李培根，王 釗，曹學(xué)麗

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

高純度蘇丹紅單體的高效逆流色譜純化研究

李培根，王 釗，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

建立了兩種高純度蘇丹紅單體的高效逆流色譜分離純化方法。采用1 000 mL逆流色譜分離柱，V（正己烷）∶V（乙腈）=1∶1體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速為45 mL/ min，上樣量600 mg，經(jīng)過一次分離純化（40 min），即可將蘇丹紅Ⅱ樣品的檢測純度（280 nm下）從97.01%提高到98.42%，得率為90.8%。在254 nm和500 nm下的純化組分檢測純度也分別可以達(dá)到98.01%和99.79%。采用同樣的色譜柱，V（正己烷）∶V（乙腈）∶V（乙酸乙酯）=5∶5∶1體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速為20 mL/ min，上樣量900 mg，經(jīng)過兩步分離純化，可以將蘇丹紅Ⅳ的檢測純度（280 nm下）從84.67%提高到96.6%，得率為48.8%。在254 nm和500 nm下的檢測純度可以分別達(dá)到97.16%和98.32%。該方法具有快速、高效、制備量大等特點(diǎn)，可以為高質(zhì)量蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制提供技術(shù)支持。

逆流色譜；蘇丹紅Ⅱ；蘇丹紅Ⅳ；高純度；分離純化

蘇丹紅（Sudan）是人工合成的親脂性偶氮染料，多用于油彩、機(jī)油、蠟和鞋油等產(chǎn)品的染色。主要有蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4種結(jié)構(gòu)。早在1995年歐盟等國家和地區(qū)已禁止其作為色素添加在食品中，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ列為動(dòng)物致癌物，我國衛(wèi)生監(jiān)管部門已禁止蘇丹紅作為食品添加劑使用。但是由于用蘇丹紅染色后的食品顏色非常鮮艷且不易褪色，能引起人們強(qiáng)烈的食欲，一些不法食品企業(yè)把蘇丹紅添加到食品中［1 -7］。常見的添加蘇丹紅的食品有辣椒粉、辣椒油、紅豆腐，紅心禽蛋等。我國已經(jīng)制定了檢測食品中蘇丹紅的高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)方法，方法檢出限為0.010 μg / g［8］。目前國內(nèi)外對于蘇丹紅的研究也多集中在食品中蘇丹紅的檢測方法上［9 -13］。由于在檢測中多采用其特征波長500 nm作為檢測波長，且用較低濃度的對照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，對照品中少量雜質(zhì)在HPLC圖中多數(shù)反映不出來，因而易被忽略。我們在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)市場上的蘇丹紅對照品良莠不齊，價(jià)格懸殊，進(jìn)口產(chǎn)品根據(jù)純度也有很大的價(jià)格差異。用沒有經(jīng)過嚴(yán)格檢定的對照品對食品樣品中的低含量蘇丹紅進(jìn)行定量分析，必對其準(zhǔn)確性帶來影響。

本研究嘗試用逆流色譜方法對兩個(gè)蘇丹紅樣品進(jìn)行純化，以期得到高純度的蘇丹紅單體，為高純度蘇丹紅對照品的制備提供一條技術(shù)途徑。逆流色譜是一種新型的液-液分配色譜分離技術(shù)，它具有制備量大、分離效率高、成本低、操作簡單等特點(diǎn)［14 -15］。關(guān)于逆流色譜在蘇丹紅分離方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道［16］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇丹紅樣品從市場獲得，分別為蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ粗樣。蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的4種化學(xué)結(jié)構(gòu)式，如圖1。正己烷和乙腈，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，分析純，北京化工廠；乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Scientific；冰醋酸，色譜純，光復(fù)精細(xì)化工；純水由Millipore-Q純水機(jī)自制。

圖1 蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of SudanⅠ，Ⅱ，ⅢandⅣ

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜系統(tǒng)（配備在自動(dòng)進(jìn)樣器，四元梯度泵，DAD檢測器），美國Agilent公司；DE-spectrum型（柱體積22.5 mL/135 mL）、DE-MIDI型（柱體積1 000 mL）高效逆流色譜儀（high performance countercurrent chromatography，HPCCC），英國DE公司；Smart line 1 000型和Azura P2.1型制備液相系統(tǒng)（配逆流色譜儀），德國KNANER公司；AB135-S型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-400DB型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

