黃 毅，袁小紅，賀新生,宋 航

(1.四川大學(xué)制藥與生物工程系,四川成都 610065;2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

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不同培養(yǎng)方式產(chǎn)縱條紋炭角菌的指紋圖譜分析

黃 毅1,2，袁小紅2，賀新生2,宋 航1*

(1.四川大學(xué)制藥與生物工程系,四川成都 610065;2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

摘要[目的]采用高效液相色譜法建立縱條紋炭角菌指紋圖譜分析方法，比較該菌5種培養(yǎng)物的化學(xué)成分差異。[方法]色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.8 mL/min，溫度25 ℃。測(cè)定指紋圖譜后，應(yīng)用相似度分析和系統(tǒng)聚類分析對(duì)不同培養(yǎng)物的化學(xué)成分進(jìn)行比較。 [結(jié)果]建立了縱條紋炭角菌HPLC指紋圖譜分析方法，在色譜指紋圖譜中，確定了35個(gè)共有峰，根據(jù)相似度分析、系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果確定棉籽殼和麩皮共培養(yǎng)的縱條紋炭角菌與野生條紋炭角菌化學(xué)成分最為相似。[結(jié)論]該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，可用于縱條紋炭角菌培養(yǎng)物的質(zhì)量控制和培養(yǎng)方法篩選。

關(guān)鍵詞縱條紋炭角菌；指紋圖譜；HPLC；相似度分析；聚類分析

高等藥食真菌中富含豐富的天然活性化合物，其結(jié)構(gòu)新穎，藥理活性強(qiáng)，是醫(yī)藥業(yè)開(kāi)發(fā)的重要資源。但野生菌難于獲取，需要人工培養(yǎng)物進(jìn)行替代。兩者由于生長(zhǎng)環(huán)境不同，其內(nèi)部化學(xué)物種類及含量會(huì)有較大差異，采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)比分析既可將差異定量化，又便于未來(lái)人工培養(yǎng)物用于醫(yī)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立?？v條紋炭角菌(XylariastriataPat.)，屬子囊菌門(mén)、盤(pán)菌亞門(mén)、糞殼菌綱、炭角菌亞綱、炭角菌目、炭角菌科、炭角菌屬藥食真菌，原始標(biāo)本采自我國(guó)南京棕櫚樹(shù)Trachycarpus老樹(shù)干上[1]。現(xiàn)有文獻(xiàn)已逐步報(bào)道了同屬多種炭角菌具有各種活性小分子[2-7]。同屬目前開(kāi)發(fā)最好的是黑柄炭角菌，又名“烏靈參”，是四川、云南等地著名的補(bǔ)氣中藥，具有改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血、抗前列腺增生以及提高機(jī)體免疫等功能[8]，已有醫(yī)藥產(chǎn)品上市銷售。筆者所在課題組于2012年在四川省綿陽(yáng)市發(fā)現(xiàn)了該種并對(duì)該菌展開(kāi)系統(tǒng)性研究，先期完成了培養(yǎng)優(yōu)化工作[9-11]，并在生物活性初篩時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌提取物具有抗菌[12]和抗腫瘤[13]活性。為了后續(xù)活性化合物的發(fā)現(xiàn)，筆者建立了縱條紋炭角菌HPLC指紋圖譜分析方法，并對(duì)多種培養(yǎng)方式產(chǎn)培養(yǎng)物與野生菌化學(xué)成分進(jìn)行比較，以便于后期的開(kāi)發(fā)利用。

