因子受體（EGFR）、C-erbB-2、CD147、Ki67）表達(dá)。結(jié)果：化療后，40例患者中10例出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，4例有大片腫瘤組織壞死，腫瘤間質(zhì)膠原纖維彌漫增生，腫瘤細(xì)胞密度減少，散在分布?；熐啊⒑驪-gp陽性率分別為35.0%和60.0%（P>0.05），EGFR陽性率分別為42.5%和80.0%（P<0.01）；化療后C-erbB-2、CD147、Ki67陽性率均較化療前明顯下降。EGFR、P-gp和C-erbB-2表達(dá)與臨床分期、腫瘤大小、細(xì)胞核分級無關(guān)；化療前P-gp表達(dá)與EGFR、C-erbB-2和CD147無明顯相關(guān)性。結(jié)論：乳腺癌術(shù)前短期化療可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)EGFR表達(dá)增強(qiáng)，但并不引起CD147等會導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的下游因子表達(dá)，提示在腫瘤進(jìn)展中腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性耐藥與其侵襲力可能并無關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞 乳腺癌 P -糖蛋白 表皮生長因子受體 化療

中圖分類號：R737.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2016）10-0006-05

The effect of short-term chemotherapy preoperatively on P-glycoprotein expression in breast cancer

BAO Yun， LI Qiong， TANG Feng

（Department of Pathology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To observe the effect of short-term chemotherapy preoperatively on the expression of P-glycoprotein（P-gp）and some related factors in patients with breast cancer and its clinical significance. Methods： Forty patients with invasive ductal breast cancer confirmed by biopsy were treated with paclitaxel and epirubicin for 2-3 courses followed by modified radical mastectomy from 2002 to 2007. The surgical specimens were stained using HE， and tumor size， histological changes， and the local lymph node metastasis were compaired before and after chemotherapy. The expressions of P-gp and some related factors of epidermal growth factor receptor（EGFR）， C-erbB-2， CD147 and Ki67 were assessed by immunohistochemistry. Results： After chemotherapy， a large number of inflammatory cell infiltration was found in 10 cases and necrosis in 4 cases. It showed that the collagen fibers were proliferated and the density of cancer cells was reduced and scattered. The positive rate was 35.0% and 60.0% in P-gp expression（P>0.05）， and was 42.5% and 80.0% in EGFR expression befor and after chemotherapy（P<0.01）， respecitvely. The positive rates of C-erbB-2， CD147 and Ki67 were decreased after chemotherapy. The expressions of P-gp， EGFR and C-erbB-2 had no relation with clinical stage， tumor size and grade of the nucleus， so as the expression of P-gp， befor chemotherapy， with EGFR， C-erbB-2 and CD147. Conclusion： Short-term chemotherapy can kill tumor cells and increase the expression of EGFR， but does not alter the expressions of downstream factors such as CD147 that enough to cause the metastasis of tumor cells， which indicates that during the progression of breast cancer there was no relationship between invasion/ metastasis of tumor cells and primary drug resistance.

KEY WORDS breast cancer； P-glycoprotein； epidermal growth factor receptor； chemotherapy

化療可有效緩解甚至治愈某些人類腫瘤，但在臨床上，腫瘤細(xì)胞在化療進(jìn)程中普遍會產(chǎn)生耐藥性，特別是多藥耐藥（MDR），從而嚴(yán)重影響腫瘤治療的臨床療效。腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制較復(fù)雜[1-2]，與細(xì)胞周期、增生狀態(tài)及生化機(jī)制如解毒、細(xì)胞藥物運(yùn)輸或DNA復(fù)制和修復(fù)有關(guān)[3]。已發(fā)現(xiàn)跨膜藥泵基因擴(kuò)增是造成耐藥的最重要原因，對MDR研究最多的是MDR1基因。該基因編碼的細(xì)胞膜上的P-糖蛋白（P-gp）能將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外而引起腫瘤耐藥，當(dāng)腫瘤暴露于某一化療藥物后，可以上調(diào)MDR1基因表達(dá)，從而誘發(fā)腫瘤對其他多種化療藥物耐受。有研究證實P-gp表達(dá)與CD147表達(dá)密切相關(guān)，提示腫瘤細(xì)胞的獲得性耐藥與其侵襲性增強(qiáng)