采用DE-spectrum小體積逆流色譜儀進(jìn)行溶劑體系的篩選，再采用DE-MIDI大體積逆流色譜儀對蘇丹紅Ⅱ和Ⅳ兩個(gè)樣品進(jìn)行分離純化，并采用HPLC對純化前后樣品組分進(jìn)行分析。

1.3.1 高效液相色譜分析

經(jīng)過不同流動(dòng)相及梯度的優(yōu)化，以4種蘇丹紅的完全分離為目標(biāo)，最終選定的色譜條件為Agilent ZOBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25℃；流動(dòng)相V（φ（醋酸）= 0.75%水溶液）∶V（乙腈）=0.5∶0.95，等度洗脫（0～13 min）；DAD檢測波長254，500，280 nm；流速1.0 mL/ min；進(jìn)樣量10 μL。

采用上述條件對蘇丹紅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ的混合樣及蘇丹紅Ⅱ和Ⅳ粗樣進(jìn)行分析，比較了其在不同濃度和不同波長下檢測時(shí)純度的差異。并對純化后的樣品純度進(jìn)行了檢測。

1.3.2 逆流色譜分離

1.3.2.1 分離條件的選擇

采用小體積的DE-Spectrum HPCCC（柱體積為22.5 mL）進(jìn)行溶劑體系和條件的選擇。根據(jù)蘇丹紅的弱極性，首先實(shí)驗(yàn)了弱極性的V（正己烷）∶V（乙腈）=1∶1體系對蘇丹紅Ⅱ和Ⅳ的純化效果，后對蘇丹紅Ⅳ的純化采用了微調(diào)后的V（正己烷）∶V（乙腈）∶V（乙酸乙酯）= 5∶5∶1體系。分離條件為上樣量10 mg溶解在1 mL流動(dòng)相中；采用上述溶劑體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速1 mL/ min；轉(zhuǎn)速1 400 r/ min；檢測波長500 nm。

1.3.2.2 半制備分離

采用DE-Spectrum HPCCC（柱體積為135 mL）進(jìn)行半制備分離實(shí)驗(yàn)。上樣量60 mg溶解在2 mL流動(dòng)相中；溶劑體系同1.3.2.1節(jié)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速6 mL/ min；轉(zhuǎn)速1 400 r/ min；檢測波長500 nm。

1.3.2.3 大制備量分離純化

采用大體積的DE-MIDI（柱體積1 000 mL）對蘇丹紅Ⅱ和Ⅳ進(jìn)行大量分離純化。上樣量600～900 mg溶解在25～50 mL的1∶1的上下相混合液中；溶劑體系同上，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速45 mL/ min（蘇丹紅Ⅱ），20 mL/ min（蘇丹紅Ⅳ）；轉(zhuǎn)速1 100 r/ min；檢測波長500 nm。對蘇丹紅Ⅳ還需進(jìn)行二次純化。

1.3.2.4 分離操作過程

每次分離前，將預(yù)先配制好的兩相溶劑體系分離；將上相作為固定相以較大的流速泵入逆流色譜柱內(nèi)；接著將儀器調(diào)至相應(yīng)的轉(zhuǎn)速，將下相作為流動(dòng)相以相應(yīng)的流速泵入柱中，待柱后只有流動(dòng)相流出，表明體系達(dá)到平衡，記錄推出的固定相體積，計(jì)算固定相保留率Sf，并將樣品注入進(jìn)樣環(huán)；然后用流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，根據(jù)檢測器所檢測到的色譜峰分段收集流份，并用HPLC進(jìn)行分析。最后將純度相近的流份合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮后真空干燥，得到最終純化物。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘇丹紅的HPLC分析

2.1.1 4種蘇丹紅混合物的分析

采用優(yōu)化后的HPLC條件可以使蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ實(shí)現(xiàn)很好的分離，如圖2，為后續(xù)分離物的分析檢測奠定了良好基礎(chǔ)。且從圖2中的UV光譜圖可以看出，4種蘇丹紅均在480～520 nm之間有一個(gè)特征吸收，故通常采用500 nm作為樣品中蘇丹紅檢測的特征波長。但是對于用于定量的蘇丹紅標(biāo)樣而言，在500 nm下進(jìn)行檢測，有可能由于在該波長下其中雜質(zhì)的低響應(yīng)值而被掩蓋，標(biāo)樣純度不準(zhǔn)確或以次充好，從而影響定量的準(zhǔn)確性。

