申云霞， 趙艷麗， 張 霽， 左智天， 王元忠*， 張慶芝

1. 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院, 云南 昆明 650500

2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所， 云南 昆明 650200

傅里葉紅外光譜對野生及栽培滇龍膽不同部位的研究

申云霞1, 2， 趙艷麗2， 張 霽2， 左智天2， 王元忠2*， 張慶芝1*

1. 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院, 云南 昆明 650500

2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所， 云南 昆明 650200

中藥及其制劑的應(yīng)用具有悠久歷史， 隨著研究的深入， 市場需求量日益增加， 野生資源難以滿足市場需求， 開展野生和栽培品及化學(xué)成分累積動態(tài)的研究具有重要意義。 為了比較野生和栽培的滇龍膽不同部位(根、 莖、 葉)化學(xué)成分的差異， 用傅里葉紅外光譜、 二階導(dǎo)數(shù)光譜對其進行分析及評價研究。 采集60份樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)， 用Nicolet Omnic8.0軟件計算各個樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜和匹配值。 結(jié)果顯示， 野生和栽培滇龍膽根、 莖及葉的紅外光譜圖整體峰形相似， 在1 732， 1 643， 1 613， 1 510， 1 417， 1 366， 1 322， 1 070 cm-1附近主要為酯類、 萜類、 糖類物質(zhì)的吸收峰。 1 800～600 cm-1波段范圍內(nèi)， 樣品與龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰位和峰強有差異， 具有多個指紋特征峰， 分別為1 679， 1 613， 1 466， 1 272， 1 204， 1 103， 1 074， 985， 935 cm-1； 野生和栽培樣品的根在1 613 cm-1(龍膽苦苷中萜類物質(zhì)C—C吸收峰)附近特征峰明顯強于莖和葉， 根中龍膽苦苷類成分高于莖及葉； 野生樣品的莖在1 521， 1 462， 1 452 cm-1附近為木質(zhì)素類物質(zhì)的苯環(huán)骨架振動峰， 并呈現(xiàn)強吸收峰， 栽培樣品莖呈現(xiàn)中等強峰， 莖富含木質(zhì)素類物質(zhì)。 所有樣品紅外光譜與野生樣品根的平均光譜相似度較大， 二階導(dǎo)數(shù)光譜與野生樣品根的平均光譜的相關(guān)性差異較大， 相似度大小分別為： 根>莖>葉。 紅外光譜法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜能為同類物種野生和栽培藥材不同部位的差異分析和評價提供參考。

傅里葉變換紅外光譜； 滇龍膽； 龍膽苦苷； 相似度

引 言

中藥是中醫(yī)防病、 治病的物質(zhì)基礎(chǔ)， 中藥的質(zhì)量影響其臨床療效。 隨著對中藥的深入了解及現(xiàn)代制藥產(chǎn)業(yè)的興起， 對中藥資源的需求量日益增大。 環(huán)境日益惡化和藥用資源的過度開發(fā)， 野生資源日益緊缺， 難以滿足臨床和工業(yè)生產(chǎn)的需求。 為緩解供求矛盾， 藥用植物栽培， 野生變家種已成為中藥行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提。 由于生態(tài)環(huán)境、 遺傳環(huán)境、 人工栽培等因素的影響， 栽培和野生中藥所含化學(xué)成分有差異。 有研究發(fā)現(xiàn)， 野生天麻中天麻素的含量普遍高于栽培品[1]。 野生和栽培防風(fēng)中主要有效成分如升麻苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量無顯著差異， 野生樣品花椒毒素、 補骨脂素和亥茅酚苷的含量高于栽培品[2]。 野生和栽培薄荷中揮發(fā)油類成分的組成和比例上有差異[3]。 同一產(chǎn)地茅蒼術(shù)野生和栽培醇提取液對脾虛小鼠小腸推動和抑菌效果差異較小， 不同產(chǎn)地間兩類樣品的藥效差異大[4]。

