張 坤，張 恒，于志明，陳銳博，鄭振宇，李春麗

實時熒光定量PCR已成為分析基因表達(dá)水平的常用方法，該方法具有靈敏度高、操作簡便，重復(fù)性好等優(yōu)點［1］。在實際研究中，基因表達(dá)的分析結(jié)果易受很多因素的影響，通常需要內(nèi)參基因進(jìn)行校正，以得到均一化的結(jié)果。常用的內(nèi)參基因一般為管家基因(Houseking genes)。理想的管家基因應(yīng)該在不同組織、不同細(xì)胞、不同時間階段及其不同實驗條件下，都能穩(wěn)定表達(dá)的基因。研究表明，目前沒有一種管家基因可以在任何條件下都表達(dá)恒定，在不同的組織中或者不同條件下，其表達(dá)是有變化的［2－3］。以不同的管家基因作為內(nèi)參會得到完全不同的結(jié)果，表達(dá)量會相差幾倍，幾十倍，甚至高達(dá)上百倍［4－6］。盲目地選擇一個管家基因做內(nèi)參，甚至可能得出錯誤的結(jié)論［7－9］。因此，利用RT-qPCR技術(shù)來研究基因表達(dá)時，需要根據(jù)試驗對象及條件選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正分析，以得到相對真實可信的結(jié)果。對于在不同條件下內(nèi)參基因的篩選已經(jīng)有很多報道，但是多集中在植物和動物方面，對微生物，尤其是大腸桿菌內(nèi)參基因的報道較少［10－12］。大腸桿菌是引起人類和動物感染和食物中毒最常見的病原菌之一，大腸桿菌引起的疾病如仔豬的黃白痢等長期困擾著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并且其抗藥性越來越嚴(yán)重，使得本來可以醫(yī)治的疾病變得無藥可醫(yī)。豬的發(fā)病率、死亡率居高不下，極大地制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時，也嚴(yán)重地威脅著人類的健康［13－15］。防御素是生物體內(nèi)自身分泌產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈抗菌作用的多肽，并且具有分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、無免疫原性、無任何藥物殘留等優(yōu)點。豬自身分泌的防御素約10多種。其中，豬β防御素2(pBD2)對細(xì)菌具有較強(qiáng)的殺滅作用，與其它發(fā)現(xiàn)的豬防御素相比，其抗菌活性高，細(xì)胞毒性小，在豬病防治中具有重要意義［16－18］。作者在分析大腸桿菌與pBD2共培養(yǎng)后差異表達(dá)的基因時，為了保證試驗數(shù)據(jù)的正確可靠，根據(jù)已有的報道［10－12］，在大腸桿菌中選用了6個管家基因作為候選的內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR技術(shù)研究大腸桿菌在不同濃度pBD2脅迫下，各個基因表達(dá)的穩(wěn)定性，為后續(xù)進(jìn)行大腸桿菌與pBD2共培養(yǎng)前后差異表達(dá)的基因分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌ATCC 25922購買于北京普通微生物菌株儲存中心。

1.2 方法

1.2.1 豬β防御素2的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 在實驗室前期構(gòu)建的BL-pET-pBD2工程菌株的基礎(chǔ)上，按照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化。純化的蛋白采用BCA試劑盒(康為世紀(jì)生物有限公司)進(jìn)行濃度的測定。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 將大腸桿菌劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于20 mL液體培養(yǎng)基中，220 r·min－1，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，取出1 mL菌液加入到含有200 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)2～3 h，測定調(diào)整其光吸收值OD600為1，使菌體的濃度達(dá)到109cfu·mL－1。

1.2.3 細(xì)菌與蛋白共培養(yǎng) 將1 mL質(zhì)量濃度為0，37.5，75，150 mg·L－1純化后的 pBD2 溶液分別與1 mL109cfu· mL－1的大腸桿菌在37℃震蕩培養(yǎng)1 h或者4 h。然后12 000 g離心5 min，取菌體沉淀進(jìn)行RNA提取。

1.2.4 總 RNA提取 按照文獻(xiàn)［19］進(jìn)行細(xì)菌RNA的提取并略作修改。將菌體沉淀懸浮于1 mL 15 mmol·L－1Tris-HCl 溶液中(pH 8.0，含 0.45 mol·L－1蔗糖，8 mmol·L－1EDTA，2 mg·mL－1溶菌酶)，2℃下作用40 min。5 900 g離心5 min，收集菌體，而后懸浮于 100 μL 80 mmol·L－1Tris.HCl緩沖液中(pH 7.5，含 10 mmol·L－1MgCl2，和10 mmol·L－1β － 巰基乙醇)，再補(bǔ)充225 μL 混合液(0.5%SDS，0.23 mg·mL－1蛋白酶 K，10 mmol·L－1EDTA，0.2 mg·mL－1肝素)，在 37 ℃ 孵育 20 min。再加入飽和氯化鈉溶液160 μL，混勻后冰浴l0 min。10000 g離心l0 min，然后小心將上清液轉(zhuǎn)移入新的1.5 mL離心管中，每管加l mL無水乙醇，－20℃過夜沉淀RNA。之后用l mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀。等沉淀基本干燥后，用適量DEPC處理水溶解。

