簡俊濤,王宇娟,宋曉朋,連俊方,周麗敏,安旭堯,孫道杰

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌　712100;2.楊凌區(qū)種子站，陜西楊凌　712100)

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TAPHS1基因序列多態(tài)性與小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性的相關分析

簡俊濤1,王宇娟2,宋曉朋1,連俊方1,周麗敏1,安旭堯1,孫道杰1

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌712100;2.楊凌區(qū)種子站，陜西楊凌712100)

摘要TAPHS1基因是MFT-like基因，可調(diào)控小麥成熟期的籽粒休眠(影響穗發(fā)芽抗性)且與開花的發(fā)育控制相關，位于小麥3A染色體短臂上。為探究該基因序列多態(tài)性與小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性的關系，設計PCR引物擴增 TAPHS1基因的2個高頻變異區(qū)，獲得86個品種相應基因區(qū)段的DNA序列信息；以不同播期之間抽穗期相差時間為指標調(diào)查評價各品種的生殖發(fā)育穩(wěn)定性。結果表明：在 TAPHS1基因的高頻變異區(qū)存在5種多態(tài)性，將其命名為A類、B類、C類、D類、E類；A類、B類、C類屬非編碼區(qū)多態(tài)性，D類及E類同時涉及編碼區(qū)和非編碼區(qū)多態(tài)性；D類及E類序列多態(tài)性與生殖發(fā)育穩(wěn)定性相關，并根據(jù)D類序列信息開發(fā)了分子標記。

關鍵詞TAPHS1基因；小麥；序列多態(tài)性；生殖發(fā)育穩(wěn)定性

TAPHS1基因在小麥中是MFT-like基因，位于3A染色體短臂上，研究表明該基因在小麥中具有調(diào)控穗發(fā)芽的功能，然而在模式植物擬南芥中TAMFT基因具有調(diào)控開花時間的功能[1]。MFT基因屬于MFT-like亞家族且是FT和TFL1的同源物，F(xiàn)T能夠促進開花，然而TFL1延遲開花，它們對開花起相反的調(diào)控作用[2-3]。MFT-like屬PEBP家族基因，在植物中PEBP家族基因編碼的蛋白與磷酸乙醇胺結合蛋白/激酶抑制劑蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP/Raf kinase inhibitor protein，RKIP)非常相似，都含有保守的PEBP/RKIP結構域，在編碼區(qū)占有較大的比重[4-5]。在擬南芥中，MFT通過激素ABA及GA信號途徑調(diào)控種子發(fā)芽，MFT功能缺失的擬南芥在種子發(fā)芽期表現(xiàn)出對ABA高度敏感性，也有研究表明MFT在擬南芥中決定開花時間，在長日照下MFT正常表達使開花時間稍微提前，其作為開花誘導物對成花誘導起到冗余的功能[6-7]。在石斛中MFT調(diào)控生殖生長，過量表達導致開花期推遲[8]，然而海島棉中MFT在花瓣中的表達量較高且該基因的表達不受ABA的調(diào)控[9]。小麥中MFT具有調(diào)控種子休眠的作用，高溫對MFT的轉錄物起上調(diào)作用，低溫及種子儲存時間對此起下調(diào)作用[10-11]。

世界40%以上人口以小麥為主食，小麥為人類提供超過20%的蛋白和能量[12]。近年來隨著氣候變暖，溫度的不斷升高已經(jīng)影響作物生產(chǎn)的穩(wěn)定性[13-14]。在不同年份，降雨、暖冬、倒春寒等導致許多推廣的小麥品種抽穗期、開花期以及成熟期發(fā)生比較大的波動，造成籽粒癟瘦[15]，從而減產(chǎn)。植物完成一定的營養(yǎng)生長后向生殖生長的轉變對植物保障物種穩(wěn)定性及適應周邊的生存環(huán)境非常重要，由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變這一過程受多種因素的調(diào)控：光周期、春化、激素、發(fā)育階段基因內(nèi)調(diào)控[16-17]，這些因素組成一個調(diào)控網(wǎng)絡響應環(huán)境因子，進而調(diào)控開花[18-19]。從進化角度看，植物的抽穗期穩(wěn)定性直接與適應性相關，可以作為適應環(huán)境的一個特征[20]。植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變是植物能否開花的關鍵環(huán)節(jié)。一般植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變是對環(huán)境的高度適應及其內(nèi)在遺傳因子對發(fā)育階段的精確調(diào)控[21]。小麥的成熟與抽穗具有高度相關性，對于成熟期，抽穗期更易于觀察和記載，一般研究小麥生育期常以抽穗期為指標。

