梁　皓

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白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系研究

梁皓

【摘要】目的 探討白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。方法 選取我院收治的120例冠心病患者作為研究組，120例健康體檢者作為對(duì)照組，收集兩組患者的臨床資料，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法測(cè)定白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑基因（IL-1RN）型，用PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）法分析TNF基因、IL-1B基因多態(tài)性，研究其與冠心病相關(guān)性。結(jié)果兩組IL-1B-31、IL-1RN位點(diǎn)各基因型所占比例對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；IL-1B-511位點(diǎn)研究組T/T型所占比例高于對(duì)照組（P＜0．05），且T/T、C/T基因型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均高于C/C型；TNF-a-863位點(diǎn)研究組C/C型所占比例高于對(duì)照組，C/A型低于對(duì)照組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其中C/A型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高。結(jié)論 IL-1B-511 T/T、TNF-a-863均為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

【關(guān)鍵詞】冠心??；TNF；IL-1；基因；相關(guān)性

作者單位：濮陽(yáng)市人民醫(yī)院胸心外科，河南 濮陽(yáng) 457000

冠心病生理及病理過(guò)程復(fù)雜，目前尚未明確冠心病發(fā)病機(jī)制。大部分研究者認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要病因，炎性反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化中有重要作用，影響斑塊的形成與進(jìn)展［1］。且近年來(lái)，諸多研究均表示部分炎性因子基因位點(diǎn)有其多態(tài)性，可影響細(xì)胞因子的表達(dá)及其生物學(xué)活性，影響冠心病進(jìn)展［2］。為分析IL-1、TNF基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系，我院對(duì)收治的120例患者展開(kāi)了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1資料來(lái)源

選擇我院2013年3月～2015年3月收治的120例冠心病患者作為研究組，均符合世界衛(wèi)生組織通過(guò)的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床、心肌標(biāo)志物、心電圖確診，其中男86例，女34例；年齡≤60歲者86例，＞60歲者34例；有吸煙史52例，有飲酒史34例。選擇同期來(lái)我院體檢的120例健康體檢者作為對(duì)照組，其血脂、血常規(guī)、生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，心電圖檢查無(wú)異常，其中男85例，女35例，年齡≤60歲者87例，＞60歲者33例；有吸煙史46例，有飲酒史30例。兩組基線資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且所有研究對(duì)象均知情研究，自愿簽署研究同意書(shū)，排除合并腎臟、肝臟疾病及內(nèi)分泌疾病者。

1.2方法

收集兩組對(duì)象臨床資料，包括基本資料、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、疾病情況、吸煙飲酒情況等。均清晨空腹采集靜脈血3 ml，抗凝后離心3 min，去血漿，保存于-80℃環(huán)境，提取人基因組。低溫冰箱取標(biāo)本，室溫融化，混合均勻后取200 μl～1.5 ml置于EP管內(nèi)，加0.8 ml PBS緩沖液，離心5 min，去上清，沉淀后加TE 440 μl，10％SDS 60 μl，蛋白酶K 3 μl，37℃水浴，過(guò)夜，加1/3體積NaCl，均勻振蕩，離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另側(cè)EP管內(nèi)，加等體積飽和酚，混合均勻，離心10 min，上清液移至另EP管，加等體積氯仿，混合均勻，離心10 min，上清液移至另EP管內(nèi)，加1/10等體積3 M NaAC，2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，沉淀1 h，放于-20℃冰箱，離心10 min，棄上清，75％乙醇洗滌2次，室溫條件下干燥10 min，加TE緩沖液50 μl，-20℃冷藏備用。采用PCR法測(cè)定IL-1RN基因型。PCR反應(yīng)條件：IL-1B-31基因，預(yù)變性溫度94℃，時(shí)間5 min，變形溫度94℃，時(shí)間5 min，退火溫度51℃，時(shí)間1 min，延伸溫度72℃，時(shí)間1 min，循環(huán)數(shù)35，延伸72℃，時(shí)間10 min；其余各基因，預(yù)變、變性、延伸溫度及時(shí)間與IL-1B-31基因一致，IL-1B-511基因退火溫度54℃，時(shí)間1 min，循環(huán)數(shù)33；IL-1RN基因退火溫度58℃，時(shí)間1 min，循環(huán)數(shù)35；TNF-a-863基因退火溫度59℃，時(shí)間1 min，循環(huán)數(shù)30。用PCR-RFLP法測(cè)定TNF基因、IL-1B基因多態(tài)性。步驟：滅菌0.5 ml EP管內(nèi)加7.6 μl雙蒸水，加10×RELP緩沖液2 μl，加RELP 0.4 μl，加PCR產(chǎn)物10 μl，離心，混合均勻，37℃水浴6 h，65℃加熱，10 min后終止，采用1％凝膠電泳瓊脂糖檢測(cè)人基因組DNA，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增物，3％脂糖凝膠電泳檢測(cè)IL-1基因擴(kuò)增片段酶切產(chǎn)物，非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)TNF-a-863基因擴(kuò)增片段酶切產(chǎn)物。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析風(fēng)險(xiǎn)因素OR值與95％可信區(qū)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1IL-1各基因及TNF基因型在兩組分布對(duì)比