1材料與方法

1.1儀器1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，Acculab Alc電子天平(德國(guó)賽多利斯科技儀器有限公司)，R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥麥角甾醇對(duì)照品(純度97.0%)，云南西力生物技術(shù)股份有限公司；高效液相色譜用乙腈為色譜純，美國(guó)Fisher公司；超純水(18.2 ΩPa)為西南科技大學(xué)制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3樣品人工培養(yǎng)縱條紋炭角菌樣品5份，野生縱條紋炭角菌樣品1份(經(jīng)賀新生教授鑒定為XylariastriataPat.1887)，樣品編號(hào)、名稱、部位和培養(yǎng)方式見(jiàn)表1。所有子實(shí)體樣品除雜風(fēng)干并經(jīng)50 ℃烘干，菌絲體經(jīng)紗布過(guò)濾純水洗滌后經(jīng)50 ℃烘干。所有樣品經(jīng)小型中藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)30目篩避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　縱條紋炭角菌樣品來(lái)源

1.4方法

1.4.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取麥角甾醇對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容即得對(duì)照品溶液(0.5 mg/mL)，置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2供試品溶液的制備。精密稱取各樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲(功率300 W，頻率40 kHz)處理20 min，冷卻至室溫，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液即得供試品溶液(0.025 g/mL)，置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3色譜條件。Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A):水(B)梯度洗脫(0～50 min，5%～100%A；50～60 min，100%A)，再次進(jìn)樣前平衡時(shí)間30 min，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL，溫度25 ℃。

圖1　生長(zhǎng)在槐樹(shù)樹(shù)干基部的野生子實(shí)體Fig.1　Wild fruiting body growing in the trunk base of Styphnolobium japonicum

注：底部為棉籽殼和麩皮的固體培養(yǎng)基。Note:Bottom was the solid medium of cottonseed hulls and brans.圖2　棉籽殼和麩皮固體共培養(yǎng)產(chǎn)子實(shí)體Fig.2　Fruiting body cultured in cottonseed hulls and brans

2結(jié)果與分析

2.1指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1精密度。取野生縱條紋炭角菌子實(shí)體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，連續(xù)進(jìn)樣6針，考察各針中各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2004A版)對(duì)所得的色譜圖進(jìn)行評(píng)價(jià)，所有色譜圖的相似度值不低于0.900，從自動(dòng)匹配后的共有峰中選擇面積較大的21個(gè)峰，以19號(hào)峰為參照峰S，考察共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各共有峰與參照峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.5%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.91%，表明儀器精密度較好，符合指紋圖譜要求。

2.1.2重復(fù)性。取野生縱條紋炭角菌子實(shí)體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，分別取6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2004A版)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.5%～0.7%，相對(duì)峰面積的RSD為1.5%～2.9% ，表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.1.3穩(wěn)定性。取野生縱條紋炭角菌子實(shí)體樣品(S3)適量，按“1.4.2”方法制備樣品，分別在 0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，檢測(cè)指紋圖譜。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》( 2004A版) 評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.3%～0.4%，相對(duì)峰面積的RSD為1.2%～2.1%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2不同培養(yǎng)方式下樣品指紋圖譜的建立及分析分別將6種樣品按“1.4.2”方法制備后，在“1.4.3”色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖(圖3)。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》( 2004A 版) 對(duì)樣品的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定35個(gè)色譜峰為其特征峰。經(jīng)對(duì)照品確定，32號(hào)峰為麥角甾醇，其保留時(shí)間適中，峰面積較大且穩(wěn)定，峰形較好，各樣品中均具有一定含量，故選擇其為內(nèi)參照峰，將其保留時(shí)間和色譜峰面積設(shè)為1，將其他特征峰的保留時(shí)間與峰面積和參照峰的保留時(shí)間與峰面積相比，得到各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積(表2)。按以上方法計(jì)算各樣品35個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果差異明顯。

圖3　6種樣品的HPLC指紋圖譜Fig.3　HPLC fingerprint of six samples

2.3指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2004A版)對(duì)6種樣品分別進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，設(shè)定S3為參照?qǐng)D譜，中位數(shù)法，時(shí)間窗口寬度0.1，將其樣品的色譜圖與參照?qǐng)D進(jìn)行自動(dòng)匹配，建立共有模式，計(jì)算其他條件培養(yǎng)的條紋炭角菌與野生條紋炭角菌的相似度(表3)。由表3可知，S3和S4最相似，即棉籽殼和麩皮共培養(yǎng)的條紋炭角菌子實(shí)體與野生條紋炭角菌子實(shí)體最相似，其次依次是S1、S2、S5、S6。

