葉三仙, 羅云敬*, 喬樹亮, 李 莉, 劉彩虹, 史建龍，安學(xué)靜

1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124 2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123 3. 包頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古 包頭 014010

停流熒光法研究牛血清白蛋白和葉酸反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

葉三仙1, 羅云敬1*, 喬樹亮3, 李 莉2, 劉彩虹2, 史建龍1，安學(xué)靜1

1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124 2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123 3. 包頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古 包頭 014010

葉酸屬于B族維生素，作為生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移一碳單位酶系中的輔酶，與其他維生素相互作用，共同維持體內(nèi)紅細(xì)胞的穩(wěn)定，對(duì)氨基酸之間的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)合成的反應(yīng)都有重要意義。藥物半衰期、峰濃度和反應(yīng)速度常數(shù)是研究藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)，實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光分光光度計(jì)和停流光譜分析儀研究了仿生環(huán)境下牛血清白蛋白和葉酸反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為葉酸相關(guān)的藥物代謝參數(shù)提供參考。結(jié)果表明：利用Stern-Volmer方程處理熒光猝滅實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到25, 30和37 ℃下葉酸對(duì)牛血清白蛋白內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅常數(shù)分別為2.455×1010，4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1；動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)都大于100 mol·L-1·s-1，闡明了BSA與葉酸之間的猝滅機(jī)理是通過形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程；生理溫度下，牛血清白蛋白濃度與其初始濃度滿足二級(jí)反應(yīng)公式，相關(guān)系數(shù)為0.998 7，藥代半衰期t1/2為0.059 s；反應(yīng)的表觀速率常數(shù)隨著葉酸濃度的增加呈線性增加趨勢(shì)，且葉酸催化牛血清白蛋白熒光猝滅的速率常數(shù)kcat=3.174×105mol·L-1·s-1。此外還測(cè)定了不同緩沖介質(zhì)下牛血清白蛋白與葉酸相互作用的表觀速率常數(shù)和反應(yīng)速率常數(shù)，以此來探討生理介質(zhì)對(duì)于二者反應(yīng)的影響，為確定臨床用藥方案、預(yù)測(cè)藥物的療效和毒性以及合理用藥有著重要意義。

牛血清白蛋白；葉酸；熒光光譜；動(dòng)力學(xué)參數(shù)

引 言

葉酸是一種水溶性維生素，它能傳遞一碳基團(tuán)(甲基或甲酰)給脫氧尿苷酸，使之變?yōu)槊撗跣剀账?，進(jìn)而合成DNA。葉酸的缺少會(huì)增加未成熟細(xì)胞量，使白血球減少，從而導(dǎo)致紅血球的異常，引起貧血、心臟病、老年性癡呆及胎兒神經(jīng)軟管缺陷等疾病[1-3]。葉酸進(jìn)入機(jī)體后，和各種生物分子結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮作用，如氨基酸、蛋白質(zhì)、受體和核酸等[4]。自1995年Green等證實(shí)了葉酸與同型半胱氨酸代謝有著密切的聯(lián)系，以葉酸受體為治療藥物和分子探針方面的研究日益深入，已有部分葉酸的新藥前體進(jìn)入臨床研究階段，但對(duì)其作用時(shí)間和良好的生物利用度卻不甚明了[5-6]。