IL-1B-31位點(diǎn)共有C/C、C/T、T/T三種基因型，兩組各基因型所占比例對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C/T型、T/T基因型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于C/C型；IL-1B-511位點(diǎn)共有C/C、C/T、T/T三種基因型，研究組T/T型所占比例高于對(duì)照組（P＜0.05），且T/T、C/T基因型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均高于C/C型；IL-1RN位點(diǎn)共有Ⅰ/Ⅰ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅰ/Ⅲ、Ⅰ/Ⅳ、Ⅱ/Ⅱ五種基因型，兩組各基因型分布對(duì)比無(wú)差異（P＞0.05），其中以Ⅱ/Ⅱ基因型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高；TNF-a-863位點(diǎn)共有C/C、C/A、A/A三種基因型，研究組C/C型所占比例高于對(duì)照組，C/A型低于對(duì)照組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中C/A型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高，見(jiàn)表1。

表1　IL-1各基因及TNF基因型在兩組分布對(duì)比［例（％）］

2.2IL-1、TNF基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系多因素Logistic回歸分析

多因素回歸分析顯示，IL-1B-511 T/T、TNF-a-863均為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，前者危險(xiǎn)度更高，見(jiàn)表2。

表2　IL-1、TNF基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系多因素Logistic回歸分析

3　討論

冠心病由冠脈粥樣硬化堵塞血管腔引起，造成心臟缺氧缺血性壞死。近年來(lái)，其發(fā)病率逐年上升，并取代傳染性疾病成為發(fā)展中國(guó)家死亡及發(fā)病的重要原因。冠心病發(fā)病原因復(fù)雜，與環(huán)境、基因等因素均有聯(lián)系，其中炎性因子、細(xì)胞因子及其調(diào)控在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及進(jìn)展中有關(guān)鍵作用。李漢成［3］等表示，炎性因子活化、炎癥反應(yīng)均為造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的相關(guān)原因。上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞介導(dǎo)激活，釋放大量化學(xué)因子、生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子，引起脂質(zhì)聚集，加重動(dòng)脈粥樣硬化損傷。

最近幾年來(lái)，炎性因子在冠心病動(dòng)脈粥樣硬化中的作用引起了較多研究者的關(guān)注。王藝霏［4］等指出，動(dòng)脈粥樣硬化處發(fā)生炎性反應(yīng)是其對(duì)動(dòng)脈損傷的保護(hù)性反應(yīng)。此類(lèi)炎性反應(yīng)可釋放白介素、腫瘤壞死因子、粘附分子、C-反應(yīng)蛋白等因子，影響斑塊的形成及穩(wěn)定性。IL-1為多肽物質(zhì)，有廣泛生物學(xué)活性，在機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞激活、增殖及分化過(guò)程。在感染性冠心病損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)中，前炎性因子IL-1家族在介導(dǎo)炎癥所致血管內(nèi)皮損傷及修復(fù)過(guò)程中有關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)水平的變化不僅可反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)可作為血管內(nèi)皮感染判定的重要參照指標(biāo)。