隨著對中藥傳統(tǒng)非藥用部位研究興起， 中藥地上部分逐漸被重視， 部分中藥非藥用部位中主要有效成分的含量高于傳統(tǒng)藥用部位的含量。 野生和栽培腫風(fēng)節(jié)不同部位的指紋圖譜差異大小為地下部位>全草>地上部分[5]。 野生麻黃根中麻黃堿的含量極低， 為莖中含量的1/965[6]。 民族藥紅涼傘不同部位巖白菜素的含量由高到底分別為： 根、 葉、 莖、 側(cè)枝、 果柄、 花、 果殼、 種子[7]。 粗毛淫羊藿葉片、 根、 莖部的淫羊藿苷的累積水平高于根莖， 總黃酮類的分布趨勢為葉片、 根莖、 根、 莖， 在各器官中累積和分布差異較大[8]。 因此， 對中藥野生和栽培、 不同部位的分析評價具有重要意義。 傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)具有無損、 快速、 靈敏度高等特點， 近年來， 被廣泛用于中藥質(zhì)量研究[9-14]。 本實驗采用傅里葉中紅外光譜法探討滇龍膽(GentianarigescensFranch.)野生和栽培不同部位(根、 莖、 葉)的差異， 以龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照， 分析不同部位中龍膽苦苷含量的差異， 有助于滇龍膽藥材整體質(zhì)量控制， 為其規(guī)范化生產(chǎn)基地建設(shè)和資源的合理利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Perkin-Elmer公司Fronter型傅里葉紅外光譜儀， 中紅外三甘氨酸硫酸酯(DTGS)檢測器， 光譜范圍為4 000～400 cm-1， 光譜分辨率為4 cm-1， OPD速度0.5 cm·s-1， 每個樣品累加掃描16次， 掃描時扣除水和二氧化碳的干擾。 壓片機為YP-2(上海山岳科學(xué)儀器儀器公司)。 KBr為分析純， 購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司； 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號： 110770-201314)， 購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 材料

野生和栽培滇龍膽實驗材料于2012年10月采自云南臨滄市云縣， 生長年限為2年， 所有材料經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為龍膽科植物滇龍膽(GentianarigescensFranch.)。 將樣品分為根、 莖、 葉三個部位， 在50 ℃條件下烘48 h， 分別粉碎過100目篩。

Table 1 Information of G. rigescens samlpes

1.3 方法與數(shù)據(jù)處理

稱取1.0 mg樣品與100.0 mg溴化鉀混合， 充分研磨， 壓制成透明薄片， 每個樣品平行測定三次， 獲得平均光譜。 用Nicolet Omnic8.0紅外光譜分析軟件對所有樣品的光譜進行基線校正、 歸一化預(yù)處理及光譜的相似性計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生和栽培滇龍膽不同部位紅外光譜分析

cm-1附近為烯醚雙鍵的伸縮振動峰， 1 610 cm-1為萜類物質(zhì)C—C反對稱伸縮振動， 為龍膽苦苷紅外光譜的的特征吸收峰， 1 510和1 423 cm-1是木質(zhì)素類物質(zhì)中苯環(huán)的吸收峰， 1 418 cm-1是烯烴端基碳上的CH2變角振動， 1 072 cm-1為糖類物質(zhì)的C—OH伸縮振動峰， 926 cm-1附近為糖類化合物的端基碳C—H彎曲振動峰。 光譜特征綜合反映滇龍膽含有酯類、 萜類、 糖類、 木質(zhì)素類等物質(zhì)， 化學(xué)成分復(fù)雜多樣。

Fig.1 FITR spectra of gentiopicroside and root, stem and leaf of wild G. rigescens

Fig.2 FITR spectra of gentiopicroside and root, stem and leaf of cultivated G. rigescens

滇龍膽樣品特征峰位/cm-1根(W)17321673161014171372131612651069926莖(W)17321649150914171372131612621072890葉(W)173216491509141713721316126210721027887798根(C)17321643161314231369131612621069771莖(C)17321619151014181369131612591069774葉(C)1732164315091418136913191244115210691028龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品170616761607145614231271120610721030932879