密切相關(guān)[4]。

目前，乳腺癌術(shù)前化療因具有可使瘤體縮小、降低腫瘤細(xì)胞活力、防止術(shù)中瘤細(xì)胞播散和轉(zhuǎn)移等而普遍采用。但是，短期化療對腫瘤細(xì)胞的MDR和腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的效果尚少有評價。本研究對化療前、后乳腺癌組織進(jìn)行檢測，探討乳腺癌中P-gp表達(dá)與表皮生長因子受體（EGFR）、C-erbB-2、CD147表達(dá)間的關(guān)聯(lián)，以期發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞原發(fā)性耐藥與侵襲力間的關(guān)系。

1 材料及方法

1.1 一般資料

收集上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2002—2007年乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者40例，年齡31～68歲，平均51歲，均經(jīng)活檢病理證實，在行乳腺改良根治術(shù)前經(jīng)紫杉醇及表阿霉素治療2～3個療程。按TNM分期，Ⅲa 37例，其中34例腫瘤直徑>5 cm，3例<5 cm；Ⅱb 3例，腫瘤直徑均<5 cm。手術(shù)后證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例（65.0%）。

1.2 方法

1.2.1 病理觀察

取乳腺穿刺標(biāo)本（大部分為條索狀組織）5～10條，長度1.0～1.2 cm，直徑0.1～0.2 cm；乳腺手術(shù)標(biāo)本分別于腫塊及交界處取材（1 cm×1 cm×0.3 cm），所有標(biāo)本用4%甲醛液固定，石蠟包埋，切片（厚4 mm），常規(guī)HE染色。

1.2.2 免疫組化檢測

實驗中P-gp（Labvision）、EGFR（Labvision）、C-erbB-2（Dako）、CD147（Dako）和Ki67（Novocastia）一抗均按1∶50稀釋，采用EnVision兩步法染色。①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟3次。②經(jīng)100%、95%、80%乙醇蒸餾水水化，蒸餾水充分洗凈。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：0.3% H2O2甲醇液置室溫10 min，TBS（0.05 mol/L，pH 7.6，下同）洗5 min×3次。④微波高溫法抗原修復(fù)：枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）高溫預(yù)熱10 min，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中火加熱5 min×2次，低火保溫5 min，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗2次后用TBS洗5 min×3次。⑤去除組織非特異性吸附：5%小牛血清37 ℃孵育20 min（無需洗凈）。⑥滴加一抗（陰性對照片以TBS代替一抗）37 ℃溫箱1 h，TBS洗5 min×3次。⑦滴加二抗：EnVision抗鼠工作液，37 ℃溫箱1 h，TBS洗5 min×3次。⑧辣根過氧化物酶新鮮配制DAB顯色液：10 ml TBS液中加入4 mg DAB，充分混勻，滴加0.5 ml H2O2，室溫下顯色10 min。⑨常規(guī)蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗，烘干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果評定

P-gp：陽性反應(yīng)物主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀。以腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)弱程度進(jìn)行半定量測定，每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野，以陽性細(xì)胞所占比例的平均值定義為陽性細(xì)胞率（%）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤10%為（-）；>10%～25%為（+）；>25%～75%為（++）；>75%為（+++），并重復(fù)2次。

EGFR和CD147：陽性反應(yīng)物質(zhì)大多位于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亦有少量。光鏡下觀察5個具有代表性的高倍視野，分別計數(shù)200個細(xì)胞，共1 000個細(xì)胞。按陽性細(xì)胞所占比例分別計分，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)0計0分，1%～50%計1分，51%～80%計2分，>80%計3分。染色深度以大多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)，不著色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，深棕黃色計3分。根據(jù)這2項指標(biāo)的分?jǐn)?shù)之和分為4級，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強(qiáng)陽性（+++）。

C-erbB-2：陽性表達(dá)為細(xì)胞膜呈清晰的棕色染色。強(qiáng)度評定分為-、+、++和+++，腫瘤細(xì)胞無著色為（-），<10%的腫瘤細(xì)胞胞膜輕度著色為（+），>30%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)連續(xù)而完整的強(qiáng)胞膜陽性為（+++），介于中間者為（++）。

Ki67蛋白：陽性染色為腫瘤細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野，以陽性細(xì)胞所占比例的平均值定義為陽性細(xì)胞率（%）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤10%為（-）；>10%～25%為（+）；>25%～75%為（++）；>75%為（+++），并重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用百分率表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理觀察