表2　樣品共有峰的相對(duì)峰面積

表3　6種樣品的相似度

2.4樣品的聚類分析將6種樣品HPLC圖譜中35個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間運(yùn)用SPSS19.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，采用最近鄰元素法，利用平方歐式距離作為樣品的測(cè)度。由圖4可知，S3和S1、S2、S4聚為第I類，該結(jié)果與指紋圖譜相似度分析結(jié)果相似。

圖4　系統(tǒng)聚類分析Fig.4　Results of hierarchical cluster analysis

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)利用DAD檢測(cè)器同時(shí)考察了多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)(210、220、240、254、280、300、320和360 nm)的指紋圖譜，結(jié)果表明在210 nm下的色譜信號(hào)多，峰形好。同時(shí)考察了60 min以上梯度洗脫效果，結(jié)果表明60 min即可將重疊的圖譜峰分離開(kāi)，耗時(shí)較少，提高了檢測(cè)效率。

該試驗(yàn)建立了條紋炭角菌的HPLC指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)便易行，所檢測(cè)到的化學(xué)成分均得到較好的分離。指紋圖譜相似度和聚類分析均說(shuō)明不同培養(yǎng)條件下條紋炭角菌的成分與野生條紋炭角菌的成分差異較大，其中棉籽殼和麩皮共培養(yǎng)的條紋炭角菌與野生條紋炭角菌成分最為相似，可用于后續(xù)該菌化學(xué)成分研究的材料，為今后有效成分提取純化的材料選擇提供依據(jù)。

野生食藥用真菌自然生長(zhǎng)條件下產(chǎn)量很低，無(wú)法滿足食品藥品的后續(xù)開(kāi)發(fā)使用。人工培養(yǎng)是解決產(chǎn)量的最佳方法，但不同培養(yǎng)方式因其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式的不同，培養(yǎng)物的化學(xué)成分和野生種類差異可能很大。該試驗(yàn)通過(guò)指紋圖譜優(yōu)選的方式，可以更好地優(yōu)選接近野生品種的培養(yǎng)方式，為一種野生食藥用真菌開(kāi)發(fā)的優(yōu)良方法。

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Analysis of HPLC Fingerprint ofXylariastriataby Different Culture Methods

HUANG Yi1,2,YUAN Xiao-hong2,HE Xin-sheng2,SONG Hang1*

(1.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065; 2.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang,Sichuan 621010)

Abstract[Objective] To establish Xylaria striata fingerprint analysis method by High Performance Liquid Chromatography (HPLC),and to compare the differences in chemical components of five cultures.[Method] Chromatographic column was Agilent Eclipse XDB C18(150.0 mm × 4.6 mm,5.0 μm); mobile phase was acetonitrile-water; detection wavelength was 210 nm; flow rate was 0.8 mL/min; and column temperature was 25 °C.After detecting the fingerprint,the chemical composition was compared by similarity analysis and cluster analysis.[Result] The HPLC fingerprint analysis method of X.striata was established.In chromatographic fingerprint,35 common peaks were identified.According to the results of similarity analysis and cluster analysis,the chemical compositions of X.striata cultured in cottonseed hulls and bran were most similar as the wild.[Conclusion] The method is simple,stable and repeatable,which can be used for quality control and method screening of X.striata cultures.

Key wordsXylaria striata; Fingerprint; HPLC; Similarity analysis; Cluster analysis

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21272189)。

作者簡(jiǎn)介黃毅(1979- )，男，四川成都人，講師，博士，從事真菌天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物資源綜合開(kāi)發(fā)研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號(hào)S 603.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)08-134-04