宋雄波，吳江怡，黃　術，陳　誠，楊　柳，劉寶榮△

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)外科，長沙 410005；2.南華大學第一附屬醫(yī)院骨科，湖南衡陽 421001；3.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院關節(jié)外科，重慶 400038)

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二維及微團培養(yǎng)法對軟骨細胞表型的影響*

宋雄波1，吳江怡2，黃術1，陳誠3，楊柳3，劉寶榮1△

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學第一附屬醫(yī)院關節(jié)外科，長沙 410005；2.南華大學第一附屬醫(yī)院骨科，湖南衡陽 421001；3.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院關節(jié)外科，重慶 400038)

[摘要]目的探討二維及微團培養(yǎng)對軟骨細胞表型的影響。方法體外高密度二維及微團培養(yǎng)方法培養(yǎng)兔軟骨細胞，從細胞形態(tài)、細胞外基質表達情況分析軟骨細胞表型的差異。 結果高密度二維方案培養(yǎng)兔軟骨細胞，2周后軟骨細胞多層分布，HE染色顯示細胞呈圓形，細胞間聯(lián)系較密，阿爾新藍染色顯示細胞外蛋白多糖分泌較少；微團培養(yǎng)方法培養(yǎng)兔軟骨細胞，2周后形成肉眼可見的白色組織，HE染色顯示細胞呈多邊形，細胞較分散，阿爾新藍染色顯示細胞外蛋白多糖分泌明顯多于二維培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論微團培養(yǎng)方法培養(yǎng)兔軟骨細胞，有利于軟骨細胞分泌細胞外基質。

[關鍵詞]軟骨細胞；二維培養(yǎng)；微團培養(yǎng)；軟骨表型

關節(jié)軟骨由軟骨細胞及細胞外基質構成，缺乏血管和神經(jīng)，一旦受損，很難通過自我進行有效的修復[1]。傳統(tǒng)的治療方法，如微骨折法，修復物為纖維軟骨而不是透明軟骨，耐磨性差，容易導致關節(jié)退行性變，且只適用于急性關節(jié)軟骨損傷，療效受患者的年齡、軟骨缺損面積的限制[2-5]。目前臨床上通常采用自體軟骨細胞移植來修復關節(jié)軟骨缺損，療效肯定。進行自體軟骨細胞移植，需要足夠數(shù)量的軟骨細胞。因此，通常在關節(jié)非負重區(qū)獲取正常軟骨細胞，將軟骨細胞在體外培養(yǎng)擴增，待軟骨細胞數(shù)目達到修復要求時，再將軟骨細胞移植至關節(jié)缺損處。體外培養(yǎng)擴增軟骨細胞，一般采用單層培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，往往會發(fā)生軟骨細胞去分化表現(xiàn)，導致移植失敗。因此，本實驗提出應用二維及微團培養(yǎng)法培養(yǎng)軟骨細胞，比較兩種方法培養(yǎng)軟骨細胞的有效性，嘗試建立合適的軟骨細胞培養(yǎng)體系。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器新西蘭大白兔(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Hyclone)，Ⅱ型膠原酶、Pronase酶、地塞米松、抗壞血酸(Sigma)，ITS(Gibco)，重組人TGF-β1(Peprotech)，青霉素-鏈霉素溶液(Beyotime)，HE染色液、阿利新藍 8GX(Solarbio)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)、臺式冷凍離心機ST-40R(Thermo scientific)、倒置顯微鏡 IX71。

1.2方法

1.2.1軟骨細胞的提取及培養(yǎng)新西蘭大白兔，2～3月齡，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限。無菌條件獲取膝關節(jié)軟骨片(約1.5 mm×1.5 mm)，Pronase酶(0.25%)消化1 h，Ⅱ型膠原酶(0.025%)消化8～10 h，40 μm細胞濾網(wǎng)過濾消化液，2 000 r/min離心8 min，10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細胞，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，3 d后首次換液，以后每隔2天換液，待細胞融合90%以上時傳代，以第1代軟骨細胞為種子細胞。

1.2.2軟骨細胞二維培養(yǎng)計數(shù)細胞，使24孔板每孔細胞數(shù)目為2×105個。加入軟骨細胞誘導培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基，含有2%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液、1% ITS、50 μg/mL抗壞血酸、100 nmol/L地塞米松及10 ng/mL TGF-β)重懸細胞，將細胞懸液從孔中間加入，并將24孔板在超凈臺上做十字形移動，使細胞分布均勻后于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后每隔2天換液，培養(yǎng)2周。

