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        高效液相色譜法測(cè)定人血清中茶堿濃度

        2016-06-07 02:46:35孔幸珊曾彩芳楊佳彬
        中國藥業(yè) 2016年7期

        孔幸珊,曾彩芳,楊佳彬

        (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,廣東廣州 511447)

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        高效液相色譜法測(cè)定人血清中茶堿濃度

        孔幸珊,曾彩芳,楊佳彬

        (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,廣東廣州511447)

        摘要:目的建立測(cè)定人體內(nèi)茶堿血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)法。方法采用10%三氟乙胺沉淀處理血清樣品,色譜柱為Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75),流速1.0 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm,柱溫25℃。結(jié)果茶堿血藥濃度在2.55~40.72 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=45 417.2 X-4 580.0,r=0.999 8(n=6)。日內(nèi)和日間精密度的RSD分別不超過4.88%和6.06%,定量限為0.2 μg/mL。結(jié)論該法快速、準(zhǔn)確,適用于臨床茶堿血藥濃度監(jiān)測(cè)。

        關(guān)鍵詞:茶堿;高效液相色譜法;血藥濃度監(jiān)測(cè)

        茶堿是黃嘌呤類藥物,作為嘌呤受體阻滯劑能抑制磷酸二酯酶活性,松弛支氣管平滑?。?]。其臨床主要用于支氣管哮喘、阻塞性肺氣腫等肺部疾?。?],療效確切,價(jià)格低廉,且不易出現(xiàn)耐受。但茶堿的治療窗比較窄,臨床多種常用藥物均能降低茶堿的清除率[3-5],容易出現(xiàn)因血藥濃度過高導(dǎo)致的藥品不良反應(yīng)。監(jiān)測(cè)茶堿血藥濃度是保證臨床安全、合理使用茶堿的重要手段。為此,筆者建立了可快速測(cè)定茶堿血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)法?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器

        LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司,包括SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,LC-20AT溶液輸送泵,SPD-20A UV-VIS Detector,工作站,柱溫箱)。Eppendorf 5424R型臺(tái)式高速低溫離心機(jī);AUW120D型天平(十萬分之一,日本島津公司)。

        1.2試藥

        茶堿對(duì)照品(批號(hào)為100121-201104,中國食品藥品檢定研究院);甲醇(色譜純,MERCK公司);試驗(yàn)用水為去離子水,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后使用;三氟乙酸,氫氧化鈉均為化學(xué)純。健康人空白血漿由本院檢驗(yàn)科提供,樣品血漿由呼吸科和心血管內(nèi)科提供。

        2 方法與結(jié)果

        2.1色譜條件

        色譜柱:Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(25∶75);流速:1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):274 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20 μL。

        2.2溶液配制

        將茶堿對(duì)照品于105℃下干燥2 h后,精密稱取10.18 mg,置10 mL容量瓶中,加甲醇水[甲醇-水(25∶75)]充分溶解,稀釋至刻度,得標(biāo)準(zhǔn)貯備液(質(zhì)量濃度為1.018 g/L),于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3血清樣品處理

        取空白血清380 μL,加入20 μL標(biāo)準(zhǔn)茶堿溶液,渦旋混合10 s,加10%三氟乙酸150 μL,渦旋2 min,12 000 r/min離心12 min,取上清液400 mL,加入30 μL 1 mol/L NaOH渦旋混合10 s,12 000 r/min離心6 min,取上清液400 μL,進(jìn)樣分析。

        2.4方法學(xué)考察

        專屬性試驗(yàn):按擬訂色譜條件分別對(duì)對(duì)照品溶液、空白血清和茶堿標(biāo)準(zhǔn)品血清進(jìn)行分析,色譜圖見圖1。可見,茶堿峰未受血清雜質(zhì)峰干擾,茶堿的保留時(shí)間是5.8min。

        圖1 血藥濃度測(cè)定高效液相色譜圖

        標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限考察:取標(biāo)準(zhǔn)茶堿溶液,制備50.9,101.8,203.6,407.2,610.8,814.4 μg/mL系列質(zhì)量濃度溶液。取血清380 μL,分別加入20 μL茶堿對(duì)照品溶液,得血清藥物濃度分別為2.55,5.09,10.18,20.36,30.54,40.72 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)血清樣品,按2.3項(xiàng)下方法處理,進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,以茶堿峰面積為縱坐標(biāo)(Y),茶堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程Y=45 417.2 X-4 580.0,r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明,茶堿質(zhì)量濃度在2.55~40.72 μg/mL間與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比(S/N)≥3計(jì)算最低檢測(cè)限為0.06 μg/mL,以S/N≥10計(jì)算定量限為0.2 μg/mL。

        回收率與精密度試驗(yàn):配制低、中、高3種質(zhì)量濃度(分別為2.55,10.18,30.54 μg/mL)的含藥血清樣品,按2.3項(xiàng)下方法操作。日內(nèi)每種質(zhì)量濃度平行配制5份,依法測(cè)定,以測(cè)得質(zhì)量濃度值與真實(shí)值的比表示方法回收率,計(jì)算RSD,作為日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算RSD作為日間精密度。結(jié)果見表1和表2。