Note: W is wild samples; C is cultivation samples

2.2 野生及栽培滇龍膽不同部位和龍膽苦苷二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析

二階導(dǎo)數(shù)光譜可以消除圖譜中傾斜的基線， 提高分辨率， 呈現(xiàn)出許多被掩蓋的吸收峰[15]。 圖3為野生和栽培滇龍膽根、 莖和葉在1 800～600 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)譜， 表3為不同類型、 不同部位樣品在指紋區(qū)的峰位表。 表3和圖3顯示， 在高分辨率的二階導(dǎo)數(shù)譜中滇龍膽不同部位的譜峰特征均明顯增多， 原譜中差異不顯著的峰位處， 在1 600～1 200和1 100～800 cm-1區(qū)域呈現(xiàn)出多個具有差異的峰形。

2.2.1 滇龍膽藥材與龍膽苦苷二階導(dǎo)數(shù)光譜比較

滇龍膽樣品和龍膽苦苷的二維紅外光譜顯示， 在1 800～600 cm-1處峰形、 峰位和吸收強度有差異， 龍膽苦苷1 679， 1 613， 1 466， 1 272， 1 204， 1 103， 1 074， 985， 935 cm-1的指紋特征峰在滇龍膽樣品中峰與峰之間對應(yīng)得較好。

2.2.2 野生和栽培滇龍膽樣品不同部位的二階導(dǎo)數(shù)光譜分析

紅外光譜分析結(jié)果顯示， 1 613 cm-1附近為C—C反對稱伸縮振動峰， 歸屬為萜類物質(zhì)的吸收峰， 野生和栽培樣品根吸收峰強度高于莖及葉， 野生滇龍膽根的吸收峰強度最大， 表明此類物質(zhì)在野生滇龍膽根中含量最高； 1 516， 1 468， 1 453 cm-1為木質(zhì)素類物質(zhì)中苯環(huán)和芳香類物質(zhì)的振

Fig.3 Second derivative of IR spectra of different parts ofG.rigescensand gentiopicroside W is Wild samples; C is cultivation samples; S is gentiopicroside standard

Table 3 Peak-positions of the secone derivative spectra of different parts

Note: W is Wild samples; C is cultivation samples

2.3 野生和栽培滇龍膽不同部位樣品紅外光譜相關(guān)性比較

用光譜檢索的方法對樣品的紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)譜進行分析， 所有樣品根、 莖和葉的紅外光譜分別與野生樣品根的平均光譜進行比較。 建立野生滇龍膽根的原始光譜Lib1、 二階導(dǎo)數(shù)光譜Lib2的平均光譜， 平均圖譜加入譜庫， 用圖譜檢索功能， 對所研究的光譜進行相關(guān)性檢索， 光譜范圍為4 000～500 cm-1， 計算樣品與平均光譜的匹配值， 結(jié)果如表4所示。 匹配數(shù)值的大小反映樣品間成分的差異， 也反映了各自結(jié)構(gòu)特點的不同， 值越大表明匹配程度較好。

用樣品的紅外光譜與野生根的平均光譜比較中， 光譜匹配值較大， 野生樣品的不同部位與光譜庫Lib1匹配值大于栽培的樣品， 樣品各部位有差異， 但差異較小。 二階導(dǎo)數(shù)放大了光譜特征， 增加光譜信息量； 不同類型、 不同部位的樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜與光譜庫Lib2的匹配值差異較大， 樣品根與Lib2的匹配值較大分別為92.11和86.57， 莖及葉的匹配值較低， 樣品不同部位差異大。 建立二階導(dǎo)數(shù)光譜庫比原始光譜譜庫更有利于樣品的鑒別， 該方法可用于滇龍膽樣品根、 莖和葉的鑒別。