血清白蛋白是血漿中含量最豐富和結(jié)合能力最廣泛的載體蛋白。研究藥物與血清白蛋白相互作用，對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的存在狀態(tài)、吸收與代謝及藥理作用具有重要意義[7-8]。胡濤英等[9]將經(jīng)典光譜法與內(nèi)濾光校正和分子對(duì)接等技術(shù)相結(jié)合，探究了多西環(huán)素與人血清白蛋白的相互作用，為研究相關(guān)藥物小分子的藥理機(jī)制提供了理論依據(jù)。基于葉酸分子對(duì)血清白蛋白熒光的猝滅效應(yīng)，白海鑫等[10-11]研究了葉酸和血清白蛋白相互作用時(shí)的結(jié)合方式、作用力類型和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。付彩霞等[12]研究了葉酸與牛血清白蛋白在含鐵(Ⅲ)環(huán)境中的相互作用。Niki等[13]利用熱力學(xué)原理研究牛血清白蛋白與葉酸相互作用的機(jī)制。尚未見有對(duì)血清白蛋白與葉酸反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的報(bào)道。在仿生環(huán)境下，運(yùn)用熒光分光光度計(jì)研究了葉酸和牛血清白蛋白相互作用時(shí)的三維熒光猝滅變化，同時(shí)運(yùn)用停流光譜分析儀考察了不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度隨葉酸濃度的動(dòng)力學(xué)變化，計(jì)算出反應(yīng)的表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)及速率常數(shù)，對(duì)葉酸新藥的設(shè)計(jì)、篩選提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)，SFM-300/MOS-250停流動(dòng)力學(xué)裝置與光譜分析系統(tǒng)(法國(guó)比奧羅杰公司)，Bio-Kine32V4.27動(dòng)力學(xué)曲線模擬軟件(法國(guó)比奧羅杰公司)，PHS-25數(shù)顯酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)，ER-182A電子天平(上海天平儀器廠)，TB-85水浴循環(huán)裝置(日本島津公司)，PR020XXM1純水機(jī)(北京PALL純水公司)。

牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，葉酸(FA)購(gòu)自Aladdin公司，低溫避光保存。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，實(shí)驗(yàn)測(cè)定所用緩沖液為磷酸緩沖液(PBS)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 熒光分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)

2 μmol·L-1的BSA和2 μmol·L-1的葉酸和一定量的緩沖液按不同比例混合置于水浴中充分反應(yīng)，反應(yīng)液中BSA的終濃度是0.4 μmol·L-1。取3 mL反應(yīng)液加入到石英比色皿中測(cè)定熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍為220～450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為290～550 nm。

1.2.2 停流光譜分析儀實(shí)驗(yàn)

50 μmol·L-1的BSA、緩沖液和50 μmol·L-1的葉酸分別注射到停流光譜分析儀的S1、S2和S3三個(gè)注射器中，實(shí)驗(yàn)中通過改變?nèi)齻€(gè)注射器中反應(yīng)液的比例來控制葉酸的濃度和反應(yīng)總體積，反應(yīng)溶液中BSA的終濃度為12.50 μmol·L-1，葉酸濃度分別為0.00，6.25，12.50，18.75，25.00，31.25和37.50 μmol·L-1，激發(fā)波長(zhǎng)為287 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為343 nm。實(shí)驗(yàn)過程中用停流光譜分析儀自帶的恒溫水浴裝備來控制反應(yīng)過程中的溫度。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與葉酸相互作用三維熒光光譜分析

BSA中的Trp，Tyr和Phe殘基能夠發(fā)射內(nèi)源熒光。生理溫度下，三維熒光掃描結(jié)果顯示280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，BSA在發(fā)射波長(zhǎng)343 nm處有熒光峰，峰高為1 471[見圖1(a)]。隨著葉酸濃度的逐漸增加，BSA在343 nm處的發(fā)射波長(zhǎng)保持不變，但此峰的熒光強(qiáng)度不斷降低，當(dāng)葉酸濃度達(dá)到1.2 μmol·L-1時(shí)，BSA的峰高降低到853，熒光強(qiáng)度減弱了42.01%[見圖1(g)]，說明葉酸對(duì)BSA內(nèi)源熒光有猝滅作用。

Fig.1 Fluorescence spectra of BSA with different folic acid concentration at 37 ℃

cFA(a): 0.0, (b): 0.2, (c): 0.4, (d): 0.6, (e): 0.8, (f): 1.0, (g): 1.2 μmol·L-1

25，30和37 ℃下BSA的三維熒光強(qiáng)度隨葉酸濃度變化的考察結(jié)果顯示：隨著溫度的升高，BSA的峰高降低得更加明顯(圖2)，表明溫度升高促進(jìn)了葉酸對(duì)BSA的熒光猝滅。

