吳雨杭， 韓忠保， 馬嘉澤， 何 妍， 劉麗艷， 辛士剛， 于 湛*

1. 沈陽師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034

2. 沈陽師范大學(xué)實驗中心， 遼寧 沈陽 110034

同步熒光光譜法結(jié)合分子對接研究金雀花堿與牛血清白蛋白間相互作用

吳雨杭1， 韓忠保1， 馬嘉澤1， 何 妍1， 劉麗艷1， 辛士剛2， 于 湛1*

1. 沈陽師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034

2. 沈陽師范大學(xué)實驗中心， 遼寧 沈陽 110034

金雀花堿(Cy)是一種生物堿， 主要存在于豆科毒豆屬植物種子中。 Cy具有較強的生物活性， 特別是作為戒煙藥物已得到廣泛應(yīng)用。 在模擬生理條件下， 應(yīng)用熒光光譜法研究了Cy同牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用以及Cy猝滅BSA熒光發(fā)射的機理。 詳細考查了水浴溫度、 水浴時間以及溶液pH等因素對熒光猝滅的影響， 并且通過Stem-Volmer方程計算了Cy與BSA間的結(jié)合類型、 結(jié)合位點數(shù)目以及結(jié)合常數(shù)。 結(jié)果表明， Cy與BSA可形成摩爾比為1∶1的非共價復(fù)合物， 其結(jié)合常數(shù)為5.6×103， 其猝滅類型為靜態(tài)猝滅。 同步熒光光譜研究結(jié)果表明， Cy的結(jié)合主要影響B(tài)SA 的Trp殘基的熒光發(fā)射。 進一步應(yīng)用分子對接研究表明， 氫鍵與疏水作用是Cy與BSA形成復(fù)合物的主要推動力。 Cy與BSA中Trp213及其周圍的氨基酸殘基間存在氫鍵與疏水作用， 這種作用將改變Trp213所處微環(huán)境的疏水情況， 從而導(dǎo)致BSA的熒光發(fā)生猝滅。

金雀花堿； 牛血清白蛋白； 熒光猝滅； 同步熒光光譜法； 分子對接

引 言

分子間相互作用， 尤其是藥物小分子與生物大分子間相互作用研究， 已逐漸成為化學(xué)、 生命科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)等領(lǐng)域中最為活躍的研究熱點之一。 血清蛋白是血漿里含量最高的蛋白質(zhì)， 是體內(nèi)重要的載體。 藥物進入體內(nèi)后一般無法直接作用于病灶部位， 需通過首先與血清蛋白結(jié)合進行運輸， 隨后再釋放為游離態(tài)的方式作用于病灶部位。 因此研究血清蛋白與藥物分子間相互作用對掌握藥物的運輸、 藥理作用的發(fā)揮以及藥物代謝都具有十分重要的意義[1]。 牛血清白蛋白(BSA)含有583個氨基酸殘基， 分子量為66.4 kDa， 因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、 價格不高且與人血清白蛋白(HSA)同源， 因此常用來替代HSA， 研究藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程。

金雀花堿(cytisine, Cy)是一種主要存在于豆科毒豆屬植物種子中的喹諾里西啶生物堿[2](結(jié)構(gòu)見圖1)。 Cy生理功能類似煙堿， 能反射性地興奮呼吸， 使人心跳加速， 血壓急劇上升， 與煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)親和力較強， 用作戒煙藥物使用已有超過40年的歷史[3]。 最近人們發(fā)現(xiàn)， 在體外實驗中金雀花堿表現(xiàn)出一定的抗癌活性[4]， 因此Cy是一種潛在的抗癌藥物。

Cy與蛋白質(zhì)相互作用的研究未見報道。 在模擬生理條件下， 通過熒光光譜法研究了Cy對BSA熒光的猝滅作用， 并利用同步熒光光譜法以及分子對接分析了Cy在BSA上的結(jié)合位點。

Fig.1 The structure of cytisine (Cy)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 熒光光譜儀(瓦里安公司)， FE20K型pH計(梅特勒托利多公司)。

Cy購自上海源葉生物科技有限公司， BSA與三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購于美國Amresco公司， NaCl購于北京化工廠， 色譜純甲醇購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司， HCl與NaOH均購于沈陽化學(xué)試劑廠。 所用試劑純度均為分析純或更高， 實驗用二次去離子水。

