甄 濤，陳 薇，沙長(zhǎng)青，張先成，劉新杰，于徳水，*

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；3.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱 150020)

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響應(yīng)面法優(yōu)化大豆根瘤菌HW-05保護(hù)劑配方

甄 濤1，陳 薇2，沙長(zhǎng)青2，張先成1，劉新杰3，于徳水1，3*

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；3.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱 150020)

摘要[目的]采用響應(yīng)面法研究具有根瘤菌保護(hù)作用的蛋白類、鹽類、糖類和微量元素類物質(zhì)。[方法]通過設(shè)置不同種類、組合、配比、濃度的大豆根瘤菌保護(hù)劑配方，在實(shí)驗(yàn)室中模擬實(shí)際應(yīng)用條件，研究具有提高根瘤菌存活率和存活時(shí)間作用的液體保護(hù)劑配方。采用響應(yīng)面法的中心組合試驗(yàn)確定各顯著因子的最佳水平。[結(jié)果]篩選出各類化合物中影響有效活菌數(shù)的顯著因子，即蛋白胨、黃原膠、NaCl優(yōu)化后的各類化合物的終濃度如下：蛋白胨0.13%，黃原膠0.011%，氯化鈉0.30%。[結(jié)論]菌株HW-05在加入保護(hù)劑室溫放置180 d后的有效活菌數(shù)為3.185×108 CFU/mL，與未加入保護(hù)劑優(yōu)化前(2.458×108 CFU/mL)相比存活率提高了25%以上。

關(guān)鍵詞大豆根瘤菌；保護(hù)劑配方；優(yōu)化；響應(yīng)面法

作為我國綠色大豆的主產(chǎn)區(qū)，近年來黑龍江省始終保持266.67萬hm2/a左右的大豆種植面積，農(nóng)墾九三管理局和黑河地區(qū)作為全國非轉(zhuǎn)基因大豆主產(chǎn)區(qū)，多年來始終致力于綠色大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展，先后投入10億多元用于綠色大豆標(biāo)準(zhǔn)化基地建設(shè)，建立非轉(zhuǎn)基因大豆核心示范區(qū)[1-2]。目前，該區(qū)域內(nèi)大豆種植面積在133.33萬hm2以上，年產(chǎn)量在200萬t以上。但是，目前關(guān)于根瘤菌劑的應(yīng)用報(bào)道還很少，僅占播種面積的2%左右，根瘤菌劑的應(yīng)用前景廣闊[3]。保護(hù)劑配方中既有維持微生物滲透壓的鹽類、糖類物質(zhì)，又有刺激菌劑和大豆生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)和微量元素，還有能夠有效成膜、促進(jìn)根瘤菌在大豆表面形成比較優(yōu)勢(shì)的蛋白類物質(zhì)，在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)形成占位優(yōu)勢(shì)，抵抗土著根瘤菌的侵染，增加有效結(jié)瘤數(shù)量，提高接種根瘤菌劑的使用效果。針對(duì)大豆根瘤菌的有效活菌數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降的問題，筆者采用響應(yīng)面法對(duì)大豆根瘤菌HW-05的保護(hù)劑配方進(jìn)行優(yōu)化。

篩選出合適的保護(hù)劑配方，與根瘤菌劑配伍使用，可以提高根瘤菌劑在土壤中的存活率[4]，能在大豆種子表面形成比較優(yōu)勢(shì)，抵抗土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)，減少無效結(jié)瘤數(shù)。筆者采用響應(yīng)面法對(duì)大豆根瘤菌HW-05的保護(hù)劑配方進(jìn)行優(yōu)化，以期為實(shí)現(xiàn)大豆根瘤菌劑的大面積推廣與應(yīng)用，提高黑龍江省大豆產(chǎn)量和品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌種慢生型大豆根瘤菌HW-05，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心保存。

1.2培養(yǎng)基YM培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.1 g，酵母提取物0.4 g，甘露醇10 g，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL。上述培養(yǎng)基的滅菌條件均為濕熱滅菌：121 ℃，20 min，初始pH為6.8～7.0。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1種子活化。取-80 ℃下保存的環(huán)根瘤菌HW-05，接種到裝入5 mL YM液體培養(yǎng)基的試管中，于28 ℃下180 r/min培養(yǎng)3 d。用接種環(huán)將HW-05菌液劃線接種到Y(jié)MA平板上，28 ℃下置于恒溫培養(yǎng)箱中，倒置靜止培養(yǎng)7 d左右，直至出現(xiàn)單菌落為止。然后，再挑取單菌落接種到Y(jié)M液體培養(yǎng)基中，28 ℃180 r/min培養(yǎng)3 d，備用。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)。挑取一環(huán)新鮮的平板種子接種于250 mL的三角瓶中，裝液量為30 mL，28 ℃180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，按2%的接種量接種于500 mL的三角瓶中，裝液量為100 mL，28 ℃180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后分裝到試管中，每支試管內(nèi)分裝10 mL。

