林章萍，陳能海，崔 波，呂海林，翁澤斌，劉 泓

隨著現(xiàn)代石化和交通運輸業(yè)的快速發(fā)展，以及工業(yè)三廢和生活垃圾的大量排放，環(huán)境中的有機物污染問題日益突出，其中多環(huán)芳烴(PAHs)對環(huán)境的污染是世界各國所面臨的重大環(huán)境與公共健康問題之一，其對土壤的污染問題尤為突出［1］。進入土壤中的PAHs一方面可通過皮膚、口腔直接進入人體，另一方面可被植物和動物吸收，通過食物鏈危及人類健康［2］。研究表明，PAHs容易導致農作物減產、作物品質下降等［3］。因此，關于 PAHs的研究一直倍受環(huán)境界的關注。菲作為分布較廣的三環(huán)多環(huán)芳烴，因其結構簡單獨特，毒性較強，常被用作研究多環(huán)芳烴污染的模式污染物。而在2000年對擬南芥完成了全基因組測序后，以其生長周期短，對脅迫敏感等分子生物學及遺傳學特性成為植物科學研究的首選模式植物，但植物響應多環(huán)芳烴污染脅迫的機制并不清楚［4－5］。早期的蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在菲的脅迫下，有53個蛋白質差異表達，鑒定出30個差異表達蛋白［6］。本研究在此基礎上，篩選出信號傳導、甲基化、糖分解代謝、活性氧、植物防御、氨基酸代謝等相關功能編碼基因，擬通過分析在不同時間菲脅迫下這些差異表達蛋白編碼基因的轉錄水平表達，為揭示植物對多環(huán)芳烴的應答機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

根據ALKIO等［7］的試驗結果，以擬南芥在菲脅迫下的敏感濃度1 mmol·L－1進行早期應激響應試驗。將菲(分析純，Sigma)溶解于甲醇，配制成100 mmol·L－1的菲甲醇儲備液，吸取適當體積的儲備液迅速加入到已滅菌配制好的熱MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基中，得到 1 mmol·L－1的菲脅迫培養(yǎng)基，混合均勻后倒板，待其冷卻后，將在正常MS培養(yǎng)基中生長18 d的擬南芥Co1.4生態(tài)型幼苗移入菲脅迫培養(yǎng)基中，在(23±1)℃ 、16 h/8 h 的光照/黑暗、光照度(30 ±2)pmol·m－2·s－1的培養(yǎng)箱中脅迫培養(yǎng)，經 12，24，36，48，72 h 脅迫后分別取對照和1 mmol·L－1菲脅迫處理的擬南芥葉片，測定生理指標及目的基因RNA表達水平的差異。試驗3次重復，方差分析(ANOVA)采用SPSS軟件進行。

1.2 實時熒光定量測試

用primer premier 5.0設計各基因相應引物如表1。

表1 基因的引物序列Table 1 The primer sequence of gene

各cDNA樣品分別用上述引物進行定量PCR反應。反應體系(表2)為20 μL。

表2 定量PCR反應體系Table 2 The reaction system of quantitative PCR

反應條件如下:95℃ 10 s預變性，然后46次循環(huán):95℃ 5 s，61.5℃ (At3g16420) 或 63.0℃(其他基因)20 s。融解曲線:63－95℃ 每0.5℃?zhèn)€溫度梯度讀板1次生成融解曲線，讀板時間為2 s，每 個 樣 品 設 3 管 重 復。用 內 標 Actin7(At5g09810)進行標準化，計算各處理與對照間的Ct差值，用公式A=(1+X)△C(T)計算基因表達的變化倍數。其中A表示表達改變倍數，X表示PCR擴增效率。