大體可見乳腺組織呈灰紅和灰黃色。光鏡下見化療前腫瘤細(xì)胞呈巢狀、片狀分布（圖1a），腫瘤伴壞死1例（2.5%），伴炎癥細(xì)胞浸潤2例（5.0%）。細(xì)胞核有異形，核分級Ⅰ級4例，Ⅱ級31例，Ⅲ級5例。化療后腫瘤組織出現(xiàn)明顯變化，主要改變有10例出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤（圖1b），其中4例伴有大片壞死（圖1c）；腫瘤間質(zhì)膠原纖維彌漫增生，腫瘤細(xì)胞密度減少，呈散在分布（圖1d）。

圖1 腫瘤細(xì)胞化療前、后形態(tài)學(xué)特征（HE，×200）

2.2 免疫組化觀察

40例患者中，化療前P-gp表達(dá)陰性26例，陽性14例（35.0%），化療后表達(dá)陰性16例，陽性24例（60.0%），治療前、后P-gp表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 P-gp與臨床及各蛋白間的關(guān)系

P-gp表達(dá)與腫瘤臨床分期、大小、細(xì)胞核分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（表1）；與EGFR、C-erbB-2、CD147蛋白表達(dá)均無明顯相關(guān)性（表2）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成化療失敗的主要原因，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥的分子機(jī)制很復(fù)雜，目前認(rèn)為主要有4個方面：①跨膜藥泵基因的擴(kuò)增或過表達(dá)，這類基因以MDR1（產(chǎn)生P-gp）最為重要[5-7]，另外，還發(fā)現(xiàn)一些耐藥相關(guān)分子如多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）；②細(xì)胞內(nèi)一些蛋白酶的變化引起細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)，如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Pi的表達(dá)或活性增加；③核酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ含量減少或性質(zhì)改變；④其他因素，其中跨膜藥泵基因的擴(kuò)增被認(rèn)為是造成耐藥的最重要原因。

MDR1定位于第7號染色體，基因蛋白編碼區(qū)由27個外顯子組成，其編碼的170×103的P-gp屬于腺苷三磷酸結(jié)合蛋白超家族成員，P-gp的主要生理功能可能與各種保護(hù)屏障有關(guān)，在耐藥細(xì)胞膜上過表達(dá)。P-gp具有ATP依賴性藥物泵功能，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物接觸時，脂溶性藥物按濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)，藥物與P-gp結(jié)合，同時水解ATP獲得能量，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷下降，使藥物對細(xì)胞的損傷減弱直至消失，最終出現(xiàn)耐藥[8-10]。

Yang等[8]將耐藥小鼠白血病細(xì)胞接種于同種小鼠腹腔后用P-gp相關(guān)藥物治療，與接種耐藥腫瘤細(xì)胞后用P-gp不相關(guān)藥物治療或接種不耐藥腫瘤細(xì)胞用同樣化療藥物相比，其肝臟轉(zhuǎn)移程度更為明顯，小鼠帶瘤生存時間也較短。這一現(xiàn)象提示P-gp的表達(dá)及其轉(zhuǎn)運(yùn)藥物能力與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。Yang等[4]的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)的耐藥乳腺癌細(xì)胞株（MCF7/AdrR）CD147和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)明顯高于不耐藥細(xì)胞，提示耐藥細(xì)胞的高侵襲性可能與CD147的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。文獻(xiàn)中也有報道腫瘤細(xì)胞分泌的CD147可以通過自分泌和旁分泌作用刺激腫瘤周圍成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生多種MMP降解周圍基質(zhì)而引起腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[11]。

然而，少有P-gp與CD147的內(nèi)在聯(lián)系以及MDR藥物在其中作用的報道，特別是惡性腫瘤術(shù)前短期化療中是否存在上述現(xiàn)象亦少見報道。我們前期的體外研究發(fā)現(xiàn)，MDR藥物可以引起MCF7/AdrR細(xì)胞EGFR表達(dá)增強(qiáng)，而非MDR相關(guān)藥物（博萊霉素）或用MDR藥物作用于不耐藥腫瘤細(xì)胞（MCF7）均無此作用。我們的實驗以及文獻(xiàn)報道均揭示EGFR能刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生CD147，從而誘導(dǎo)P-gp表達(dá)[12-13]。EGFR還參與了P-gp的磷酸化，從而使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積總量持續(xù)下降，引發(fā)耐藥[14]。用P-gp中和抗體Hyb-241預(yù)處理MCF7/ Adr細(xì)胞后，可以出現(xiàn)與EGFR抑制劑AG1478相同的作用，即MDR藥物的上述作用被完全阻斷[15]，說明MDR藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制中有P-gp功能活化的參與。

