姜 微，劉效辰，邱榮群，吳曉菲，溫錦濤，羅 娜，羅 瓊

(長沙醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)教研室，湖南長沙 410219)

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油茶內(nèi)生拮抗菌的篩選與鑒定

姜 微，劉效辰，邱榮群，吳曉菲，溫錦濤，羅 娜，羅 瓊*

(長沙醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)教研室，湖南長沙 410219)

摘要[目的]通過對湖南長沙地區(qū)油茶內(nèi)生拮抗菌的篩選，為油茶根腐病、葉枯病、炭疽病及軟腐病的生物防治提供理論依據(jù)。[方法]采用研磨法從健康油茶根、莖、葉組織中分離出內(nèi)生菌，通過平板對峙試驗(yàn)篩選出對油茶根腐病、葉枯病、炭疽病及軟腐病都具有拮抗活性的內(nèi)生菌，并進(jìn)行形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析。[結(jié)果]不同組織內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量不同，根中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量最多，其次為莖，葉中最少。菌株J-3-1對油茶根腐病菌、葉枯病菌、炭疽病菌及軟腐病菌均有拮抗活性，其抑菌圈半徑分別為12.5、16.8、13.5、13.4 mm。16S rDNA相似性為99%。[結(jié)論]通過對該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

關(guān)鍵詞油茶；內(nèi)生拮抗菌；分離鑒定

油茶根腐病、葉枯病、炭疽病和軟腐病是近年來發(fā)生頻繁且危害嚴(yán)重的油茶病害[1-2]，該病分布廣泛，可造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。內(nèi)生菌具有在植物體內(nèi)獨(dú)立自主的分裂繁殖和傳遞特性，可增強(qiáng)宿主對其他生物如病原細(xì)菌和真菌的抗性，分離并利用植物內(nèi)生菌控制植物病蟲害、開發(fā)有益內(nèi)生菌以提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)對于可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。自20世紀(jì)中葉以來，國外在多種植物中分離得到了不同種屬的內(nèi)生細(xì)菌[3]。近年來，對植物內(nèi)生菌代謝物的生防物質(zhì)研究取得了一定進(jìn)展[4]。楊慧勇等[5]從銀杏上分離到一株病菌，該病菌的代謝產(chǎn)物對小麥赤霉病毒和紋枯病菌等植物病原真菌有很強(qiáng)的抑制作用[5]。陳敏等[6]從黃瓜根系內(nèi)篩選出對黃瓜枯萎病具有一定拮抗能力的內(nèi)生菌HE-1和HE-2。截至目前，對油茶病害主要采用化學(xué)防治，但大量化學(xué)農(nóng)藥會(huì)影響油茶品質(zhì)和茶園生態(tài)環(huán)境。筆者篩選出對油茶炭疽病、葉枯病、根腐病和軟腐病有強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用生防菌資源防治油茶病害提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料于2014年10月在湖南省長沙市望城區(qū)采集健壯的油茶根、莖、葉樣品備用。

1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15～20 g，自來水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，自來水1 000 mL，pH 7.0～7.2 。PDA培養(yǎng)基：先洗凈去皮，再稱取300 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾。葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，自來水 1 000 mL。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1材料的消毒。取新鮮油茶的根、莖、葉，用自來水沖洗晾干后，各稱取1 g，用75%乙醇浸泡1 min， 再用2.5%的次氯酸鈉浸泡5 min，最后用無菌水沖洗3～ 4次。在無菌環(huán)境下，將最后一次沖洗液涂布于NA培養(yǎng)基上，26～28 ℃培養(yǎng)2 d，平板中若無菌落出現(xiàn)，則表示消毒徹底，若有，則需重新分離。

1.3.2菌懸液的制備。將消毒后的根、莖、葉分別放入無菌研缽中，吸取9 mL無菌水，將其研磨徹底后充分混勻，即為10-1的菌懸液，再依次進(jìn)行梯度稀釋，根和莖的梯度為10-1、10-2、10-3、10-4，葉的梯度為10-1、10-2、10-3。