1.2.3軟骨細胞微團培養(yǎng)計數(shù)細胞，使細胞數(shù)目為1×107個，用1 mL軟骨細胞誘導培養(yǎng)基重懸細胞。取15 mL一次性離心管，吸取20 μL上述細胞懸液加入離心管底，再加入1 mL軟骨細胞誘導培養(yǎng)基，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，擰松管蓋后靜置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后每隔2天換液，培養(yǎng)2周。

1.2.4指標檢測

1.2.4.1大體觀觀察二維培養(yǎng)組及微團培養(yǎng)組軟骨細胞形成物大小、形態(tài)。

1.2.4.2二維培養(yǎng)組軟骨細胞HE及阿爾新藍染色HE染色：4%多聚甲醛固定30 min，超純水洗，蘇木素染色20 min，自來水洗，分化液分化30 s，自來水浸泡，伊紅染色2 min，自來水洗，甘油封片，鏡下觀察。阿爾新藍染色：4%多聚甲醛固定30 min，超純水洗，3%冰醋酸平衡30 min，0.2%阿爾新藍染液染色30 min，3%冰醋酸洗，甘油封片，鏡下觀察。

1.2.4.3微團培養(yǎng)組軟骨細胞HE及阿爾新藍染色HE染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，超純水洗，蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水浸泡，伊紅染色，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察；阿爾新藍染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，超純水洗，冰醋酸平衡，阿爾新藍染色，冰醋酸浸泡，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察。

2結果

2.1軟骨細胞形態(tài)原代軟骨細胞在4 h后就有少量細胞貼壁生長，3 d后90%以上的軟骨細胞貼壁生長，呈長梭狀。首次換液后，細胞呈多邊形，增殖迅速，1周后可達90%融合。傳代細胞12 h基本貼壁鋪展，呈比較均一的鋪路石樣，見圖1。

2.2不同培養(yǎng)方式后軟骨細胞形態(tài)軟骨細胞高密度二維培養(yǎng)2周后，軟骨細胞多層分布，表現(xiàn)為較均一的圓形；軟骨細胞微團培養(yǎng)2周后，可見軟骨細胞形成較明顯的細胞微團組織，直徑約3 mm，厚0.5 mm，色白、質軟，有彈性，見圖2。

A：原代軟骨細胞4 d；B：第1代軟骨細胞6 d;標尺：100 μm。

圖1軟骨細胞形態(tài)

A：二維培養(yǎng)2周；B：微團培養(yǎng)2周；標尺：100 μm。

圖2不同培養(yǎng)方式后軟骨細胞形態(tài)

2.3軟骨細胞HE染色二維培養(yǎng)組顯示軟骨細胞密集，呈多層分布，排列緊密，表現(xiàn)較為均一的圓形；微團培養(yǎng)組顯示軟骨細胞分布較為分散，核大，表現(xiàn)較為均一的橢圓形，接近正常軟骨細胞形態(tài)，見圖3。

2.4軟骨細胞阿爾新藍染色二維培養(yǎng)組顯示軟骨細胞外基質染色淡，蛋白多糖分泌少；微團培養(yǎng)組顯示軟骨細胞外基質染色深，蛋白多糖分泌多。統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析顯示微團培養(yǎng)組蛋白多糖表達明顯多于二維培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

A、C：二維培養(yǎng)組；B、D：微團培養(yǎng)組；標尺：100 μm。

圖3軟骨細胞HE染色

A、C：二維培養(yǎng)組；B、D：微團培養(yǎng)組；標尺：100 μm。

圖4軟骨細胞阿爾新藍染色

*：P<0.05。

圖5蛋白多糖相對表達量比較

3討論

關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞及細胞外基質組成，軟骨細胞分布于由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖組成的致密細胞外基質中，形成軟骨陷窩，遷移性差，且關節(jié)軟骨不受神經(jīng)支配，缺乏血管及淋巴引流，營養(yǎng)靠周圍滑液彌散和滑液毛細血管滲透而獲得，細胞合成能力低下，一旦受損，導致其很難通過自身進行有效的修復[1]。

傳統(tǒng)的手術治療方法，如微骨折法，修復物為纖維軟骨而不是透明軟骨，耐磨性差，容易導致關節(jié)退行性變；且只適用于急性關節(jié)軟骨損傷，療效受患者的年齡、軟骨缺損面積等的限制[2-5]。目前自體軟骨細胞移植已經(jīng)在臨床推廣應用。進行自體軟骨細胞移植，需要足夠數(shù)量的軟骨細胞，因此，通常在關節(jié)非負重區(qū)獲取正常軟骨細胞，將軟骨細胞在體外培養(yǎng)擴增，待軟骨細胞數(shù)目達到修復要求時，再將軟骨細胞移植至關節(jié)缺損處。研究發(fā)現(xiàn)，采用單層二維方法培養(yǎng)軟骨細胞，在第2代軟骨細胞時，Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達有了明顯的下降，軟骨細胞表現(xiàn)出去分化現(xiàn)象[6-7]。

