何瀟湘，景亞星，靳曉慧，蘭培英，張利衛(wèi)，周 雍，魏戰(zhàn)勇，

豬日本乙型腦炎(Porcine Japanese Encephalitis B)是由日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的，主要依靠吸血的雌蚊為傳播媒介而進(jìn)行傳播的一種嚴(yán)重侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性人獸共患的傳染病。JEV的危害較大，可感染很多動(dòng)物和人，對(duì)豬的危害最為嚴(yán)重［1－2］。該病毒可引起母豬發(fā)生毒血癥、子宮內(nèi)膜炎;懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎等繁殖障礙［3］;公豬發(fā)生單側(cè)性睪丸炎，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展［4－5］。有關(guān)JEV感染引起豬的相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和免疫病理學(xué)研究尚不深入，這嚴(yán)重制約了新型疫苗、有效藥物的研發(fā)和疾病防控。豬外周血單核細(xì)胞(Porcine Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，能分泌白介素、干擾素、集落刺激因子等細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答過(guò)程中，細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化具有重要的作用，研究細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄對(duì)研究并揭示豬炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的激發(fā)與調(diào)控有著重要作用［6］。羅線連等［7］研究發(fā)現(xiàn)，JEV 感染豬PBMC 后可引起 MHC-Ⅰ、Mx1、2’，5’寡腺苷酸合成酶(2-5OAS)、轉(zhuǎn)錄因子IRF3等抗病毒相關(guān)因子增加，為研究細(xì)胞抗病毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。但對(duì)于JEV促炎性反應(yīng)，特別是對(duì)于促炎因子的研究較少。本試驗(yàn)利用相對(duì)熒光定量PCR方法，分析不同時(shí)間點(diǎn)，JEV感染PBMC后的促炎性細(xì)胞因子(IL-8、IL-12、IL-17、IL-18)mRNA 的表達(dá)，為探討JEV免疫致病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞

豬日本乙腦病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，經(jīng)河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存，病毒在PK-15細(xì)胞上傳代10代，測(cè)定病毒滴度為104.5TCID50·mL－1。選擇 60 日齡，體重為 50 kg左右的長(zhǎng)白豬(由河南省正陽(yáng)種豬場(chǎng)提供)，經(jīng)PCR技術(shù)或ELISA檢測(cè)豬的常見(jiàn)傳染病，如豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV－2)等均為陰性。無(wú)菌采集豬抗凝的外周血，參照文獻(xiàn)［3］的方法分離獲得豬PMBC，并將其培養(yǎng)于含7%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5%CO237℃培養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑

MX3005 Real-Time PCR儀器(吉泰科技公司生產(chǎn));紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)SIM公司生產(chǎn));臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma公司生產(chǎn));Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit I(MBI Fermentas公司);胎牛血清培養(yǎng)液(Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ試劑(Omega公司);SYBR Premix Ex Taq試劑(TaKaRa公司);RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司);其他試劑均為分析純。

1.3 病毒感染

取2 mL的PMBC細(xì)胞(細(xì)胞濃度為105個(gè)·mL－1)置于6孔板每孔中;采取同步接種方法接種JEV病毒(感染復(fù)數(shù)MOI為1)，每個(gè)處理設(shè)2個(gè)重復(fù)孔，輕輕搖勻，放入37℃ 5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞樣品收集

將 JEV 感染后 1，3，12，24，48，72 h 的單核細(xì)胞用2 000 r·min－1離心收集 PMBC，并用 PBS重懸、洗滌2次，并離心收集細(xì)胞沉淀，然后直接提取RNA或者保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

JEV的RNA和細(xì)胞總RNA提取參照E.Z.N.A Total RNA Kit I說(shuō)明書進(jìn)行，具體方法和步驟參照文獻(xiàn)［8－9］進(jìn)行，提取的總RNA為模板分別進(jìn)行JEV反轉(zhuǎn)錄和炎性細(xì)胞因子的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為RT-PCR的模板。