2.1.2 不同濃度對蘇丹紅純度的影響

樣品在不同濃度下對雜質(zhì)進(jìn)行檢測（檢測波長500 nm），如圖3。

圖2 4種蘇丹紅混合物的HPLC分析Fig.2 HPLC chromatogram of Sudan mixed samples

圖3 蘇丹紅Ⅱ和Ⅳ在不同濃度下的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of SudanⅡandⅣat different concentrations

由圖3可知，同一樣品隨著樣品濃度不斷提高，低濃度無法檢測的雜質(zhì)峰越來越明顯。蘇丹紅定量檢測中常用的線性范圍為1.0～20 μg/ mL，在此濃度范圍內(nèi)，有些蘇丹紅標(biāo)樣中存在的雜質(zhì)很可能因響應(yīng)值低而被忽略。本文在較高的100 μg/ mL濃度下分析蘇丹紅樣品的純度。

2.1.3 檢測波長對蘇丹紅純度的影響

使用254，500，280 nm等3個(gè)波長對濃度為100 μg/ mL的蘇丹紅Ⅳ進(jìn)行分析檢測，見圖4。

圖4 不同波長下蘇丹紅Ⅳ的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatogram of SudanⅣat different detection wavelengths

從圖4可以看出蘇丹紅Ⅳ在不同波長下被檢出的雜質(zhì)含量有差異，其中280 nm下雜質(zhì)吸收較高。在254，280，500 nm下蘇丹紅Ⅳ的檢測純度分別為88.2%，83.8%，93.4%，可見使用500 nm作為檢測波長所得到的檢測純度最高，難以發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)，而使用280 nm時(shí)其檢測純度大幅下降，所以應(yīng)使用多個(gè)波長，尤其是254 nm和280 nm等通用波長對蘇丹紅標(biāo)樣純度進(jìn)行考究。本文后續(xù)的工作即是采用逆流色譜對兩個(gè)蘇丹紅樣品進(jìn)行了分離純化，以提高其純度。

2.2 蘇丹紅Ⅱ的純化

根據(jù)蘇丹紅的結(jié)構(gòu)特性，選取非極性的V（正己烷）∶V（乙腈）=1∶1作為分離體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)進(jìn)行分離。蘇丹紅Ⅱ在不同柱體積下分離的逆流色譜，見圖5。

先實(shí)驗(yàn)了少量樣品在小體積柱上的分離效果，雜質(zhì)與蘇丹紅Ⅱ能夠完全分離，如圖5a。然后逐級(jí)在半制備柱和制備柱上進(jìn)行了放大分離，如圖5b和5c，在較短時(shí)間內(nèi)，都取得了很好的分離結(jié)果。

蘇丹紅Ⅱ粗樣及分離后各級(jí)分的HPLC分析結(jié)果見圖6。

由圖6可知，通過一次逆流色譜分離，樣品中主要的雜質(zhì)基本完全去除。蘇丹紅Ⅱ的檢測純度（峰面積歸一化法，280 nm）從97.01%提高到98.42%，得率（產(chǎn)品質(zhì)量/上樣量）為90.8%。在254 nm和500 nm下的純化組分檢測純度也分別可以達(dá)到98.01%和99.79%。

2.3 蘇丹紅Ⅳ的純化

根據(jù)HPLC分析可知，蘇丹紅Ⅳ樣品中雜質(zhì)較蘇丹紅Ⅱ中更多，純度更低，純化的難度要大。同樣先選取非極性的V（正己烷）:V（乙腈）= 1:1作為分離體系，上相為固定相，下相為流動(dòng)進(jìn)行分離，見圖7。

圖5 蘇丹紅Ⅱ在不同柱體積下分離的逆流色譜Fig.5 High performance countercurrent chromatogram ofSudanⅡin different column volumes

圖6 280 nm條件下蘇丹紅Ⅱ粗樣及分離后各成分的HPLC分析Fig.6 HPLC chromatogram of SudanⅡcrude sample and different fractions under 280 nm

圖7 蘇丹紅Ⅳ樣品逆流色譜純化條件的優(yōu)化Fig.7 Optimization of high performance countercurrent chromatography conditions for SudanⅣ

先實(shí)驗(yàn)了少量樣品在小體積柱上的分離效果，如圖7a，雜質(zhì)與蘇丹紅Ⅳ不能很好分離。然后將稍微提高體系極性，調(diào)整為V（正己烷）∶V（乙腈）∶V（乙酸乙酯）=5∶5∶1，再進(jìn)行分離，如圖7b，雜質(zhì)與蘇丹紅Ⅳ的分離度有了明顯改善。然后采用該體系在半制備柱進(jìn)行了分離，如圖7c。