本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前乳腺癌組織P-gp表達(dá)與MDR藥物治療后腫瘤組織EGFR、C-erbB-2和CD147無明顯相關(guān)性，提示乳腺癌的原發(fā)性耐藥與腫瘤侵襲力增強(qiáng)之間可能并無關(guān)聯(lián)。這與我們以前發(fā)現(xiàn)不耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF7經(jīng)MDR1基因轉(zhuǎn)染后可以獲得耐藥性，但并不呈現(xiàn)上述MCF7/AdrR的類似表現(xiàn)相一致。這可能預(yù)示在化療藥物誘導(dǎo)MDR過程中還有目前尚不知的腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能變化，而這些變化是MDR藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移所必需。

綜上所述，本研究顯示原發(fā)性MDR（術(shù)前腫瘤細(xì)胞表達(dá)P-gp）可能與腫瘤細(xì)胞侵襲能力之間并無內(nèi)在聯(lián)系，以往體外實驗中MDR藥物促進(jìn)MDR細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步探討。臨床上腫瘤術(shù)前短期化療是安全的。

參考文獻(xiàn)

[1] Lacueva FJ， Teruel A， Calpena R， et al. Detection of P-glycoprotein in frozen and paraffin-embedded gastric adenocarcinoma tissues using a panel of monoclonal antibodies[J]. Histopathology， 1998， 32（4）： 328-334.

[2] Meijer GA， Schroeijers AB， Flens MJ， et al. Increased expression of multidrug resistance related proteins Pgp， MRP1， and LRP/MVP occurs early in colorectal carcinogenesis[J]. J Clin Pathol， 1999， 52（6）： 450-454.

[3] Hutter G， Sinha P. Proteomics for studying cancer cells and the development of chemoresistance[J]. Proteomics， 2001， 1（10）： 1233-1248.

[4] Yang JM， Xu Z， Wu H， et al. Overexpression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells[J]. Mol Cancer Res， 2003， 1（6）： 420-427.

[5] Hoffmann J， Schmidt-Peter P， Hansch W， et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markersin early passage human sarcomas[J]. Clin Cancer Res， 1999， 5（8）： 2198-2204.

[6] Arts HJ， Katsaros D， Vries EGD， et al. Drug resistanceassociated markers P-glycoprotein， multidrug resistance- associated protein 1， multidrug resistance-associated protein 2， and lung resistance[J]. Clin Cancer Res， 1999， 5（10）： 2798-2805.

[7] Robey-Cafferty SS， Bruner JM， Caffery LL. P-glycoprotein expression in gastroesophageal adenocarcinomas， their metastases， and surrounding mucosa： a mapping study[J]. Mod Pathol， 1991， 4（6）： 694-697.

[8] Yang JM， Yang GY， Medina DJ， et al. Treatment of multidrug resistant （MDR1） murine leukemia with P-glycoprotein substrates accelerates the course of the disease[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1999， 266（1）： 167-173.

[9] Leeuwen FW， Buckle T， Kersbergen A， et al. Noninvasive functional imaging of P-glycoprotein-mediated doxorubicin resistance in a mouse model of hereditary breast cancer to predict response， and assign P-gp inhibitor sensitivity[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging， 2009， 36（3）： 406-412.

[10] Ambudkar SV， Kimchi-Sarfaty C， Sauna ZE， et al. P-glycoprotein： from genomics to mechanism[J]. Oncogene， 2003， 22（47）： 7468-7485.

[11] Guo H， Li R， Zucker S， et al. EMMPRIN （CD147）， an inducer of matrix metalloproteinase synthesis， alsobinds interstitial collagenase to the tumor cell surface[J]. Cancer Res， 2000， 60（4）： 888-891.

[12] Menashi S， Serova M， Ma L， et al. Regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer and matrix metalloproteinase expression by amphiregulin in transformed human breast epithelial cells[J]. Cancer Res， 2003， 63（22）： 7575-7580.

[13] Shi Y， Ouyang P， Sugrue SP. Characterization of the gene encoding pinin/DRS/memA and evidence for itspotential tumor suppressor function[J]. Oncogene， 2000， 19（2）： 289-297.

[14] Yang JM， Sullivan GF， Hait WN. Regulation of the function of P-glycoprotein by epidermal growth factor through phospholipase C[J]. Biochem Pharmacol， 1997， 53（11）： 1597-1604.

[15] Li QQ， Wang WJ， Xu JD， et al. Up-regulation of CD147 and matrix metalloproteinase-2， -9 induced by P-glycoprotein substrates in multidrug resistant breast cancer cells[J]. Cancer Sci， 2007， 98（11）： 1767-1774.