        表1 茶堿的方法回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

        表2 茶堿的日內(nèi)精密度和日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

        2.5臨床應(yīng)用

        監(jiān)測(cè)呼吸科及心血管內(nèi)科服用茶堿緩釋片患者的血藥濃度,抽血時(shí)間為患者連續(xù)服用茶堿緩釋片5次(當(dāng)藥物濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)),于第6次服藥前30 min(谷濃度)抽血?;颊卟鑹A血藥濃度為8.17~10.19 μg/mL。其中心血管內(nèi)科患者同時(shí)服用調(diào)血脂藥瑞舒伐他汀、拜阿司匹林等,呼吸科患者服用阿奇霉素、左氧氟沙星、氨溴索、異丙托溴銨等,所有患者的茶堿血藥濃度均未受其他藥物影響。結(jié)果見圖2,表明本法可用于臨床藥物濃度檢測(cè)。

        圖2 臨床樣品高效液相色譜圖

        3 討論

        以往報(bào)道采用高效液相色譜法測(cè)定茶堿血藥濃度的文獻(xiàn)[6-8]較多,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著流動(dòng)相中甲醇比例的增大,茶堿的出峰時(shí)間縮短。水的極性比甲醇大,茶堿是黃嘌呤結(jié)構(gòu)衍生物,結(jié)構(gòu)中雖然含N—H,但氮原子的孤對(duì)電子與相鄰的C=N形成p-π共軛,降低了N—H的極性,因此增加流動(dòng)相中甲醇的比例,體系的極性降低,根據(jù)相似相容原理,茶堿的保留時(shí)間就相對(duì)減少,故出峰時(shí)間減短。但出峰時(shí)間過短,容易受血漿中的蛋白干擾,而出峰時(shí)間過長(zhǎng),監(jiān)測(cè)耗時(shí),浪費(fèi)溶劑,增加成本;相比甲醇-磷酸鹽體系作為流動(dòng)相[9],以甲醇-水為流動(dòng)相更簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì),更能延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。故選擇甲醇-水(25∶75)作為流動(dòng)相,茶堿出峰時(shí)間為5.8 min,比較合適。

        血漿樣品處理曾考察經(jīng)典提取法和蛋白沉淀法,其中經(jīng)典提取法用乙酸乙酯提取,40℃真空干燥箱干燥,操作復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng),但回收率較高;蛋白沉淀法分別選用甲醇、乙腈和10%三氟乙酸作為沉淀劑,沉淀效果10%三氟乙酸>乙腈>甲醇。故選擇10%三氟乙酸作為蛋白沉淀劑處理樣品,操作簡(jiǎn)單,快速。雖然蛋白沉淀法的提取回收率不及提取法,但茶堿血藥濃度監(jiān)測(cè)需要的最低檢測(cè)濃度較高,10%三氟乙酸蛋白沉淀法的最低定量限達(dá)0.2 μg/mL,可較好地滿足試驗(yàn)要求。

        茶堿有效血藥濃度的治療范圍是5~20 μg/mL,當(dāng)藥物濃度達(dá)到15~20 μg/mL時(shí),個(gè)別人群即可發(fā)生輕微的毒性反應(yīng),其在人體內(nèi)的藥物濃度受年齡[10]、生理病理因素[11]和其他藥物的相互作用[1,3]影響,因此建立一個(gè)簡(jiǎn)便的茶堿藥物濃度監(jiān)測(cè)的方法輔助臨床安全用藥十分有意義。本法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、專項(xiàng)性強(qiáng),分離完全,不受臨床用藥干擾,可廣泛用于臨床監(jiān)測(cè)茶堿血藥濃度。

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        Determination of Serum Theophylline Concentration by HPLC

        Kong Xingshan,Zeng Caifang,Yang Jiabin
        (The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong,China 511447)

        Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of theophylline in human plasma.Methods The serum sample was performed the precipitation treatment by 10%trifluoroacetic acid,the chromatographic column was the Inertsil ODS-SP column(250 mm×4.6 mm,5 μm),the mobile phase was consisted of methanol-water(25∶75).The UV detection wavelength was at 274 nm with a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature of 25℃.Results The concentration of theophylline in the range of 2.55-40.72 μg/mL showed good linearity.The regression equation of plasma theophylline concentration and peak area was Y=(45 417.2)X-4 580.0,r=0.999 8(n=6).The intra-day and inter-day RSD were less than 4.88%and 6.06%,and the limit quantitation was 0.2 μg/mL.Conclusion The established method is fast,accurate and suitable for therapeutic dug monitoring (TDM)of theophylline in clinical.

        Key words:theophylline;HPLC;TDM

        中圖分類號(hào):R969.1;R974+.3

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        文章編號(hào):1006-4931(2016)07-0030-03

        作者簡(jiǎn)介:孔幸珊(1987-),女,廣東廣州人,碩士研究生,藥師,主要從事臨床藥學(xué)工作,(電話)020-39195632(電子信箱)kongxingshan@126.com;楊佳彬(1981-),男,廣東廣州人,大學(xué)本科,主管藥師,主要從事臨床藥學(xué)工作,本文通訊作者,(電話)020-39195632(電子信箱)nfyyyjb@126.com。

        收稿日期:(2015-09-27)

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