Fig.2 Fluorescence intensity of BSA with different folic acid concentration at different temperature

假設(shè)葉酸對(duì)BSA的修飾作用是一個(gè)熒光動(dòng)態(tài)猝滅過程，則由圖2的F0/F結(jié)果根據(jù)Stern-Volmer方程式F0/F=1+Kqτ0[FA]做BSA熒光猝滅的曲線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)線性擬合得到的直線斜率代表熒光猝滅過程速率常數(shù)Kq。隨著葉酸濃度的增加，F(xiàn)0/F逐漸增大，且二者呈良好的線性關(guān)系。25，30和37 ℃下擬合得到直線斜率分別為：2.455×1010，4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.897 8，0.995 9和0.979 1。由數(shù)據(jù)可知，不同溫度下，葉酸和BSA結(jié)合反應(yīng)的Kq都遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散常數(shù)2.000×1010L·mol-1·s-1，且隨著溫度的升高，BSA熒光猝滅常數(shù)增大，表明葉酸對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅過程不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

2.2 BSA與葉酸相互作用停流熒光光譜分析

固定BSA的濃度，改變?nèi)~酸的濃度，運(yùn)用停流光譜分析儀掃描混合溶液的熒光光譜。生理溫度下，BSA熒光光譜隨葉酸濃度增大而變化的動(dòng)力學(xué)曲線(圖3)顯示無葉酸加入時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度為5.25 a.u.，且隨著時(shí)間的推移，BSA的熒光強(qiáng)度保持不變；隨著葉酸的加入，BSA的熒光強(qiáng)度呈先逐漸下降后平穩(wěn)趨勢(shì)，且葉酸濃度越大，下降趨勢(shì)越明顯。當(dāng)葉酸濃度為12.50 μmol·L-1時(shí)，BSA初始熒光強(qiáng)度為4.79 a.u.，反應(yīng)結(jié)束時(shí)的熒光強(qiáng)度平穩(wěn)在3.50左右，當(dāng)葉酸濃度為37.50 μmol·L-1時(shí)，BSA的初始熒光強(qiáng)度為3.96 a.u.，反應(yīng)結(jié)束時(shí)的熒光強(qiáng)度平穩(wěn)在2.98 a.u.左右。說明葉酸分子使BSA的熒光發(fā)生了猝滅，且猝滅效應(yīng)隨著葉酸濃度的增大而增強(qiáng)。

Fig.3 Kinetic traces of BSA with different folic acid concentration in 37 ℃

cFAa: 6.25,b: 12.50,c: 18.75,d: 25.00,e: 31.25,f: 37.50 μmol·L-1)

用停流光譜分析儀自帶的動(dòng)力學(xué)曲線模擬軟件Bio-Kine擬合出表觀速率常數(shù)，見表1。由表1可見葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù)隨著葉酸濃度的增加而呈線性增加趨勢(shì)。

由停流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)公式kobs=k0+kcat[catalyst]線性擬合得直線的斜率為kcat。不同溫度下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)擬合曲線見圖4：溫度為25 ℃時(shí), BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.143×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.989 1；溫度為30 ℃時(shí)，k=2.721×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.994 0；溫度為37 ℃時(shí)，k=3.174×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.992 5。結(jié)果表明，當(dāng)溫度升高，BSA與葉酸反應(yīng)的速率加快，且反應(yīng)速率在30和37 ℃比25 ℃分別加快26.97%和48.11%。由于BSA和葉酸的反應(yīng)速率常數(shù)恒大于100 mol·L-1·s-1，進(jìn)一步驗(yàn)證葉酸對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅過程是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

Table 1 kobs of BSA with different folic acid concentration at different temperature