為了克服軟骨細胞培養(yǎng)過程中去分化表現(xiàn)，研究者采取了多種方法維持軟骨細胞表型，如應用不同的培養(yǎng)基及生長因子、蛋白包被、共培養(yǎng)及三維支架培養(yǎng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，增加TGF-β1及葡萄糖的濃度，同時降低地塞米松的濃度，可以促進軟骨細胞表達Ⅱ型膠原及維持軟骨細胞特性；同時還發(fā)現(xiàn)TGF-β1聯(lián)合無血清培養(yǎng)基較含血清培養(yǎng)基更能促進軟骨細胞表達Ⅱ型膠原[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，應用Ⅰ、Ⅲ型膠原包被培養(yǎng)瓶，可以促使軟骨細胞表達更多的Ⅱ型膠原及蛋白多糖，但是對比應用Ⅰ、Ⅱ型膠原包被，卻未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達有明顯差異[11-12]。Meretoja等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將軟骨細胞和間充質干細胞共同培養(yǎng)，比單獨的軟骨細胞、間充質干細胞培養(yǎng)更能適應組織工程的發(fā)展需求。研究還發(fā)現(xiàn)，將軟骨細胞和間充質干細胞、胚胎干細胞及誘導多功能干細胞分別進行共培養(yǎng)，能促進Ⅱ型膠原及SOX9的表達，同時有利于軟骨基質的形成[1,14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，應用微團方法培養(yǎng)軟骨細胞，軟骨細胞可形成白色透明的類軟骨組織，質軟，彈性可。HE染色顯示軟骨細胞表現(xiàn)為均一的橢圓形，接近正常軟骨細胞形態(tài)，且形成類似軟骨陷窩樣表現(xiàn)。阿爾新藍染色顯示軟骨細胞外多糖物質染色深，分泌多，含量明顯高于二維培養(yǎng)。作者分析，采用微團方法培養(yǎng)軟骨細胞，模擬了體內干細胞向軟骨細胞分化及軟骨形成過程，更加符合軟骨細胞生長特性，從而有利于維持軟骨細胞特性。因此，微團培養(yǎng)法是比較合適的軟骨細胞培養(yǎng)體系。采用微團方法培養(yǎng)軟骨細胞，需注意以下事項：(1)最好使用原代軟骨細胞，且要保證軟骨細胞數(shù)目；(2)軟骨細胞離心后不能晃蕩離心管，否則會使細胞分散，達不到培養(yǎng)目的；(3)細胞換液時需傾斜離心管，小心吸除培養(yǎng)基，并沿管壁輕輕注入新鮮培養(yǎng)基，避免軟骨細胞微團組織漂浮。

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Effects of 2D culture and micropellet culture on the chondrocyte phenotype*

Song Xiongbo1,Wu Jiangyi2,Huang Shu1,Chen Cheng3,Yang Liu3,Liu Baorong1△

(1.Department of Joint Surgery,Hunan Provincial People′s Hospital/First Affiliated Hospital ofHunan Normal University,Changsha,Hunan 410005,China;2.Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of South China University,Hengyang,Hunan 421001,China;3.Department of Joint Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze the effects of 2D culture and micropellet culture on the chondrocyte phenotype.MethodsHigh density 2D culture and micropellet culture were used to culture rabbit chondrocytes,the cell morphology and level of matrix expression were measured.ResultsAfter 2 weeks of 2D high density culture,multilayer chondrocyte distribution was observed.HE staining showed that the cells were round in shape,and were closely connected with each other,alcian blue staining showed that the secretion of proteoglycan was low;after 2 weeks of micropellet culture,cartilage-like white tissue was formed.HE staining showed that the cells were polygonal in shape,and were sparsely distributed,alcian blue staining showed that the secretion of proteoglycan was significantly higher than that in 2D culture(P<0.05).ConclusionUsing micropellet to culture rabbit chondrocytes is favorable for the secretion of extracellular matrix.

[Key words]chondrocytes;2D culture;micropellet culture;cartilage phenotype

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.005

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(31300773)；中國博士后科學基金資助項目(2013M532152)。

作者簡介：宋雄波(1986-)，醫(yī)師，碩士，主要從事軟骨細胞表型調控、軟骨細胞-干細胞相互作用的研究。△通訊作者， E-mail:lbr9391@163.com。

[中圖分類號]R68

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1456-03

(收稿日期：2015-12-08修回日期：2016-02-01)