1.3.3內(nèi)生菌的分離與種群密度測定。取各稀釋度的菌懸液0.1 mL分別涂布于NA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理3 個(gè)平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，分別計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)(包括顏色、大小、形狀、透明度、表面光澤度、邊緣整齊度等)[7]，挑取具有代表性的單菌落，純化后斜面保存。

1.3.4內(nèi)生拮抗菌的篩選[8]。將預(yù)先培養(yǎng)的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)皿中心，采用兩點(diǎn)對峙的方法，在距PDA平板中心3 cm的2點(diǎn)上，分別接種內(nèi)生菌，每個(gè)處理均設(shè)2個(gè)重復(fù)。將只接種病原菌不接種內(nèi)生菌的處理設(shè)為空白對照，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察抑菌作用，用毫米刻度尺測量其內(nèi)生菌與病菌菌落生長的相向半徑(R病)以及空白對照半徑(R0)，并計(jì)算抑制率。

病菌的生長抑制率=(R0-R病)/R0×100%

1.3.5PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件。 菌株用NB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜，用Tiangen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，其序列(擴(kuò)增片段大小約1 500 bp)為Univeirsal bacterial F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，Univeirsal bacterial R：5′-AAGGAGGTGWTCC-ARCC-3′。

PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)：2×powerTapMix 12.5 μL，去離子水9.5 μL，引物F 1.0 μL，引物R 1.0 μL，DNA模板1.0 μL。混勻后稍微離心。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用含GoldView的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓90 V，電泳30 min。在紫外分光儀下觀察并拍照。

1.3.6DNA序列測定和分析。擴(kuò)增產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行比對分析。

2結(jié)果與分析

2.1油茶不同組織內(nèi)生菌的種群密度由圖1可知，油茶內(nèi)生菌的種群密度在根中最高，約為2.10×104CFU/mg，莖中次之，約為2.20×103CFU/mg，葉中最低，約為1.1×102CFU/mg。

2.2內(nèi)生細(xì)菌對油茶常見病原菌的拮抗效果由表1可知，菌株J-3-1對油茶葉枯病菌、炭疽病菌、軟腐病菌和根腐病菌均有較強(qiáng)的拮抗作用(圖2)，抑制圈半徑分別為16.8、13.5、13.4和12.5 mm，抑菌率分別為66.3%、71.0%、52.2%和65.2%。由此可見，菌株J-3-1對油茶常見病原菌拮抗作用較強(qiáng)，抑菌譜較廣，具有較好的生防應(yīng)用潛力。

圖1　油茶不同組織內(nèi)生菌的種群密度Fig.1　Population density of endophytic fungi in different tissues of oil-tea

表1內(nèi)生細(xì)菌對油茶4種病原菌的抑菌效果

Table 1The antibacterial effect of endophytic bacteria on four kinds of common pathogens of oil-tea

菌株Strains病原菌Pathogenicbacteria抑制圈半徑Inhibitoryzoneradius∥mm抑菌率Inhibitionrate∥%J-3-1油茶葉枯病菌16.866.3J-3-1油茶炭疽病菌13.571.0J-3-1油茶軟腐病菌13.452.2J-3-1油茶根腐病菌12.565.2

注：a.炭疽病菌；b.根腐病菌；c.軟腐病菌。Note：a.Anthrax bacteria；b.Fusarium oxysporum；c.Bacteria erwinia.圖2　J-3-1對油茶常見病菌的拮抗效果Fig.2　Antagonistic effect of J-3-1 on common pathogen of oil tea

2.3內(nèi)生拮抗菌16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列相似性分析由圖3可知，在1 500 bp左右產(chǎn)生明顯的條帶，條帶清晰且單一，與預(yù)期目標(biāo)大小一致。將測序結(jié)果與基因庫(www.ncbi.nov.gov/blast)中的序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，16S rDNA相似性為99%。

注：M.DL2 000 DNA Marker。Note:M.DL2 000 DNA Marker.圖3　PCR 產(chǎn)物Fig.3　PCR products