1.6 引物和相對(duì)定量PCR

引物的設(shè)計(jì)，參照GenBank公布的JEV和各炎性因子的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)后使用 GenBank的 Blast Primer對(duì)引物進(jìn)行篩選，RT-PCR引物及其反應(yīng)條件見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上游、下游引物各 0.4 μL(濃度為 15 μmol·L－1)，cDNA 400 ng，用滅菌雙蒸水添加至20 μL;反應(yīng)條件為:95℃ 1 min;95℃ 10 s。表1中所指示退火溫度15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后升溫至95℃ 30 s，再降至55℃，開(kāi)始以0.2℃·s－1遞增至95℃，采集熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，并于20℃結(jié)束反應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

Ct值在熒光定量PCR中，主要反映模板中目標(biāo)基因含量，通過(guò)與β-action為看家基因比較，以采用2－△△Ct法［10］進(jìn)行分析，能準(zhǔn)確反映出目標(biāo)基因的相對(duì)含量。試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05時(shí)表示差異顯著。

表1 Real-time PCR引物及其反應(yīng)條件Table 1 Primers and conditions used for Real-time PCR assays

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒RNA水平的測(cè)定

PBMC 在感染 JEV 后，分別在 1、3、12、24、48、72 h收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，并提取RNA，之后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以用于RT-PCR。與看家基因β-action進(jìn)行比較分析后，將病毒感染1 h時(shí)病毒RNA含量定義為1倍，經(jīng)計(jì)算得到不同時(shí)間病毒RNA在細(xì)胞的增殖倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 感染后不同時(shí)間PBMCs中JEV RNA相對(duì)含量的變化Fig.1 Changes of relative content of JEV DNA in PBMCs after infection

由圖1可知，JEV感染PMBC后，1 h就可以檢測(cè)到病毒RNA，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，病毒RNA含量逐漸上升，在感染后24 h病毒含量大量增加，在感染后72 h達(dá)到最大值，約為1 h時(shí)的10倍左右。

2.2 炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄時(shí)相

豬 PBMC 感染 JEV 后，在 1、3、12、24、48、72 h時(shí)候分別收集細(xì)胞，并按試劑盒步驟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成c DNA，經(jīng)熒光定量PCR，與看家基因βaction進(jìn)行比較分析，并以JEV 0 h mRNA含量定義為1倍，計(jì)算出不同時(shí)間段細(xì)胞因子mRNA在細(xì)胞內(nèi)的增殖倍數(shù)。

IL-8 感染 1、3、24、72 h 的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.7、10、3.2、2.8 倍，與對(duì)照組相比，均差異極顯著(P ＜0.01)，12，48 h表達(dá)量降低;IL-12p40 感染1、3、12、24 h 后分別為對(duì)照組的 1.6、5.7、5.3和1.9倍，與對(duì)照組相比，均差異極顯著(p＜0.01)接著在48 h表達(dá)量降低，72 h甚至不表達(dá);IL-12p35感染1 h開(kāi)始表達(dá)，3 h表達(dá)降低，12、24 h表達(dá)量都增加，48 h表達(dá)量達(dá)到峰值，約73倍左右，與對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01)，72 h表達(dá)量降低;IL-17感染1、3、12 h后與對(duì)照組相比，表達(dá)量增加的幅度不明顯，差異不顯著(P＞0.05)，24、72 h 甚至不表達(dá)，48 h 表達(dá)量大量增殖;IL-18感染1 h開(kāi)始表達(dá)，3 h大量表達(dá)，12、24、48 h表達(dá)量增高趨勢(shì)，在72 h量達(dá)到峰值，約為7.8倍，且與對(duì)照組相比，差異極顯著(P ＜0.01)結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討論

JEV可以在PK15、Vero和BHK21等細(xì)胞中增殖，且能引起較明顯的細(xì)胞病變。本研究發(fā)現(xiàn)JEV在感染PBMC后1 h就能檢測(cè)到該病毒，感染后3 h開(kāi)始增殖，72 h達(dá)到峰值。這有可能JEV可以感染PBMC，但卻不是JEV增殖的理想細(xì)胞，因而前期病毒增殖較為緩慢，病毒在后期大量增殖，引起細(xì)胞死亡，可能是PBMC作為免疫細(xì)胞而發(fā)揮抗病毒作用所致［7］。