1.2.5 RNA的純化 提取的總 RNA 20～50 μg用2 μL DNAaseⅠ(5 U·μL－1，Taka公司)，于37℃孵育 20 ～30 min 后(終體積50 μL)，加入50 μL DEPC水和100 μL混合液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，12 000 g 離心5 min，取上清液，再加入10 μL 3 mol·L－1的乙酸鈉溶液 (pH 5.2) 和 250 μL無水乙醇，冰上放置10 min。12 000 g離心5 min，而后70%的乙醇(DEPC水配置)洗脫沉淀，晾干后，加入適量DEPC水溶解RNA，放于－70℃冰箱保存待用。利用微量紫外分光光度計測量RNA的濃度和比值(Nanodrop ND 2000，Thermo Scientific公司)，取2 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計 根據(jù)相關(guān)報道［10－12］，本試驗選用大腸桿菌的 6 個管家基因(recA，aspC，ldh，gapdh，mdh，16S rRNA)作為候選的內(nèi)參基因，設(shè)計的引物序列分別見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.7 cDNA合成和實時熒光定量 PCR 參考PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反應(yīng)體系和反應(yīng)條件合成cDNA，RT-qPCR反應(yīng)體系參照熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行，以 2 μL的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex Taq(2 × )10 μL，模板 cDNA 0.2 μL，上、下游引物各 0.8 μL，加三蒸水 8.2 μL，終體積20 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)。每個樣本做3個平行，經(jīng)Roche LightCycler?96的軟件分析得到各樣本的循環(huán)閥值(Ct值)。引物擴(kuò)增效率分析時，對cDNA進(jìn)行梯度稀釋(10倍，100倍，1000倍等)，選擇5個質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行熒光定量分析，將它們的Ct值制成線性方程，得出斜率，根據(jù)E=10(－1/slope)－1計算其擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率在90%～110%符合引物擴(kuò)增的要求。

表1 大腸桿菌候選內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Primer sequences of candidate reference genes of E.coli

1.2.8 用GeNorm軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 首先找到RT-qPCR中每個基因各樣本中最低的循環(huán)閾值Ct值(表達(dá)量最高)，所有該基因的其他樣本Ct值減去最低Ct值計算得到△Ct，此基因中最高表達(dá)水平的樣本表達(dá)量定為1，其他每個樣本相對于最高表達(dá)水平樣本的相對表達(dá)量為2－△Ct，通過GeNorm軟件分析基因的穩(wěn)定性，以M值表示。M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 pBD2的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

按照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行pBD2的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化，純化的蛋白如圖1所示。圖1顯示，pBD2蛋白純度較高。經(jīng)BCA濃度檢測，其質(zhì)量濃度為352 mg·L－1，用PB緩沖液調(diào)整終質(zhì)量濃度分別為0、37.5、75、150 mg·L－1。

2.2 RNA濃度測定及質(zhì)量鑒定

將1 mL不同質(zhì)量濃度的pBD2溶液與1mL 109cfu·mL－1的大腸桿菌于37℃共培養(yǎng)，在1 h和4 h取樣進(jìn)行RNA提取。純化后的RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，所測樣品的 OD260/OD280都在2.1左右，表明RNA的純度較好，1%瓊脂糖電泳分析提取的大腸桿菌的RNA，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示提取的RNA完整性較好，可以滿足后續(xù)的實驗。

圖1 SDS-PAGE電泳純化的pBD2蛋白Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified pBD2

圖2 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Electrophoresis of total RNA

2.3 內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率及其特異性分析

通過對cDNA的稀釋進(jìn)行每個引物的擴(kuò)增效率分析，得到的結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，擴(kuò)增效率為92% ～107%，符合熒光定量RCR對擴(kuò)增效率的要求。并且大腸桿菌在不同樣本中實時熒光定量的結(jié)果如圖3所示，所有基因的溶解都是單一峰，沒有非特異性條帶和引物二聚體，其特異性良好。

表2 大腸桿菌候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率參數(shù)Table 2 Parameters of candidate reference genes of E.coli by real-time PCR

圖3 候選內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.3 Melting curve of candidate reference genes