IL-1因子由IL-1a、IL-1β及IL-1Ra組成，基因編碼分別為IL-1A、IL-1B與IL-1RN。較多研究均證實(shí)，IL-1因子與心血管疾病發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)，在炎癥及免疫調(diào)節(jié)中有重要作用［5］。其中IL-1β為前炎癥免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，可活化巨噬細(xì)胞，擴(kuò)張血管，參與脂蛋白代謝，增加血管通透性。IL-1Ra則為內(nèi)源性拮抗劑，可抑制IL-1β因子的促炎性作用，同時(shí)可調(diào)節(jié)CRP上游因子。黃山［6］等研究表示，IL-1A啟動(dòng)子區(qū)-889位點(diǎn)，IL-1B啟動(dòng)子區(qū)-511位點(diǎn)等均可能因C-T轉(zhuǎn)換發(fā)生突變，影響IL-1成分表達(dá)，影響冠心病進(jìn)展。TNF則為人體內(nèi)又一促炎細(xì)胞因子，生物學(xué)活性廣，經(jīng)單核、巨噬細(xì)胞分泌，可參與動(dòng)脈粥樣斑塊炎性反應(yīng)，同時(shí)可提高血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，加重血管損傷，促進(jìn)原癌基因轉(zhuǎn)錄，并抑制脂蛋白酶活性，加重動(dòng)脈粥樣硬化。Onat A［7］等表示，TNF-a表達(dá)影響TNF基因多態(tài)性，TNF-a基因多態(tài)點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)域-863、-857、-163、-308等位點(diǎn)，均可能影響TNF基因轉(zhuǎn)錄，攜帶TNF-a-238A基因患者冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1B-511位點(diǎn)上有三種基因分型，冠心病組T/T基因型所占比例高于對(duì)照組，以C/C型為參照，T/T型冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高；IL-1B-31、IL-1RN基因型在冠心病與正常人分布較一致；而冠心病患者C等位基因較多，A等位基因相對(duì)較少，未攜帶-863A基因型人群患冠心病風(fēng)險(xiǎn)可能增加1.7倍，多元回歸分析結(jié)果顯示，攜帶C等位基因的TNF-a-863基因型患者冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。由此可知，IL-1B-511 T/T與TNF-a-863基因型為冠心病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

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Relationship Between Interleukin-1， Tumor Necrosis Factor Gene Polymorphism and Coronary Heart Disease

LIANG Hao Thoracic and Cardiac Surgery， The people′s hospital of Puyang， Puyang He’nan 457000， China

［Abstract］Objective To investigate the relationship between interleukin-1 （IL-1）， tumor necrosis factor （TNF） gene polymorphism and coronary heart disease. Methods 120 cases of patients with coronary heart disease in our hospital were included in the study group. 120 healthy subjects were included in the control group. The clinical data of two groups were collected. Polymerase chain reaction （PCR） method was used for the determination of interleukin-1 receptor antagonist gene （IL-1RN ） type. Restriction fragment length polymorphism （RFLP） method was used to analyze TNF gene and IL-1B gene polymorphism. The correlation with coronary heart disease was studied. Results There was no difference in the proportions of IL-1B-31 and IL-1RN loci between different genotypes （P＞0.05）. The proportion of IL-1B-511 loci of T/T genotype in the study group was higher than that in the control group （P＜0.05）， and the risk for coronary heart disease of T/T and C/T genotype was higher than that of C/C genotype. The proportion of TNF-a-863 loci of C/C genotype in the study group type was higher than that in the control group， while that of C/ A genotype was lower than that in the control group （P＜0.05）. The risk for coronary heart disease of C/A genotype was the highest. Conclusion IL-1B-511 T/T and TNF-a-863 are the independent risk factors for coronary heart disease.

［Key words］Coronary heart disease， TNF， IL-1， Gene， Correlation

【中圖分類(lèi)號(hào)】R541

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）12-0025-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．12．016