1.2 方法

使用HCl， NaOH與Tris分別配制pH為6.4、 7.4與8.4的緩沖溶液， 其中Tris濃度均為0.10 mol·L-1(內(nèi)含0.10 mol·L-1NaCl以維持離子強度)。 應(yīng)用上述緩沖溶液將BSA配制成濃度為5.0×10-4mol·L-1的儲液。 Cy首先用最少量甲醇溶解， 然后用水稀釋為5.0×10-4mol·L-1溶液。

依次準確加入20.0 μL BSA溶液、 1 000.0 μL Tris緩沖溶液以及一定量的Cy儲液于一次性離心管中， 加水稀釋至4 000.0 μL， 隨后進行固定時間恒溫水浴， 水浴結(jié)束后立即對該溶液進行熒光分析， 光譜儀參數(shù)：λex=280 nm，λ(ex slit)=5 nm；λ(em slit)=5 nm； 掃描范圍設(shè)為285～500 nm。 同步熒光測試Δλ分別為15和60 nm。

BSA的三維結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)， PDB ID： 4F5S[5]。 Cy的三維結(jié)構(gòu)取自pubchem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)， 并在Avogadro程序[6]中進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化預(yù)處理。 使用Autodock 4.2進行分子對接[7]。 分子對接在立方體格子中進行， 其長、 寬、 高均為126 ?， 格子間隔為0.375 ?， Cy分子結(jié)構(gòu)中可旋轉(zhuǎn)的單鍵、 非極性氫原子等， 均依照程序默認值未做改動， BSA中Trp134與Trp213殘基設(shè)為柔性， 采用Lamarckian遺傳算法(LGA)， 配體產(chǎn)生100個對接構(gòu)象， ga_pop_size為150， ga_num_evals為2.5×106， ga_num_generations為2.7×104， 其余參數(shù)均按照默認值未做改動。 使用LigPlot+[8]程序分析復(fù)合物中與Cy存在作用的BSA的氨基酸殘基。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液條件對Cy猝滅BSA熒光發(fā)射的影響

BSA在水溶液存在較強熒光發(fā)射， 其最大發(fā)射波長為347 nm[9]。 BSA能夠產(chǎn)生熒光發(fā)射是由于其結(jié)構(gòu)中含有色氨酸(Trp)、 酪氨酸(Tyr)等氨基酸殘基， 其中Trp殘基的貢獻為BSA具有熒光發(fā)射的主要原因[9]。 游離色氨酸的λem為352 nm[10]， 與BSA的熒光最大發(fā)射波長相接近， 可見BSA中Trp殘基所處的微環(huán)境較為親水。 Cy加入后， BSA的熒光發(fā)射明顯下降， 產(chǎn)生猝滅。 本研究主要考查了時間、 溫度以及pH對Cy猝滅BSA的影響。

將含有不同濃度Cy的BSA溶液置于17， 27及37 ℃水浴30 min后立即測試其熒光發(fā)射強度， 并利用得到的F0/F(F0為BSA熒光發(fā)射強度；F為加入Cy后BSA熒光發(fā)射強度)與[Q](Cy濃度)關(guān)系作圖(圖2)。 觀察可知， 在三個溫度下BSA的F0/F值與[Q]都具有良好線性關(guān)系， [Q]相同時低溫下的F0/F值要高于高溫， 這符合文獻[9, 11]所報道的靜態(tài)猝滅規(guī)律。 這可能是由于BSA與Cy所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度上升而下降。 因此， 推測Cy通過與BSA形成復(fù)合物猝滅其熒光。 從三條擬合曲線分布來看， 溫度對于熒光猝滅的影響并不顯著， 但是由于37 ℃為生理溫度， 因此后續(xù)實驗均采用37 ℃為水浴溫度。

Fig.2 The effect of bathing temperature to the fluorescence quenching

λex=280 nm;λem=347 nm;cCy=0.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0×10-6mol·L-1respectively;cBSA=2.5×10-6mol·L-1; buffer pH=7.4; bathing time tbath=30 min

在BSA濃度為2.5×10-6mol·L-1、 Cy濃度為7.5×10-6mol·L-1的條件下， 于37℃分別水浴10， 30， 60， 90和120 min后， 其F0/F值分別為1.67， 1.71， 1.73， 1.75及1.65。 由此可見， Cy對BSA熒光的猝滅在水浴時間為90 min時達到峰值， 但是由于其他溫度下的F0/F值與其相比相差不大， 水浴時間對Cy猝滅BSA影響不大， 同時考慮到BSA暴露于空氣中易發(fā)生氧化引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變， 因此后續(xù)實驗的水浴時間定為30 min。

圖3為不同pH下Cy猝滅BSA熒光的情況， 由圖可以看出pH對于Cy猝滅BSA熒光的影響不很明顯。 相對而言pH 7.4條件下Cy對BSA熒光的猝滅作用較強。 一般來說