2 結果與分析

2.1 甲基化酶類蛋白基因表達變化分析

氨甲基轉移酶(At1g11860)也稱甘氨酸分裂T－蛋白質，分布在線粒體，參與甘氨酸分解代謝、新陳代謝的退化，是脫氫酶的前體［8－11］。蛋氨酸合成酶(At5g17920)是以N5－甲基四氫葉酸作為輔酶，將甲基轉移到高胱氨酸的巰基上而生成蛋氨酸。該酶起到中間甲基載體的功能，是體內主要甲基供體［12－13］。而四氫葉酸合成酶(At1g50480)定位在線粒體，參與核苷酸結合、嘌呤核苷酸生物合成、氨基酸生物合成、蛋氨酸生物合成、組氨酸生物合成、一碳化合物代謝及甲酸和衍生物生物合成。這三者都與植物生物大分子甲基化這一生理功能密切相關。如圖1所示，這3個基因都在24 h時有1個表達高峰，分別顯著上調了2.37、1.78 及6.41 倍，其中蛋氨酸合成酶(At5g17920)基因在脅迫48 h時又有1個小的表達高峰。這說明PAHs(菲)脅迫過程中植物確實通過中間甲基載體的功能，進行了胞嘧啶甲基化或去甲基化來調控相關基因的表達或沉默，以積極地響應及防御PAHs(菲)脅迫。

2.2 活性氧相關蛋白基因表達變化分析

過氧化物氧化還原蛋白(At1g65980、At3g52960)屬于過氧化物酶家族，廣泛分布于細菌、動物及植物中，參與還原H2O2的抗氧化作用，應答氧化壓力以及調節(jié)由H2O2介導的信號轉換，并對被活性氧損傷了的蛋白質分子起修復作用，參與調節(jié)細胞凋亡過程［14-17］。谷胱甘肽硫轉移酶(At2g47730)和谷胱甘肽還原酶(At3g54660)在許多組織中都有分布，前者可以催化某些內源性或外來有害物質的親電子基團與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細胞膜，分解后排出體外［18］;后者可以通過維持細胞內充足的還原型谷胱甘肽(GSH)水平來清除自由基和一些有機過氧化物，或作為谷胱甘肽氧化酶的底物來清除一些過氧化物［19］。

圖1 菲脅迫對甲基化酶類蛋白基因表達的影響Fig.1 Effect of phenanthrene stress on expression of genes related to methylation

過氧化物氧化還原蛋白(At1g-65980)、谷胱甘肽硫轉移酶(At2g47730)和谷胱甘肽還原酶(At3g54660)的編碼基因在受到菲脅迫24 h時都有1個高峰表達，如圖2所示。分別上調了2.19、7.0和2.93倍。其中谷胱甘肽硫轉移酶(At2g47730)基因在脅迫時間48 h甚至還有1個2次的最高峰表達。顯示出擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)(生物抗氧化劑)及防衛(wèi)蛋白協(xié)同響應，積極清除體內過量的H2O2，以避免細胞氧化損傷，同時也可能激活了ROS信號轉導通路。而另一個過氧化物氧化還原蛋白(At3g52960)基因則在一開始就受到顯著抑制，到脅迫72 h時，其表達量為對照的11%。

圖2 菲脅迫對活性氧相關蛋白基因表達的影響Fig.2 Effect of phenanthrene stress on expression of genes related to ROS

2.3 糖分解代謝蛋白基因表達變化分析

碳酸酐酶(At3g01500)是一種含鋅金屬酶，具有可逆地催化CO2(碳酸酐)水合反應，迅速進行及加速生物體靜脈中 CO2運送的生理功能［8，20］。二氫硫辛酸脫氫酶(At1g48030)屬于丙酮酸脫氫酶系，定位在線粒體，參與電子傳遞［21］。果糖二磷酸醛縮酶(At3g52930、At2g36460)參與果糖代謝及糖酵解。蘋果酸脫氫酶(At1g04410)廣泛分布在生物體內，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體及細胞漿內，為三羧酸循環(huán)中的1種酶［22］。

2個果糖二磷酸醛縮酶(At3g-52930、At2g36460)和蘋果酸脫氫酶(At1g04410)在開始脅迫12 h時受到略微的表達抑制，如圖3所示，然后再到24 h時出現(xiàn)表達高峰，表達量分別上調了3.82、7.78 和 1.89 倍。而碳酸酐酶(At3g01500)和二氫硫辛酸脫氫酶(At1g48030)從始至終都被抑制表達，最后72 h時表達量分別下調到對照的3%和11%。

