孫翠紅，徐翠蓮，丁麗芳，王雪芬，李洪亮，付培培，陳發(fā)元，李寶寶，施守杰，趙銘欽

氨基寡糖素是指D－氨基葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵連接的低聚糖天然產(chǎn)物，也稱農(nóng)業(yè)專用殼寡糖，是通過采用獨特的生物技術(shù)進一步降解甲殼素或殼聚糖得到的［1］。作為一種新型糖類生物農(nóng)藥，不僅具有對非靶標(biāo)生物毒性低、影響小，并在環(huán)境中易分解、無殘留，同時還有用量小、安全性好的特點。該藥劑可誘導(dǎo)提高植物的抗性，嚴(yán)凱等［2-5］研究表明，氨基寡糖素對煙草、辣椒、番茄作物上的病毒病(TMV，CMV等)具有較好的抑制作用。近年來，納米銀作為一種新型、綠色、高效的納米材料在醫(yī)藥、食品、精細化工等領(lǐng)域備受關(guān)注。納米銀不僅具有強效的抗菌作用，還具有抗病毒、抗腫瘤等生物活性［6-11］。作者以殼寡糖為還原劑和穩(wěn)定劑得到了殼寡糖納米銀溶液(COS-Ag)。殼寡糖納米銀的抗病毒活性也已有報道，對人體 H1N1，HCMV等具有顯著的抑制作用［12-13］。煙草花葉病在中國大多數(shù)煙區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，降低了煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，無法滿足卷煙行業(yè)對優(yōu)質(zhì)烤煙的要求。目前，還沒有專門有效地針對煙草花葉病的農(nóng)藥，農(nóng)業(yè)上常用的預(yù)防藥劑為寧南霉素水劑或者氨基寡糖素水劑。本研究將天然生物藥劑殼寡糖與銀離子結(jié)合制得了殼寡糖納米銀藥劑，有效地將二者的抗病性結(jié)合在一起在田間進行抗煙草花葉病的試驗，旨在為新的抗病毒藥劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種、藥劑

供試品種為豫煙10號。供試藥劑為0.5%的氨基寡糖素水劑，河北奧德植保藥業(yè)有限公司;殼寡糖(COS，相對分子質(zhì)量平均為5 000)，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硝酸銀(AgNO3)，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。儀器有CL－2型恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州國瑞科技儀器有限公司;TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 殼寡糖納米銀溶液(COS-Ag)的制備

將50 mL 1 g·L－1殼寡糖溶液加入100 mL燒杯中，然后再向其中加入5 mL 10 g·L－1的硝酸銀溶液，在80℃條件下攪拌70 min，得到殼寡糖納米銀溶液(COS-Ag)。

1.3 試驗地點

試驗設(shè)在河南省許昌市許昌縣煙草試驗田。該地連續(xù)3 a以上種植煙草，煙草花葉病常年比較嚴(yán)重。試驗地地勢平坦、灌溉方便、土質(zhì)較好、肥力均勻一致，土壤質(zhì)地為壤土。移栽期為2014－05－10，種植行距120 cm，株距50 cm。試驗共設(shè)3個處理:A、稀釋700倍的氨基寡糖素;B、質(zhì)量濃度為10 mg·L－1的 COS-Ag溶液;C、清水(對照)。每個處理(小區(qū))面積667 m2，隨機分組進行試驗設(shè)計，重復(fù)3次，四周設(shè)保護行。煙田日常施肥、病蟲害防治、除草、灌溉等均與大田管理一致。

1.4 試驗設(shè)計

煙田預(yù)防試驗:選擇無發(fā)病的煙田進行藥劑預(yù)防試驗，在移栽后30 d開始進行噴藥，連續(xù)噴藥3次，每次間隔10 d，噴藥前對煙田進行普查，沒有發(fā)現(xiàn)病株。

煙田治療試驗:于2014－06－28，2014－07－05，2014－07－12進行噴藥。2014－06－17進行煙田普查，發(fā)現(xiàn)零星煙草普通花葉病煙株。

在3次噴藥后每5～7 d時間觀察記載發(fā)病情況。根據(jù)《煙草侵染性調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)》，調(diào)查病斑的變化情況，計算病情指數(shù)、發(fā)病率和防治效果，并記錄發(fā)病時間。選取治療試驗的烤后樣C3F為研究對象，研究不同處理煙葉常規(guī)化學(xué)成分和中性香味物質(zhì)的含量。

1.5 病情指數(shù)的調(diào)查和分級標(biāo)準(zhǔn)

煙草花葉病分級標(biāo)準(zhǔn)如下［14］:

0級:全株無病。

1級:心葉脈明或輕微花葉，或上部不超過1/3葉片花葉，或有病斑，但不變形，植株無明顯矮化。

2級:1/3～2/3葉片花葉或少數(shù)葉片變形或主脈變黑，植株矮化為正常株高的2/3以上。

3級:1/2～2/3葉片花葉，或變形或主側(cè)脈壞死，或植株矮化為正常株高的1/2～2/3。

4級:全株葉片花葉或嚴(yán)重變形或壞死，病株矮化為正常株高的1/3～1/2，30%以上葉脈壞死，病株較健株矮1/3以上。

1.6 烤后樣常規(guī)化學(xué)成分和中性香味物質(zhì)的測定

烤煙常規(guī)化學(xué)成分的測定參考文獻［15］的方法進行;中性香味物質(zhì)的提取選用水蒸氣蒸餾－二氯甲烷溶劑同時蒸餾萃取法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，由GC/MS測定結(jié)果和NIST02庫檢索定性［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對煙草花葉病毒的預(yù)防效果