Fig.3 The effect of solution pH to the fluorescence quenching

λex=280 nm;λem=347 nm;cCy=0.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0×10-6mol·L-1respectively;cBSA=2.5×10-6mol·L-1; buffer pH=6.7, 7.4 and 8.4 respectively; bathing time tbath=30 min; bathing temperature Tbath=37 ℃

pH 7.4最接近BSA的生理條件， 此條件下BSA結(jié)構(gòu)最為舒展， 藥物分子與BSA結(jié)合后對BSA內(nèi)部疏水性氨基酸殘基的微環(huán)境有較大影響。 因此后續(xù)實驗中pH選擇為7.4。

在完成上述實驗后， 確定溶液pH為7.4、 水浴溫度為37 ℃、 水浴時間為30 min為所得最佳實驗條件。 在此條件下進行一系列不同濃度的Cy猝滅BSA熒光， 結(jié)果見圖4。 由圖可見， 隨著Cy濃度的增加， BSA的熒光光譜發(fā)射強度不斷降低， 并且其最大發(fā)射波長逐漸紅移至355 nm處。 Cy為熒光性物質(zhì)， pH 7.4條件下在368 nm處存在最大熒光發(fā)射， 由此認為在金雀花堿濃度增加的時候， 體系的熒光為BSA與Cy的合并熒光發(fā)射。

Fig.4 Fluorescence emission spectra of BSA-Cy

λex=280 nm;λem=347 nm; 1→7:cCy=0.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0×10-6mol·L-1respectively;cBSA=2.5×10-6mol·L-1; buffer pH 7.4; bathing time tbath=30 min; bathing temperature Tbath=37 ℃

2.2 金雀花堿猝滅BSA熒光發(fā)射機理

根據(jù)Langmuir單分子吸附模型分析配體分子與血清白蛋白發(fā)生作用的結(jié)合常數(shù)、 結(jié)合位點數(shù)等參數(shù)。 以此為模型， 按照Stern-Volmer方程(1)對Cy猝滅BSA的熒光猝滅機理進行分析。

(1)

式中Kq為熒光猝滅速率常數(shù)；τ0是無猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命， BSA等生物大分子的平均τ0為1.0×10-8s。

將圖4中數(shù)據(jù)代入式(1)， 經(jīng)線性擬合后計算可得Kq=5.2×1011L·(mol·s)-1。 通過查閱文獻可知靜態(tài)猝滅最大散射碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·(mol·s)-1[12]， 此值小于本研究中所測Kq值， 由此說明Cy猝滅BSA熒光的動力學(xué)模型是靜態(tài)猝滅， 并且由于Kq值較大， 說明Cy與BSA之間能有效地形成穩(wěn)定的非共價復(fù)合物。

如果熒光分子與猝滅劑之間存在靜態(tài)猝滅， 那么二者之間的關(guān)系可由Scatchard方程(2)推導(dǎo)。

(2)

式中KA為熒光分子與猝滅劑的表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)。

將圖4中數(shù)據(jù)代入式(2)， 線性擬合后計算可得KA=5.6×103L·mol-1， 說明二者之間結(jié)合作用較強。 計算可得n=1.01， 說明Cy與BSA所形成的復(fù)合物中二者的比例為1∶1。

同步熒光分析法具有選擇性高、 譜圖簡化、 光散射干擾少等特點[13]， 常用來研究小分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。 BSA所含有的Trp和Tyr等氨基酸殘基的熒光發(fā)射峰在普通的熒光光譜圖中重疊而無法分辨， 通過同步熒光技術(shù)， 在合適的Δλ條件下可分辨Trp和Tyr殘基的顯性特征峰， 從而實現(xiàn)分析配體猝滅BSA的機理。 由文獻[14]可知， 對于BSA的同步熒光發(fā)射， Δλ為15 nm時只表現(xiàn)Tyr殘基的熒光特性， 而Δλ為60 nm時只表現(xiàn)Trp殘基的熒光光譜特性。

Fig.5 Synchronous fluorescence spectra for the interaction between BSA and Cy

λex=280 nm; 1→7:cCy=0.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0×10-6mol·L-1respectively;cBSA=2.5×10-6mol·L-1; buffer pH=7.4; Bath time tbath=30 min; Bath temperature Tbath=37 ℃

Fig.6 Molecular contacts between the amino acid residues of BSA with Cy. Hydrogen bonds are shown as dashed lines with indicated distances (in ?). Residues in hydrophobic contact with Cy are represented by semicircles and radiating spokes