圖3 菲脅迫對糖分解代謝蛋白基因表達的影響Fig.3 Effect of phenanthrene stress on expression of genes related to catabolism of carbohydrate

2.4 氨基酸代謝相關酶蛋白編碼基因表達變化分析

天冬氨酸氨基轉移酶 (At5g19550、At2g30970)參與植物體內的氨基酸代謝，催化草酰乙酸合成天冬氨酸，且催化天冬氨酸與α－酮戊二酸之間的氨基移換反應［23－24］。

受到脅迫12 h時，天冬氨酸氨基轉移酶(At5g19550、At2g30970)出現(xiàn)上升表達，如圖4所示，其中At2g30970基因在脅迫24 h有1個表達高峰，表達量達到2.92倍，而At5g19550基因則在48 h時再次出現(xiàn)表達高峰，表達量為1.65倍。這反映出一開始受到脅迫時植物通過加速氨基酸的合成來抵抗菲脅迫，但隨著脅迫時間的延長，氨基酸的合成受到影響，氨基轉移酶基因部分表達受到抑制，部分再次上調通過氨基轉化作用合成新的氨基酸。

圖4 菲脅迫對氨基酸代謝相關酶基因表達的影響Fig.4 Effect of phenanthrene stress on expression of genes related to amino acid metabolism

2.5 信號傳導蛋白編碼基因表達變化分析

核苷二磷酸激酶屬于多功能家族高保守性蛋白，定位在線粒體的膜間隙，參與核苷酸代謝、核苷三磷酸生物合成［24］。而鳥嘌呤核苷酸結合蛋白具有水解GTP生成GDP的能力，具有GTP酶的特性，歸屬于G蛋白超家族，主要分布在質膜內側，具有信號轉導因子活性，參與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號轉導、細胞內信號轉導級聯(lián)［25］。

蛋白核苷二磷酸激酶(At4g11010)的表達有顯著差異，如圖5所示，脅迫24 h時，蛋白核苷二磷酸激酶的表達量上調4.20倍，達最大值，36 h時則恢復到正常表達水平。與此同時，G蛋白(At1g18080)的表達量在脅迫72 h內卻呈現(xiàn)出緩慢相對下降的趨勢，脅迫72 h時，表達量下調到對照的26%。

圖5 菲脅迫對信號傳導蛋白編碼基因表達的影響Fig.5 Effect of phenanthrene stress on expression of genes encoding signal transducted proteins

2.6 植物防御蛋白編碼基因表達變化分析

氰酸鹽裂解酶參與氰酸鹽代謝過程，具有氰酸鹽水解酶的活性。當植物細胞受到損害時，硫氰酸鹽一黑芥子酶系統(tǒng)就會被激活，在黑芥子酶水解下形成毒性不一的次生代謝產物如硫氰酸、異硫氰酸等［26-27］。而凝集素則在植物遭受病蟲害入侵時以共價鍵的方式與細胞表面特定的糖類分子結合，導致細胞的凝聚［28-29］。

PAHs(菲)脅迫過程中4個植物防御蛋白:氰酸鹽裂解酶(At3g23490)，兩個黑芥子硫苷酸酶相關蛋白(At1g54010，At3g14210)及凝集素(At3g16420)的編碼基因表達量都顯示出不同程度的上調，如圖 6所示，分別上調了 5.51、4.81、5.42及3.92倍，隨著脅迫時間的延長，表達量變化不一，說明植物啟動了應對脅迫和傷害的誘導性系統(tǒng)抗性的自我保護機制;同時，也說明了植物防御系統(tǒng)的通用性，即對于外界的脅迫(包括生物的與非生物的)植物均啟動了此類基因的表達，以應對環(huán)境的危害。