3結(jié)論與討論

在分離植物內(nèi)生菌的過程中，表面滅菌和分離培養(yǎng)條件是篩選內(nèi)生菌的關(guān)鍵，表面滅菌不徹底會(huì)造成所分離的菌株不是內(nèi)生菌，而表面滅菌過度會(huì)造成部分內(nèi)生菌被殺死，最佳培養(yǎng)條件能最大限度地獲得較多的內(nèi)生菌[9-10]。該試驗(yàn)采用研磨法分離油茶內(nèi)生菌，僅獲得14株菌株，與從其他一些植物，如馬鈴薯[11]、黃瓜[12]、大豆[13]等植物材料中篩選出100多株菌株相比，篩選的內(nèi)生菌較少，這可能與油茶表面消毒有關(guān)。

該研究表明，根中油茶內(nèi)生菌的種群密度最高，葉中最低，這說明微生物菌群密度與植株部位密切相關(guān)，這與相關(guān)研究[14]結(jié)果一致。內(nèi)生細(xì)菌定殖在宿主植物各種組織和器官的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙中，利用宿主細(xì)胞內(nèi)或分泌到細(xì)胞間隙的分泌物或宿主防御反應(yīng)的產(chǎn)物作為營養(yǎng)物質(zhì)，而這些物質(zhì)的產(chǎn)生與植物的生長部位有很大關(guān)系，這可能是造成同種植物不同部位內(nèi)生菌數(shù)目有較大差異的主要原因。除植物本身外，菌群密度的不同可能還與分離內(nèi)生菌的數(shù)量、滅菌時(shí)間的長短、消毒劑的滲入、培養(yǎng)基的選擇以及細(xì)菌對植物的吸附作用等因素有關(guān)[15]。

植物體內(nèi)存在大量有益的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生菌在植物體中具有多種生物學(xué)功能，能提供植物所需的營養(yǎng)物質(zhì)及某些激素，參與植物的防衛(wèi)功能，促進(jìn)植物快速生長，增強(qiáng)植物抗病、抗逆、抗動(dòng)物危害的能力[16]。該研究從湖南長沙油茶中分離出一株內(nèi)生細(xì)菌，該內(nèi)生細(xì)菌對油茶常見的4種病原菌均有拮抗作用，經(jīng)16S rDNA鑒定該內(nèi)生細(xì)菌屬于枯草芽孢桿菌，16S rDNA相似性為99%。16S rDNA分子約為1 500 bp，只能提供部分基因組信息，所以要確定菌株的分類地位，還應(yīng)結(jié)合胞壁分析、生理生化特征、G+C含量等最終確定[17]。

為了使拮抗菌的拮抗病菌效果更佳，更好地應(yīng)用于生產(chǎn)，筆者將進(jìn)一步探究拮抗菌與病菌的聯(lián)合條件(最適溫度、最適pH、最適拮抗菌濃度等)。

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Screening and Identification of Oil-tea Endophytic Antagonistic Bacteria

JIANG Wei, LIU Xiao-chen, QIU Rong-qun, LUO Qiong*et al

(Department of Biotechnology, Changsha Medical University, Changsha, Hunan 410219)

Abstract[Objective] Through screening out oil-tea endophytic antagonistic bacteria in Changsha, the aim was to provide a theoretical basis for biological control of root rot, leaf blight, anthracnose and soft rot disease. [Method] Using grinding method, endophytic bacteria was isolated from healthy root, stem and leaf of oil-tea. Through plate confrontation test, endophytic bacteria with antagonistic activity against oil-tea root rot, leaf blight, anthrax disease and soft rot disease was screened out, morphological observation and 16S rDNA sequence analysis was conducted. [Result] The quantity of endophytic bacteria in different tissues of oil-tea was root>stem>leaf. Strain J-3-1 had antagonistic activities against root rot, leaf blight, anthrax disease and soft rot disease, the inhibitory zone radius was 12.5, 16.8, 13.5 and 13.4 mm, 16S rDNA similarity was 99%. [Conclusion] By morphological observation and 16S rDNA sequence analysis, it is identified as Bacillus subtilis.

Key wordsOil-tea; Endophytic antagonistic bacteria; Isolation and identification

作者簡介姜微(1994- )，女，湖南湘潭人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，講師，碩士，從事內(nèi)生固氮菌方面的研究。

收稿日期2016-03-07

中圖分類號S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-125-03