在上述優(yōu)化條件下，在制備柱上對蘇丹紅Ⅳ樣品進(jìn)行分離，見圖8。

首先進(jìn)行放大分離，如圖8a，一次分離所收集的蘇丹紅Ⅳ級(jí)分經(jīng)HPLC分析純度并不理想。因此將各收集級(jí)分按純度合并為兩個(gè)級(jí)分Ⅳ-1和Ⅳ-2，濃縮后分別進(jìn)行了二次分離，如圖8b和圖8c。經(jīng)過二次分離，蘇丹紅Ⅳ樣品中大部分的雜質(zhì)得到了去除。

蘇丹紅Ⅳ樣品分離前后的HPLC分析見圖9。

由圖9可知，通過二步逆流色譜分離，蘇丹紅Ⅳ的檢測純度（280 nm下）從84.67%提高到96.6%，得率為48.8%。在254 nm和500 nm下的檢測純度可以分別達(dá)到97.16%和98.32%。但是從圖9中也可以看出，其中仍有一個(gè)難以分離的雜質(zhì)存在，需要以后采取其他手段再進(jìn)一步純化。

圖8 蘇丹紅Ⅳ樣品的制備性逆流色譜純化Fig.8 Preparative high performance countercurrent chromatography of SudanⅣ

圖9 蘇丹紅Ⅳ樣品分離前后的HPLC分析圖Fig.9 HPLC chromatogram of SudanⅣcrudesample and purified product

3 結(jié) 論

針對市場上蘇丹紅對照品良莠不齊的情況及其對食品樣品中的低含量蘇丹紅定量檢測的準(zhǔn)確性可能存在的影響，建立了兩種高純度蘇丹紅單體的逆流色譜純化方法，該方法可以有效去除蘇丹紅樣品中的雜質(zhì)，使蘇丹紅Ⅱ的檢測純度（280 nm下）從97.01%提高到98.42%，蘇丹紅Ⅳ的檢測純度（280 nm下）從84.67%提高到96.6%。且逆流色譜法具有快速、高效、制備量大等特點(diǎn)，本文所采用的逆流色譜純化蘇丹紅的單次上樣量和分離效率也是一般方法難以比擬的，為蘇丹紅樣品的高效純化及高純度蘇丹紅對照品的制備提供了一條有效的途徑。

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Purification of High Pure Sudans by High Performance Countercurrent Chromatography

LI Peigen，WANG Zhao，CAO Xueli*
（School of Food and Chemical Engineering/ Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/ Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The separation methods of two high pure Sudans by high performance countercurrent chromatography（CCC）were developed.The solvent system composed of hexane: acetonitrile（1∶1，V/ V）with the lower phase was the mobile phase at the flow-rate of 45 mL/ min，and 600 mg sudanⅡsample was purified within 40 min using the 1 000 mL column.The results showed that its purity（280 nm）was improved from 97.01%to 98.42%with the yield of 90.8%，while its purity at 254 nm and 500 nm reached 98.01%and 99.79%，respectively.Using the solvent system composed of hexane∶acetonitrile∶ethyl acetate（5∶5∶1，V/ V/ V）with the lower phase as the mobile phase at the flow-rate of 20 mL/ min，900 mg SudanⅣsample was purified through two-steps.As a result，its purity（280 nm）could be improved from 84.67%%to 96.6%with the yield of 48.8%，while its purity at 254 nm and 500 nm could also reach 97.16%and 98.32%，respectively.This method with the characters of high-speed，high-efficiency，and high preparation quality could give supports for the study of high pure Sudans standards.

countercurrent chromatography；SudanⅡ；SudanⅣ；high pure；separation and purification

李 寧

TS207.3

A

10.3969/ j.issn.2095-6002.2016.03.010

2095-6002（2016）03-0067-07

李培根，王釗，曹學(xué)麗.高純度蘇丹紅單體的高效逆流色譜純化研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34（3）:67 -73.

LI Peigen，WANG Zhao，CAO Xueli.Purification of high pure Sudans by high performance countercurrent chromatography ［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（3）:67 -73.

2015- 11- 04

李培根，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程；*曹學(xué)麗，女，教授，博士，主要從事生物分離和分析方面的研究。通信作者。