圖6 菲脅迫對植物防衛(wèi)蛋白編碼基因表達的影響Fig.6 Effect of phenanthrene stress on expression of genes encoding plant defense－related proteins

3 討論

通過對6類功能蛋白基因的定量PCR分析，得到了在多環(huán)芳烴菲脅迫下的轉錄水平表達數據。不同時間菲脅迫下，鑒定的20個差異表達蛋白質基因在轉錄水平上的表達都呈現(xiàn)出顯著的差異。其中16個蛋白質基因在脅迫過程中表現(xiàn)出上調趨勢，且表達水平在脅迫24 h時達到峰值，反映出菲脅迫24 h時植物RNA水平的響應達到高峰，而后隨著脅迫時間的延長，表達量不同程度下降。

菲脅迫過程中，擬南芥2個參與信號轉導的蛋白鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白，At1g18080)及核苷二磷酸激酶(NDPK，At4g11010)被誘導表達或上調。植物體中，NDPK參與高溫脅迫、光敏色素反應、ROS及 UV －B 信號轉導等［6，30］。而擬南芥通過G蛋白這個細胞信號轉導系統(tǒng)的重要開關分子，把信息從胞外傳遞到胞內，使細胞產生防御反應。所以菲脅迫下植物可能通過NDPK表達上調來放大G蛋白信號，引發(fā)氧爆發(fā)，從而激活體內MAPK信號途徑及活性氧信號途徑［31］，由此使得過氧化物氧化還原蛋白(At1g65980)、谷胱甘肽硫轉移酶(At2g47730)和谷胱甘肽還原酶(At3g54660)3個活性氧代謝相關基因表達上調，進一步激活其他防衛(wèi)反應相關蛋白的表達。

糖分解代謝、甲基化酶類及氨基酸合成等代謝相關基因的表達量在脅迫24 h時表現(xiàn)出顯著的峰值，蛋白水平差異表達的結果也都顯示出上調，反映出植物在菲脅迫過程中通過加快CO2的運送，加速丙酮酸轉化成乙酰輔酶A來促進三羧酸循環(huán)以釋放更多的能量，加速氨基酸的合成，以及同時通過中間甲基載體的功能，進行了胞嘧啶甲基化或去甲基化來調控相關基因的表達或沉默來積極響應和防御菲脅迫。

活性氧相關蛋白、植物防御蛋白等都屬于植物防衛(wèi)相關的功能蛋白。在長期的進化過程中，植物至少形成了2套生化防御系統(tǒng)以抵御來自外界的傷害。即由病原菌侵染而引發(fā)的系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)和由昆蟲取食和機械損傷誘導產生的誘導性系統(tǒng)抗性(Induced Systemic Resistance，ISR)［32］。菲脅迫過程中擬南芥氰酸鹽裂解酶表達下調;2個黑芥子硫苷酸酶相關蛋白及推定的凝集素表達上調，顯示出植物通過激活硫氰酸鹽一黑芥子酶系統(tǒng)，減少對氰酸鹽的分解，同時促進細胞凝集，啟動了植物應對脅迫和傷害的誘導性系統(tǒng)抗性(ISR)的自我保護機制。而這些植物防衛(wèi)相關蛋白的表達量除了在脅迫24 h時響應達到峰值外，隨著時間的延長，脅迫48 h時62.5%的防衛(wèi)相關基因表現(xiàn)出第2個響應高峰，這反映出擬南芥抗氧化酶系統(tǒng)、非酶系統(tǒng)及防衛(wèi)蛋白協(xié)同響應，積極清除體內過量的H2O2，避免細胞氧化損傷，同時植物也啟動對自身傷害最小卻又最為有效的自我保護機制。

同時，鑒定的20個基因中活性氧相關基因(At3g52960)和糖分解代謝相關基因(At1g48030)的表達則從12 h到72 h都受到抑制，與蛋白水平差異表達結果不一致。這表明，即使同一功能類型中的各個基因在響應PAHs(菲)脅迫過程中參與程度不同，轉錄水平表達也會有差異，而這有待進一步探索研究。

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