由圖5可見， 在Δλ為15及60 nm時， 隨著Cy濃度的增加Tyr與Trp殘基的特征發(fā)射峰均出現(xiàn)一定程度的猝滅， 可見在BSA-Cy復(fù)合物中BSA的構(gòu)象產(chǎn)生了變化。 且在Δλ為15 nm條件下， 最大發(fā)射波長由285 nm藍移至277 nm， 說明Cy可促進BSA中Tyr殘基所處的微環(huán)境極性減小， 疏水性增加。 對比圖5(a)與(b)可見， Trp殘基所引起的熒光發(fā)射強度下降對BSA熒光猝滅的貢獻要高于Tyr殘基， 由此可以認為復(fù)合物中Cy可能主要結(jié)合在BSA的Trp殘基。

2.3 分子對接結(jié)果分析

為了推測BSA-Cy復(fù)合物結(jié)構(gòu)， 使用AutoDock[7]軟件對BSA與Cy的識別進行了分子對接研究。 Cy與BSA間相互作用的二維模型如圖6所示。

Cy與BSA結(jié)合后， 同周圍的一些氨基酸殘基間存在氫鍵與疏水作用。 BSA的Phe205， Arg208， Ala209， Ala212， Trp213， Leu346， Lys350， Leu480， Val481等殘基形成一個疏水性口袋， Cy結(jié)合在BSA表面的這個活性口袋中。 Cy與Trp213殘基間距離為2.70 nm， 與Arg208之間距離為3.17 nm， 并且與這兩個殘基之間存在氫鍵作用。 由圖6可以看出， Cy的引入對Trp213殘基周圍的微環(huán)境影響較大， 從而猝滅BSA的熒光發(fā)射。

3 結(jié) 論

通過一系列實驗及相關(guān)計算表明Cy可以通過與BSA形成1∶1型復(fù)合物的方式猝滅BSA的熒光發(fā)射， 結(jié)合常數(shù)為5.6×103L·mol-1。 通過同步熒光光譜分析與分子對接研究發(fā)現(xiàn)Cy主要通過影響B(tài)SA中Trp213殘基的微環(huán)境引發(fā)熒光猝滅。 氫鍵與疏水作用在Cy-BSA復(fù)合物形成過程中起到了重要作用， 是Cy與BSA結(jié)合的主要驅(qū)動力。

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*Corresponding author

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Intermolecular Interactions between Cytisine and Bovine Serum Albumin: A Synchronous Fluorescence Spectroscopic Analysis and Molecular Docking Research

WU Yu-hang1, HAN Zhong-bao1, MA Jia-ze1, HE Yan1, LIU Li-yan1, XIN Shi-gang2, YU Zhan1*

1. School of Chemistry and Chemical and Engineering, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China

2. Experimental Center, Shenyang Normal University， Shenyang 110034, China

Cytisine (Cy) is one of the alkaloids that exist naturally in the plant generaLaburnumof the familyFabaceae. With strong bioactivities, Cy is commercialized for smoking cessation for years. In this work, the study of intermolecular interactions between Cy and bovine serum albumin (BSA) was performed by applying fluorescence spectroscopic methods under simulated physiological conditions. The mechanism of fluorescence quenching of BSA by Cy was also studied. Parameters such as bathing temperature, time and solution pH were investigated to optimize the fluorescence quenching. The binding type, binding ratio and binding constant between BSA and Cy were calculated by using the Stem-Volmer equation. Experimental results indicated that Cy can quench the fluorescent emission of BSA statically by forming a 1∶1 type non-covalent complex and the binding constant is 5.6×103L·mol-1. Synchronous fluorescence spectral research shows Cy may affect the fluorescence emission of Trp residues of BSA. Furthermore, molecular docking is utilized to model the complex and probe the plausible quenching mechanism. It can be noted that the hydrogen bindings and hydrophobic interactions between Cy and BSA change the micro-environment of Trp213, which leads to the fluorescence quenching of BSA.

Cytisine; Bovine serum albumin; Synchronous fluorescence spectroscopy; Fluorescence quenching; Molecular docking

Nov. 12, 2014; accepted Mar. 12, 2015)

2014-11-12，

2015-03-12

國家自然科學(xué)基金項目(21205080)， 教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目(教外司留[2012]1707)， 沈陽師范大學(xué)優(yōu)秀人才支持計劃(2013年)和遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃(LJQ2015105)資助

吳雨杭， 女， 1989年生， 沈陽師范大學(xué)碩士研究生 e-mail: wuyuhang1106@hotmail.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yuzhan@synu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0765-05