1.4活菌計(jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。取100 μL HW-05菌液樣品，加入裝有900 μL無菌水的離心管中，即為10-1稀釋液，再用200 μL移液槍吸取10-1稀釋液100 μL移入裝有900 μL無菌水的離心管中，即為10-2稀釋液，以此類推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋度的菌液，供平板計(jì)數(shù)使用。分別涂布平板，28 ℃下培養(yǎng)7 d后計(jì)數(shù)。

1.5篩選顯著因子采用不同種類、不同配比進(jìn)行單因素、2因素、3因素試驗(yàn)，對(duì)蛋白類、鹽類和糖類3大類(6種化合物)，即牛血清蛋白、蛋白胨、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、NaCl、KCl進(jìn)行全面考察。選擇6因素6水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取6個(gè)水平，使水平呈梯度變化，檢測(cè)各梯度下的有效活菌數(shù)，從而確定最大響應(yīng)面值的區(qū)域，篩選出顯著因子及最佳終濃度，最終篩選組合獲得效果較好的配方。篩選幾種不同種化合物中的顯著因子，對(duì)牛血清蛋白、蛋白胨、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、NaCl和KCl進(jìn)行考察，選擇6因素6水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表 1)。

表1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.6響應(yīng)面分析篩選顯著因子確定了影響HW-05菌株有效活菌數(shù)的3個(gè)主要因子，確定了3個(gè)主要因子響應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理在主要因子的響應(yīng)區(qū)各取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[5-6]。

1.7數(shù)據(jù)處理每個(gè)處理包含3個(gè)平行試驗(yàn)，取均值。采用Minitab 16 軟件完成，Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析由Design-Expert 8.0完成[7]。

2結(jié)果與分析

2.1篩選顯著因子單因素試驗(yàn)是同一批次進(jìn)行的，因此每個(gè)因子的對(duì)照都是相同的，對(duì)照1為在室溫放置180 d后的未添加化合物HW-05的活菌數(shù)為2.429×108CFU/mL；對(duì)照2為新鮮培養(yǎng)基對(duì)數(shù)期的活菌數(shù)為4.235×109CFU/mL。牛血清蛋白在終濃度為0.05%時(shí)活菌數(shù)最高(2.311×108CFU/mL)，蛋白胨在終濃度為0.1%時(shí)活菌數(shù)最高，為2.331×108CFU/mL。黃原膠在終濃度為0.01%時(shí)活菌數(shù)最高(1.910×108CFU/mL)，羧甲基纖維素鈉在終濃度為0.01%時(shí)活菌數(shù)最高(2.219×108CFU/mL)。NaCl在終濃度為0.30%時(shí)活菌數(shù)最高(2.311×108CFU/mL)，KCl在終濃度為0.15%時(shí)活菌數(shù)最高(2.086×108CFU/mL)。2因素試驗(yàn)中蛋白胨+黃原膠的活菌數(shù)為2.530×108CFU/mL，牛血清蛋白+黃原膠為2.465×108CFU/mL。黃原膠+ NaCl為2.72×108CFU/mL個(gè)，牛血清蛋白+NaCl為2.435×108CFU/mL，蛋白胨+ KCl為2.530×108CFU/mL。3因素試驗(yàn)中蛋白胨+黃原膠+ NaCl的活菌數(shù)最高(3.242×108CFU/mL)，蛋白胨+黃原膠+ KCl為3.203×108CFU/mL。由此可以確定蛋白胨、黃原膠、NaCl是顯著因子。

對(duì)3個(gè)組分進(jìn)行分析，各組分分別取高低2個(gè)水平(1和-1)見表2。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)分析確定了顯著因子的最適濃度區(qū)域，以蛋白胨0.1%、黃原膠0.01%和NaCl 0.30%的終濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，各因素代碼和水平設(shè)計(jì)見表3。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在主要的3個(gè)因素的響應(yīng)區(qū)中取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)定3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，以有效活菌數(shù)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)其進(jìn)行多元回歸分析[8]。