2.4 候選內(nèi)參基因在不同處理中的Ct值

所有內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)量如圖4所示。從圖4可以看到，大腸桿菌的6個內(nèi)參基因，除了16S rRNA的Ct值比較低之外，其他基因的Ct值基本介于15～30之間，說明基因的熒光定量的結(jié)果相對準(zhǔn)確。

圖4 候選內(nèi)參基因的Ct值Fig.4 Ct value of candidate reference genes

2.5 GeNorm程序分析大腸桿菌內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

為篩選合適的內(nèi)參基因，通過GeNorm軟件分析內(nèi)參基因的M值，結(jié)果如圖5所示，M值都小于程序所推薦的臨界值1.5，穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定性的相對順序為recA(0.706)﹥aspC(0.732)﹥gapdh(0.768) ＞ 16S rRNA(0.815)﹥ ldh(1.152)﹥mdh(1.266)，最穩(wěn)定的是 recA，其次是 aspC和gapdh。

圖5 GeNorm軟件分析各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M值Fig.5 Expression stability M value of candidate reference genes by GeNorm software

2.6 候選內(nèi)參基因的相對表達(dá)量

計算各個候選的內(nèi)參基因在不同處理時的Ct平均值，以最大的Ct為1，采用△△Ct法對基因進(jìn)行相對定量。候選內(nèi)參基因的相對表達(dá)量的對數(shù)值如圖6所示，從圖6可以看到，16S rRNA的相對表達(dá)量最高，其次是mdh，而ldh的表達(dá)量最低。

圖6 候選內(nèi)參基因相對表達(dá)量的對數(shù)值Fig.6 The logarithmic relative expression of candidate reference genes

3 討論

實時熒光定量PCR的特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，已成為分析基因表達(dá)的一種常規(guī)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域。內(nèi)參基因的選擇往往是試驗成敗的關(guān)鍵所在。如何正確地選擇內(nèi)參基因，與所研究的試驗對象和條件密切相關(guān)，不同的試驗情況往往需要不同的內(nèi)參基因。本研究選擇了6個大腸桿菌的管家基因作為候選內(nèi)參基因，為了保證所設(shè)計的引物正確可靠，在設(shè)計完引物后又通過NCBI進(jìn)行搜索，以確保引物的特異性，通過對引物擴(kuò)增效率的分析也可知，所設(shè)計的引物滿足了試驗的要求。

RNA的質(zhì)量對于熒光定量的分析至關(guān)重要，并且保證所提取細(xì)菌RNA具有poly(A)尾巴也是進(jìn)行熒光定量的前提，細(xì)菌都有比真核生物mRNA短得多的poly(A)，并且容易降解，并且采用傳統(tǒng)的酚提取，會使poly(A)尾巴減少［19］，所以本試驗所取的大腸桿菌都處于對數(shù)生長期，并且不采用傳統(tǒng)的飽和酚提取，都是為了保證所提取的RNA具有poly(A)的尾巴，以保證后續(xù)實驗的進(jìn)行。結(jié)果顯示所提取的RNA質(zhì)量比較好，并且完整性好。DNA的污染也是影響熒光定量的結(jié)果的一個因素，本試驗采用DNAaseⅠ消化提取的RNA，以消除DNA的影響。

隨著 GeNorm，NormFinder，Bestkeeper等工具的出現(xiàn)，對于候選內(nèi)參基因的選擇變得更加簡單化和準(zhǔn)確了［8，20］，GeNorm 軟件是最常用的分析軟件［10］，GeNorm是通過將某一個基因與其他基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，對其表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，通過GeNorm軟件分析可知，大腸桿菌中候選的內(nèi)參基因的M值都小于1.5，表明所選基因穩(wěn)定性都比較好，其中recA的M值最低，表明其在pBD2的脅迫下表達(dá)最穩(wěn)定的，其次是aspC和gapdh。recA和gapdh在原核中是常用的內(nèi)參基因，我們的結(jié)果與其他條件脅迫下的結(jié)果比較一致［10，21］，16S rRNA 在不同條件下的表達(dá)是比較穩(wěn)定的，但是其轉(zhuǎn)錄本比較高，不適合作為內(nèi)參基因［10］，本研究的結(jié)果也顯示16S rRNA的表達(dá)量最高，其Ct值最低，對于在分析表達(dá)量不是特別高的基因可能不適合。在豬β防御素2的選擇壓力下，大腸桿菌穩(wěn)定的內(nèi)參基因為recA，aspC和gapdh，本研究為大腸桿菌在豬β防御素2脅迫下差異表達(dá)的基因分析奠定了基礎(chǔ)，同時為其他抗菌制劑脅迫下內(nèi)參基因的篩選提供了參考。

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