促炎性細(xì)胞因子是指機(jī)體受到細(xì)菌或者病毒的感染時(shí)，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)生成的一系列對(duì)炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子，例如白介素、干擾素和腫瘤壞死因子等。而本文所研究的IL-8，IL-12，IL-17和IL-18都是促炎性細(xì)胞因子，它們的作用常常交替重疊［22］。

白細(xì)胞介素8(IL-8)是一種主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞形成的細(xì)胞趨化因子。1986年KOWNATZKI首先發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞可以分泌產(chǎn)生IL-8，該因子在激活嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮很大作用，對(duì)炎癥反應(yīng)和免疫過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用。有報(bào)道CXC家族(α亞家族)趨化因子主要在疾病的急性反應(yīng)期介導(dǎo)炎性細(xì)胞起作用［11］，IL-8通過(guò)自分泌和旁分泌的作用刺激內(nèi)膜細(xì)胞和其他的腺體細(xì)胞，而這些細(xì)胞又分泌包括IL-8在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，此時(shí)若有其他炎癥因子的刺激，分泌作用又進(jìn)一步地加強(qiáng)，從而形成惡性循環(huán)，加快疾病的發(fā)展。據(jù)孫琳［12］的研究推測(cè)，IL-8參與疾病的致病過(guò)程，可能存在與其他趨化因子參與疾病的慢性化。

圖2 細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄時(shí)相Fig.2 The transcriptional profiles of cytokines

本研究發(fā)現(xiàn)，JEV感染淋巴細(xì)胞1 h后IL-8的表達(dá)量開(kāi)始表達(dá)，但不太顯著;在3 h表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后在12 h表達(dá)量下降，在24 h后IL-8的表達(dá)量有增高趨勢(shì)，隨后在48 h表達(dá)量又緊跟著出現(xiàn)下滑趨勢(shì);接著在72 h再次出現(xiàn)少量增高。據(jù)此可以推測(cè)PBMC在受到JEV感染后，前期細(xì)胞活性強(qiáng)，病毒沒(méi)有大量增殖，隨著細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變，IL-8表達(dá)量出現(xiàn)忽高忽低的表現(xiàn)，說(shuō)明細(xì)胞和病毒產(chǎn)生對(duì)抗反應(yīng);如果病毒毒力強(qiáng)，細(xì)胞因子IL-8 mRNA就能快速大量表達(dá)，以便于參與抗病毒反應(yīng)，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

白細(xì)胞介素12(IL-12)是由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-12含有亞基IL-12p35和亞基IL-12p40，這2個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵的作用有機(jī)結(jié)合在一起，p35只決定IL-12的種屬特異性，p40卻在IL-12與受體結(jié)合時(shí)起關(guān)鍵作用［13］。單獨(dú)的兩個(gè)亞基都不能與IL-12受體結(jié)合，只有當(dāng)2個(gè)亞基有機(jī)結(jié)合在一起后才可以與IL-12受體充分結(jié)合，這樣才能發(fā)揮IL-12生物學(xué)效應(yīng)［14］。IL-12是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的始動(dòng)因子，它能促進(jìn)Th1淋巴細(xì)胞的增殖和分化，在機(jī)體組織的抗病毒感染過(guò)程中有強(qiáng)大的功能。IL-12和IL-18共同作用可以誘導(dǎo)刺激B細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-γ的mRNA和蛋白，而在抗腫瘤的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。所以人們常利用其抗腫瘤的這種生理作用，把IL-12因子應(yīng)用于慢性感染疾病的治療，有時(shí)也可用于治療因免疫系統(tǒng)發(fā)育不全或遭受損害引起的免疫陷性疾?。?5］。尹曉玲等［16］研究發(fā)現(xiàn)，IL-12能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，它低水平表達(dá)/不表達(dá)與結(jié)腸癌進(jìn)展的相關(guān)性，證實(shí)IL-12對(duì)直接限制結(jié)腸癌惡性表型的潛在益處。王明瓊［17］發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙腦重型和普通型患兒的IL-12水平無(wú)顯著性差異，但均明顯高于輕型，IL-12可作為乙腦實(shí)質(zhì)損傷程度的重要指標(biāo)和治療新靶點(diǎn)，這為乙腦的研究拓展了新領(lǐng)域。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在JEV感染PBMC 1h后IL-12p35和IL-12p40在mRNA水平的表達(dá)量均明顯增加，隨著時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸增加，IL-12p35在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，約為空白細(xì)胞的73倍左右，IL-12p40在3 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，為空白細(xì)胞的5.7倍之多，隨后呈低水平表達(dá)，72 h后二者表達(dá)量都出下降趨勢(shì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè):IL-12是細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的起始因子，IL-12 mRNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成可能比其他細(xì)胞因子要早，這為病毒感染早期診斷提供指標(biāo)。在感染72 h后二者表達(dá)量都表現(xiàn)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是IL-4和IL-10等其他細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)的調(diào)控下，對(duì)IL-12 mRNA的表達(dá)產(chǎn)生了抑制作用。