表 2　Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析表明，Prob>F小于0.050 0的值表示模型項(xiàng)顯著，大于0.100 0表明模型項(xiàng)不顯著。該模型的一次項(xiàng)中的A，二次項(xiàng)中的A2、B2以及交互作用的AB對(duì)有效活菌數(shù)的影響都是顯著的；回歸模型的P值為0.023 9，表明模型是顯著的，而失擬項(xiàng)的P值為0.080 9，失擬不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.863 2，說明模型達(dá)到較好的擬合程度。經(jīng)分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程：R1=6.33+0.059A+0.035B-0.040C+0.088AB+0.022AC+0.010BC-0.080A2-0.097B2-0.062C2。

為求解該回歸方程的極值點(diǎn)，對(duì)其各自變量分別求一階偏導(dǎo)，得到三元一次方程組，求解出該模型的極值點(diǎn)，從而計(jì)算出對(duì)應(yīng)因素值：蛋白胨0.13%、黃原膠0.011%、NaCl 0.30%，此時(shí)模型的理論最優(yōu)有效活菌數(shù)為3.180×108CFU/mL。

圖1　蛋白胨和黃原膠交互作用對(duì)有效活菌數(shù)影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)Fig.1　The contour (A) and response surface (B) of peptone and xanthan gum interaction effects on the number of effective viable bacteria

圖2　蛋白胨和NaCl交互作用對(duì)有效活菌數(shù)影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)Fig.2　The contour (A) and response surface (B) of peptone and NaCl interaction effects on the number of effective viable bacteria

圖3　黃原膠和NaCl交互作用對(duì)有效活菌數(shù)影響的等高線(A)和響應(yīng)面(B)Fig.3　The contour (A) and response surface (B) of xanthan gum and NaCl interaction effects on the number of effective viable bacteria

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，慢生大豆根瘤菌HW-05有效活菌數(shù)最優(yōu)極值點(diǎn)為終濃度，蛋白胨0.13%、黃原膠0.011%、NaCl 0.30%，預(yù)測(cè)最優(yōu)值為3.180×108CFU/mL。為了驗(yàn)證這一結(jié)果的有效性，按照上述分析結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果(3.185×108CFU/mL)與預(yù)測(cè)值相近，說明了該模型擬合的有效性。

3結(jié)論

筆者從3種化合物中篩選出3個(gè)顯著因子：蛋白胨、黃原膠和NaCl，采用響應(yīng)面分析法的Box-Behnken設(shè)計(jì)確定顯著因子的最優(yōu)配比，最終確定了HW-05保護(hù)劑中各物質(zhì)的終濃度分別為：蛋白胨0.13%、黃原膠0.011%、NaCl 0.30%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為3.185×108CFU/mL，與預(yù)測(cè)值相近，說明了該模型擬合的有效性。常溫條件下放置180 d后根瘤菌劑的存活率，對(duì)照活菌數(shù)為2.458×108CFU/mL，經(jīng)保護(hù)劑作用后4個(gè)配方的活菌數(shù)都在3.1×108CFU/mL以上，存活率與對(duì)照相比提高25%以上，說明經(jīng)篩選后的保護(hù)劑配方可以有效提高根瘤菌的存活率。

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Optimization of Protective Agent Formulation of Rhizobium HW-05 by Response Surface Methodology

ZHEN Tao1, CHEN Wei2, SHA Chang-qing2, YU De-shui1,3*et al

(1. Institute of Microbiology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin, Heilongjiang 150010; 2. Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin, Heilongjiang 150000; 3. Institute of Advanced Technology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin, Heilongjiang 150020)

Abstract[Objective] The response surface methodology was used to study the protective effect of proteins, salts, sugars and trace elements on Rhizobium. [Method] Through setting up different types, combinations, ratios and concentrations of Rhizobium protective agent formulation, simulating actual conditions in laboratory, liquid protective agent formulation with effect of improving survival rate and time of Rhizobium was studied. The optimal level of each significant factor was determined by using central composite experiment of response surface methodology. [Result] The significant factors influencing the number of effective viable bacteria in compounds were obtained, namely peptone, xanthan gum and NaCl; The optimized final concentrations of compounds were: peptone 0.13%, xanthan gum 0.011% and NaCl 0.30%. [Conclusion] The effective viable count of HW-05 strain is 3.185 × 108 CFU/mL after addition of protective agent at room temperature for 180 d, compared with the previous (2.458 × 108 CFU/mL) protective agent is not added, the survival rate is increased by more than 25%.

Key wordsRhizobium; Protective agent formulation; Optimization; Response surface methodology

基金項(xiàng)目黑龍江省科學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介甄濤(1986- )，男，山東泰安人，助理研究員，碩士，從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事生物技術(shù)和微生物學(xué)研究。

收稿日期2016-03-11

中圖分類號(hào)S 501；Q 781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)10-003-03