Table 4 Similarity of FTIR spectra of G. rigescens

3 結(jié) 論

采用傅里葉紅外光譜結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜、 光譜檢索法對滇龍膽野生和栽培根、 莖和葉三個不同部位60份樣本進行鑒別研究。 結(jié)果表明， 根、 莖和葉紅外光譜的峰形、 峰位差異較小， 在3 381， 2 922， 2 851， 1 732， 1 676， 1 417， 1 366， 1 072 cm-1等處均有吸收峰， 野生和栽培莖和葉在1 732 cm-1處的吸收峰強度大于根， 根分別在1 640和1 614 cm-1處有吸收峰， 葉在1 028 cm-1處呈現(xiàn)弱的吸收峰。 二階導(dǎo)數(shù)譜可以放大光譜的信息， 樣品與龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品二階導(dǎo)數(shù)光譜存在九個共有峰， 根據(jù)峰的強度可以對不同部位進行鑒別。 利用Nicolet Omnic8.0軟件建立野生根平均光譜的紅外光譜(Lib1)和二階導(dǎo)數(shù)光譜(Lib2)組成的光譜數(shù)據(jù)庫， 樣品的紅外光譜與光譜庫Lib1的得分要高， 相關(guān)性較好； 樣品不同部位的二階導(dǎo)數(shù)光譜和光譜庫Lib2的得分值差異較大。 紅外光譜法可為野生和栽培滇龍膽不同部位分析評價提供了一種有效、 快速和簡便的鑒別方法， 為其化學(xué)成分的的進一步研究及資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Study on Different Parts of Wild and CultivatedGentianaRigescenswith Fourier Transform Infrared Spectroscopy

SHEN Yun-xia1, 2, ZHAO Yan-li2, ZHANG Ji2, ZUO Zhi-tian2, WANG Yuan-zhong2*, ZHANG Qing-zhi1*

1. College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China

The application of traditional Chinese medicine (TCM) and their preparations have a long history. With the deepening of the research, the market demand is increasing. However, wild resources are so limited that it can not meet the needs of the market. The development of wild and cultivated samples and research on accumulation dynamics of chemical component are of great significance. In order to compare composition difference of different parts (root, stem, and leaf) of wild and cultivatedG.rigescens, Fourier infrared spectroscopy (FTIR) and second derivative spectra were used to analyze and evaluate. The second derivative spectra of 60 samples and the rate of affinity (the match values) were measured automatically using the appropriate software (Omnic 8.0). The results showed that the various parts of wild and cultivatedG.rigescens. were high similar the peaks at 1 732, 1 643, 1 613, 1 510, 1 417, 1 366, 1 322, 1 070 cm-1were the characteristic peak of esters, terpenoids and saccharides, respectively. Moreover, the shape and peak intensity were more distinct in the second derivative spectrum of samples. In the second derivative spectrum range of 1 800～600 cm-1, the fingerprint characteristic peak of samples and gentiopicroside standards were 1 679, 1 613, 1 466, 1 272, 1 204, 1 103, 1 074, 985, 935 cm-1. The characteristic peak intensity of gentiopicroside of roots of wild and cultivated samples at 1 613 cm-1(C—C) was higher than stems and leaves which indicated the higher content of gentiopicroside in root than in stem and leaves. Stems of wild samples at 1 521, 1 462 and 1 452 cm-1are the skeletal vibration peak of benzene ring of lignin, and the stem of cultivated sample have stronger peak than other samples which showed that rich lignin in stems. The iInfrared spectrum of samples were similar with the average spectral of root of wild samples, and significant difference was found for the correlation between second derivative spectrum of samples and average spectral of wild samples root, and the sequence of similarity was root>stem>leaf. Therefore, FTIR combined with second derivative spectra was an express and comprehensive approach to analyze and evaluate in the imperceptible differences among different parts of wild and cultivated ofG.rigescens.

Fourier transform infrared spectroscopy;Gentianarigescens; Gentiopicroside; Similarity

Oct. 17, 2014; accepted Feb. 20, 2015)

2014-10-17，

2015-02-20

國家自然科學(xué)基金項目(81260608)和云南省自然科學(xué)基金項目(2013FD066, 2013FZ150, 2014FD068)資助

申云霞， 女, 1991年生， 云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院碩士研究生 e-mail： shenyunxia1991@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： yzwang1981@126.com； ynkzqz@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0667-05

*Corresponding authors