白細(xì)胞介素17(IL-17)普遍存在于單核細(xì)胞中，是一種多功能的炎癥前細(xì)胞因子，具有155個(gè)氨基酸。它能夠參與組織細(xì)胞炎癥發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸反應(yīng)過(guò)程;也與免疫應(yīng)答、免疫排斥等多種生物學(xué)活性有關(guān)［18］。在炎癥的反應(yīng)中，IL-17與中性粒細(xì)胞的生成快慢、分散和聚集有密切關(guān)系。IL-17在疾病的發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎這個(gè)疾病中，IL-17是判斷其疫病程度的重要指標(biāo)之一［19］。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)JEV感染PBMC后1，3和12 h表達(dá)量增加緩慢，在24 h時(shí)，IL-17的表達(dá)量明顯下降，在后期48 h才大量表達(dá)。IL-17在感染72 h的時(shí)候表達(dá)量又呈現(xiàn)劇烈下滑趨勢(shì)，甚至可以說(shuō)是不表達(dá)。這是由于免疫系統(tǒng)高度調(diào)控IL-17的表達(dá)，在細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答階段中，一般很難檢測(cè)到IL-17 mRNA的基因表達(dá)，又加上JEV感染細(xì)胞的過(guò)程中大量促炎細(xì)胞因子參與抗病毒反應(yīng)，能大大降低IL-17 mRNA的表達(dá)量。

白細(xì)胞介素18(IL-18)因其可以誘導(dǎo)γ干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生，因此又叫做 IFN-γ誘導(dǎo)因子［20］。它是一種由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在機(jī)體組織和細(xì)胞中普遍表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-18的結(jié)構(gòu)類似IL-1，但功能卻與IL-12相似，它與其他因子產(chǎn)生一定的作用［21］。IL-18能誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，而它又能刺激IL-6的產(chǎn)生，IL-18也能直接促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。IL-18是促進(jìn)Th1反應(yīng)為主的細(xì)胞因子，在抵抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤上有很重要的作用。IL-18因子能刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤能力，IL-18還可以趨化中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬、殺死、降解作用往往與它也有關(guān)。本研究表明，JEV感染外周血細(xì)胞后3 h后IL-18表達(dá)量開(kāi)始增多，在感染后72 h，IL-18表達(dá)量達(dá)到高峰。因此，IL-18參與病毒的殺死過(guò)程，在炎癥反應(yīng)整個(gè)階段中都起到很重要作用。

本試驗(yàn)利用熒光定量PCR，測(cè)定和分析了JEV感染豬PBMC后病毒及促炎細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。結(jié)果顯示，JEV感染PBMC后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而含量增高，在72 h達(dá)到高峰。而IL-8在感染初期的時(shí)候含量增高，隨后降低，在72 h時(shí)候又再次升高;IL-12p35在48 h達(dá)到高峰，IL-12p40在感染后3 h就達(dá)到高峰;IL-17在48 h達(dá)到高峰之后，隨后開(kāi)始下降;IL-18從開(kāi)始便逐漸上升，在感染后期達(dá)到穩(wěn)定。由此推測(cè)，JEV感染促進(jìn)了PBMC的發(fā)生炎癥，促進(jìn)細(xì)胞釋放病毒，影響其他促炎性細(xì)胞因子的釋放，繼而影響特異性免疫功能的激活與正常發(fā)揮，為 JEV病程的持續(xù)發(fā)展創(chuàng)造了前提條件。

［1］ SOLOMON T，NI H，BEASLEY D W，et al.Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in Southeast Asia［J］.J Virol，2003，77(5):3091 －3098.