Fig.4 kcat of BSA and folic acid at different temperature

BSA分子由一條單獨(dú)的氨基酸多肽鏈構(gòu)成，其三級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即SiteⅠ，SiteⅡ和SiteⅢ，其中SiteⅠ和SiteⅡ兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與許多小分子化合物具有較強(qiáng)結(jié)合能力，其結(jié)構(gòu)隨溶液pH的改變會(huì)發(fā)生改變[14]。在生理溫度下，測(cè)定了不同pH值的磷酸緩沖液下BSA與葉酸反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，并用Bio-Kine軟件擬合出表觀速率常數(shù)(表2)。由數(shù)據(jù)可見，pH值會(huì)影響葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù)；不同pH值下，葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù)都隨著葉酸濃度的增加呈線性增加，且中性環(huán)境下表觀速率常數(shù)較大。

Table 2 kobs of BSA with different folic acid concentration in different pH

將表2數(shù)據(jù)代入公式kobs=k0+kcat[catalyst]擬合出不同pH值下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)(圖5)：pH 6.5時(shí)，BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.201×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.990 8；pH 7.0時(shí)，k=2.786×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.996 1；pH 7.5時(shí)，k=2.953×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.992 3；pH 8.0時(shí)，BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.391×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.992 6。數(shù)據(jù)表明，生理溫度下，磷酸緩沖液為中性時(shí)，BSA與葉酸的反應(yīng)速率最快。BSA的熒光強(qiáng)度在微酸性和微堿性范圍內(nèi)發(fā)生改變會(huì)影響Trp的量子產(chǎn)率、質(zhì)子解離作用及氨基酸的疏水性和能量傳遞等。由于BSA中Trp和Phe殘基的非極性基團(tuán)的疏水性比Tyr殘基強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)體系偏酸性時(shí)Trp微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，BSA表面疏水性降低；偏堿性時(shí)部分Phe殘基微環(huán)境的極性增強(qiáng)，將更多疏水性氨基酸殘基暴露在水溶劑中。因此，在研究葉酸藥物時(shí)，需要考慮到人體的pH微環(huán)境，以便達(dá)到人體對(duì)藥物最大吸收值。

Fig.5 kcat of BSA and folic acid in different pH of PBS

人體血液和細(xì)胞液中含有多種鹽類共同維持體內(nèi)酸堿平衡，其中氯化鈉溶液和重碳酸鹽類是含量較多的兩種。實(shí)驗(yàn)中分別測(cè)定了BSA與葉酸在0.9%氯化鈉水溶液和25 mMNaHCO3水溶液反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，并用Bio-Kine軟件擬合出表觀速率常數(shù)(表3)。結(jié)果顯示水溶液中反應(yīng)的表觀速率常數(shù)相對(duì)NaCl和NaHCO3溶液較大。

Table 3 kobs of BSA with different folic acid concentration in different buffer solution

從各緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)(圖6)可以看出：含0.9% NaCl的水溶液，BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.748 8×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.995 2；含25 mmol·L-1NaHCO3的水溶液，k=2.677×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.992 8；水溶液，k=2.952×105mol·L-1·s-1，相關(guān)系數(shù)為0.989 5。生理溫度下，BSA與葉酸在水溶液下的反應(yīng)速率比生理介質(zhì)NaCl和CO2溶液中的速率大15.7%和9.3%，說明NaCl和NaHCO3兩種介質(zhì)影響葉酸和BSA結(jié)合速率。由SiteⅡ更利于結(jié)合芳香酸類小分子，可以判斷NaCl和NaHCO3兩種分子應(yīng)該是通過SiteⅠ位點(diǎn)與BSA的結(jié)合，由于葉酸也是結(jié)合在BSA的SiteⅠ位點(diǎn)，因此NaCl和NaHCO3兩種分子和葉酸產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)，降低了葉酸催化BSA的熒光猝滅速率。