各個藥劑處理對感染煙草花葉病毒煙株的預(yù)防效果見表1。由表1可以看出，氨基寡糖素處理和COS-Ag與對照清水相比，對感病煙株均有較好的抑制作用，各個處理下平均病情指數(shù)分別為11.45，8.65 和 20.40，與對照相比，氨基寡糖素處理和COS-Ag處理下平均病情指數(shù)分別比對照43.87%，57.60%，氨基寡糖素處理和 COS-Ag處理與對照之間的病情指數(shù)存在著顯著性和極顯著性差異;各個時期下COS-Ag處理的煙株發(fā)病率較高，而由預(yù)防效果可以看出，不同的調(diào)查時期下COS-Ag處理對感染煙草花葉病毒的煙株的防治效果均優(yōu)于氨基寡糖素處理，其中COS-Ag處理下的最大防治效果可達到67.74%，且以56.81%平均預(yù)防效果高出氨基寡糖素處理(平均預(yù)防效果為43.52%)。

表1 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對煙草花葉病毒病的預(yù)防效果Table 1 The prevention effect of COS and COS-Ag on tobacco mosaic

2.2 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對煙草花葉病毒的治療效果

各個藥劑處理對感染煙草花葉病毒煙株的治療效果見表2。由表2可以看出，氨基寡糖素和COS-Ag與對照清水相比，對感病煙株均有較好的抑制作用。各個時期，煙草花葉病的發(fā)病率以COS-Ag處理下較低;對照處理的病情指數(shù)平均為17.51，氨基寡糖素處理下病情指數(shù)平均為13.25，對大田感染煙草花葉病的煙株的抑制率提高了24.32%。COS-Ag處理下的平均病情指數(shù)為10.98，與對照相比，對病株的抑制率提高了37.29%，氨基寡糖素處理和COS-Ag處理與對照之間的病情指數(shù)存在著顯著性和極顯著性差異;由治療效果可以看出，不同調(diào)查時期的COS-Ag處理對感染煙草花葉病毒的煙株的治療效果均優(yōu)于氨基寡糖素處理，COS-Ag處理下最大治療效果可達43.63%，其平均治療效果比氨基寡糖素處理高出12.97%。

表2 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對煙草花葉病毒病的治療效果Table 2 The treatment effect of COS and COS-Ag on tobacco mosaic

2.3 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對感病煙株常規(guī)化學(xué)成分的影響

不同藥劑處理下煙葉常規(guī)化學(xué)成分如表3所示，由表3可見，各個處理條件下烤煙總糖和還原糖含量均偏高。相對來說，以COS-Ag處理下總糖含量較接近于工業(yè)要求的總糖和還原糖含量的范圍，為2.639，2.466 g·kg－1;各處理煙堿、總氮和鉀氯比均符合卷煙企業(yè)的要求，其中以COS-Ag處理的含量較接近于優(yōu)質(zhì)煙的要求，這可能與COSAg處理感病煙株的病情狀況得到有效緩解有關(guān)。

表3 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對烤煙常規(guī)化學(xué)成分的影響Table 3 Effect of COS and COS-Ag on routine chemical compositions in flue-cured tobacco

2.4 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對感病煙株烤后中性致香成分的影響

不同藥劑處理的烤煙中性致香物質(zhì)的種類相同，但含量存在著差別(表4)。中性致香物質(zhì)按香味前體物可分為5類，分別為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、類西柏烷類降解產(chǎn)物、葉綠素降解產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(表4、表5)。COS-Ag處理的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中的香葉基丙酮和巨豆三烯酮3，芳香族氨基酸降解產(chǎn)物中的苯乙醛，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的糠醛、6－甲基－5－庚烯－2－醇和3，4－二甲基－2，5－呋喃二酮的含量低于氨基寡糖素處理，其他大多數(shù)香味物質(zhì)含量為最高。

由表5可以看出，COS-Ag處理條件下，除了芳香族氨基酸降解產(chǎn)物和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物略低于氨基寡糖素處理，其他致香成分均高于其他2個處理，各個處理下烤煙中性致香成分的總量分別為773.70，923.02 和 581.08 μg·g－1。與對照相比，COS-Ag處理和氨基寡糖素處理均達到了顯著性或極顯著性差異。

表4 氨基寡糖素和殼寡糖納米銀溶液對烤煙中性致香成分的影響Table 4 Effect of COS and COS-Ag on neutral aroma component in flue-cured tobacco μg·g－1

表5 不同處理的各類中性致香成分含量Table 5 The content of five neutral aroma component in different treatment μg·g

3 結(jié)論與討論

與氨基寡糖素水劑相比，COS-Ag對大田感染煙草花葉病的煙株具有較好的預(yù)防和治療效果，其最大防治效果分別達到67.74%，43.63%，這比已有報道［17-19］的數(shù)據(jù)有顯著提高，其中原因可能與殼寡糖自身的誘導(dǎo)抗病性有關(guān)，有可能與納米銀的誘導(dǎo)抗病性有關(guān)，或者與二者的協(xié)同作用有關(guān)。

COS-Ag處理下可有效改善煙葉的品質(zhì)，常規(guī)化學(xué)成分對卷煙風(fēng)格的形成有著重要的影響，煙葉中各個致香物質(zhì)對煙葉品質(zhì)的形成有著重要的影響。COS-Ag處理下煙葉常規(guī)化學(xué)成分處于較適宜的范圍，類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物和類西柏烷類降解產(chǎn)物等重要的致香成分含量較高，且與對照相比差異性顯著。本研究表明，COS-Ag在誘導(dǎo)煙株抗煙草花葉病方面具有潛在的應(yīng)用前景，這不僅為殼寡糖衍生物納米銀的深入研究和開發(fā)利用提供依據(jù)，也為新型、綠色、高效農(nóng)藥的開發(fā)提供了很大的發(fā)展空間。

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