［2］ GHOSH D，BASU A.Japanese encephalitis a pathological and clinical perspective［J］.PLOS Negl Trop Dis，2009，3(9):e437.

［3］ NGA P T，CARMEN P，CUONG V D，et al.Shift in Japanese encephalitis virus(JEV)genotype circulating in Northern Vietnarn:implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia［J］.J Gen Virol，2004，85(6):1625 －1631.

［4］ 湯德元，郭萬(wàn)柱.日本腦炎病毒及其疫苗的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，25(2):217－221.

［5］ 張杰.豬乙型腦炎病的診斷與治療［J］.豬場(chǎng)獸醫(yī)，2014，305(9):88.

［6］ TATIANA G，VALERIO L，LIUDMILA S，et al.αvβ3-integrin is a major sensor and activator of innate immunity to herpes simplex virus-1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(48):19792－19797.

［7］ 羅線連，王瑞寧，李金磊，等.日本乙型腦炎病毒對(duì)豬的外周血單核細(xì)胞抗病毒因子mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28(2):116－119.

［8］ 薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W .分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學(xué)出版社，2001:463－471.

［9］ 李厚偉，魏戰(zhàn)勇，尹海燕，等.豬細(xì)小病毒感染PK-15細(xì)胞抗病毒相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄變化的分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(1):48－55.

［10］郭東輝，張莉娟，李金磊，等.PCV2與PPV共感染豬外周血單核細(xì)胞對(duì)其細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(1):71－77.

［11］ ULUKUS M，ULUKUS E C，TAVMERGEN E N，et al.Expression of interleukin-8 and monocyte chemotactic protein 1 in women with endometriosis［J］.Fertil Steril，2009，91(3):687－693.

［12］孫琳，王建.白細(xì)胞介素－8在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40(9):1643－1637.

［13］張立，王迎新，楊婷，等.白介素12與常見(jiàn)自身免疫性疾病的研究進(jìn)展［J］.中華疾病控制雜志，2014，18(11):1099－1103.

［14］ ROMERO J F，IBRAHIM G H，RENGGLI J ，et al.IL-12p40-independent induction of protective immunity upon multiple Plasmodium berghei irradiated sporozoite immunizations［J］.Parasite Immunology，2007，29(11):541－548.

［15］陳鴻珊，張興權(quán).抗病毒藥物及其研究方法［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:253－268.

［16］尹曉玲，陳應(yīng)果，張建紅，等.人IL-12對(duì)結(jié)腸癌肝細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(12)，1215－1218.

［17］王明瓊.流行性乙型腦炎患兒ET-1和IL-12檢測(cè)的臨床意義［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，48(2):40－41.

［18］ KOLIS J K，LINDEN A.Interleukin-17 family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21(4):467 －476.

［19］戴小波，孫萬(wàn)邦.IL-17免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，18，(6):732－735.

［20］ HUNG J，MCQUILLAN B M，CHAPMAN C M，et al.Elevated interleukin-18 levels associated with the metabolic syndrome independent of obesity and insulin resistance［J］.Immunology，2005，96(2):247 －251.

［21］ TROSEID M，SELJEFLOT I，HJERKINN E M，et al.Interleukin-18 is a strong predictor of cardiovascular events in elderly men with the metabolic syndrome:synergistic effect of inflammation and hyperglycemia［J］.Diabetes Care，2009，32(3):486－492.

［22］ 劉大彪.2型糖尿病患者血清 IL-6、IL-8、IL-10、IL-18檢測(cè)的臨床意義［J］.放射免疫學(xué)雜志，2008，2(1):44－45.