Fig.6 kcat of BSA and folic acid in different buffer solution

3 結(jié) 論

運(yùn)用熒光光譜技術(shù)和停流動(dòng)力學(xué)研究了BSA與葉酸的相互作用。用Stern-Volmer方程處理熒光猝滅實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到25，30和37 ℃下葉酸對(duì)BSA的熒光猝滅常數(shù)(Kq值)分別為：2.455×1010，4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1；動(dòng)力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明：不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)都大于100 mol·L-1·s-1，闡明了BSA與葉酸之間的猝滅機(jī)理是通過形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。此外，用積分速率方程對(duì)BSA和葉酸反應(yīng)的停流動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行分析，證實(shí)了BSA和葉酸的反應(yīng)屬于二級(jí)反應(yīng)，并計(jì)算出仿生溫度下的藥代半衰期t1/2為0.059 s，且25，30和37 ℃下二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)分別為2.143×105，2.721×105和3.174×105mol·L-1·s-1。

在研究葉酸藥物時(shí)應(yīng)該考慮到溫度、pH值和生理介質(zhì)對(duì)BSA與葉酸反應(yīng)造成的影響。通過仿生藥物動(dòng)力學(xué)特征的研究，為確定臨床用藥方案、預(yù)測(cè)藥物的療效和毒性以及合理用藥有著重要意義。

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*Corresponding author

Study of Reaction Dynamics between Bovine Serum Albumin and Folic Acid by Stopped-Flow/Fluorescence

YE San-xian1, LUO Yun-jing1*, QIAO Shu-liang3, LI Li2, LIU Cai-hong2, SHI Jian-long1, AN Xue-jing1

1. College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China

2. Chinese Aeademy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

3. Baotou Entry-Exit Inspection and Quarantine, Baotou 014010, China

As a kind of coenzyme of one-carbon enzymes in vivo, folic acid belongs to B vitamins, which can interact with other vitamins and has great significance for converting among amino acids, dividing growth of cells and protein synthesis reactions. Half-life, concentration and reaction rate constant of drugs are important parameters in pharmacokinetic study. In this paper, by utilizing fluorescence spectrophotometer and stopped-flow spectrum analyzer, reaction kinetic parameters between bovine serum albumin(BSA) and folic acid in a bionic system have been investigated, which provide references for parameters of drug metabolism related to folic acid. By using Stern-Volmer equation dealing with fluorescence quenching experiments data, we concluded that under 25, 30, and 37 ℃, the static quenching constants of folic acid to intrinsic fluorescence from bovine serum albumin were 2.455×1010, 4.900×1010and 6.427×1010L·mol-1·s-1respectively; The results of kinetic reaction rate have shown that the reaction rate of BSA and folic acid are greater than 100 mol·L-1·s-1at different temperatures, pH and buffering media, illustrating that the quenching mechanism between BSA and folic acid is to form composite static quenching process. Reaction concentration of bovine serum albumin and its initial concentration were equal to the secondary reaction formula, and the correlation coefficient was 0.998 7, while the half-life (t1/2) was 0.059 s at physiological temperature. With the increase of folic acid concentration, the apparent rate constant of this reaction had a linear increasing trend, the BSA fluorescence quenching rate constant catalyzed by folic acid was 3.174×105mol·L-1·s-1. Furthermore, with different buffer, the apparent rate constant and reaction rate constant of BSA interacting with folic acid were detected to explore the influence on the reaction under physiological medium, which is of great significance to determine the clinical regimen, forecast the efficacy and toxicity of drugs and rational drug.

BSA (Bovine Serum Albumin); Folic acid; Fluorescence spectra; Kinetic parameter

Oct. 10, 2014; accepted Jan. 25, 2015)

2014-10-10，

2015-01-25

北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201210005032)和北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2102005)資助

葉三仙, 女，1988年生，北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院碩士研究生 e-mail: 450212535@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: luoyj@bjut.edu.cn

O657.3

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10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0134-06