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當前推廣的許多小麥品種在不同年份抽穗期、開花期具有較大的波動性，但有些品種抽穗期和開花期卻非常穩(wěn)定。小麥的抽穗及開花受春化基因、光周期基因及早熟性基因影響，研究表明隱性春化基因能夠維持小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性，而光周期基因對生殖發(fā)育穩(wěn)定性的影響不顯著[22]。本研究嘗試從與抽穗開花密切相關的 TAPHS1基因著手，利用已搜集的國內(nèi)各大麥區(qū)主栽小麥品種366份為材料，在不同材料中克隆測序 TAPHS1基因的高頻變異區(qū)，探究該基因的序列多態(tài)性，采用分期播種法，2種播期相差40 d，以2種播期下抽穗期差值作為生殖發(fā)育穩(wěn)定性的評價指標，進行生殖發(fā)育穩(wěn)定性與 TAPHS1基因序列多態(tài)性關聯(lián)性分析，從而確定哪些序列信息與生殖發(fā)育穩(wěn)定性相關，以期探究 TAPHS1基因對小麥生殖發(fā)育的影響，針對 TAPHS1基因多態(tài)性中維持發(fā)育穩(wěn)定性的多態(tài)性設計引物，從而為生殖發(fā)育穩(wěn)定性品種的選育提供分子參考。

1材料與方法

1.1田間種植與管理

以國內(nèi)各大麥區(qū)主栽小麥品種366份為材料，于2011-2013年種植于西北農(nóng)林科技大學北校區(qū)試驗田和河南滎陽試驗田，第1播期在每年10月初種植，采用分期播種法，播期相差40 d，采用隨機區(qū)組設計，每個材料種植2行，行長1 m，行距0.25 m，株距0.02 m。冬前及冬后田間調(diào)查苗相并結合生長過程中的實際表型綜合判定冬春性，每年3月底開始調(diào)查抽穗期。

1.2DNA提取及 TAPHS1基因的克隆、序列分析

在小麥五葉期取材并采用CTAB法提取小麥葉片的基因組DNA?；谛←淭AMFT基因及 TAPHS1基因的高頻變異區(qū)，采用Primer 5.0設計引物MFT-F2170/MFT-R2605(MFT-F2170: GCTGCAGGTGATGACGGAT；MFT-R2605: TGAGAGACACGCAAGAACGAT)，并在Oligo 7.0中進行評價。

根據(jù)TakaRaTaq聚合酶使用說明建立30 μL體系，對PCR產(chǎn)物進行12 g/L瓊脂糖電泳并回收純化，使用PMD18-T載體進行連接轉化，4 ℃過夜后轉化制備的感受態(tài)細胞DH5α。每個材料挑取12個菌落置于2.0 mL裝有LB液體培養(yǎng)基的離心管，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，對菌落進行PCR檢測后送上海生工生物技術服務有限公司進行測序，重復測序3次。使用MegAlign、DNAMAN 6.0軟件及NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的BLAST程序對測序結果進行分析。

1.3 TAPHS1基因不同多態(tài)性對應抽穗期差異的計算方法

不同多態(tài)性抽穗期差異= 兩地同年該多態(tài)性品種分期播種后抽穗期相差時間的和 /(2×該多態(tài)性小麥品種數(shù)量)

1.4多態(tài)性與抽穗期差異的相關分析

采用Microsoft office excel 2007對分期播種下兩年兩地田間調(diào)查的小麥抽穗期進行整理，統(tǒng)計各品種的多態(tài)性類型，用Dpsv 7.05軟件對 TAPHS1基因多態(tài)性與抽穗期相差時間進行相關分析。

2結果與分析

2.1 TAPHS1基因各多態(tài)性所含品種數(shù)量及抽穗期差值的分布情況

完成克隆測序的小麥品種共86個，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) TAPHS1基因包含5種多態(tài)性，將其命名為A類、B類、C類、D類、E類。在5種多態(tài)性中A類材料最多占36.05%，隨后依次是E類占31.39%、D類占19.77%、C類占8.14%、B類占4.65%。D類及E類多態(tài)性材料抽穗期差值總體集中且偏小，A類多態(tài)性材料抽穗期差值分布比較分散且抽穗期差值總體較大。

2.2 TAPHS1基因多態(tài)性與抽穗期差值的相關分析

如表1所示，對 TAPHS1基因多態(tài)性與采用分期播種下抽穗期差值進行相關分析后發(fā)現(xiàn)，D類及E類多態(tài)性使小麥具有穩(wěn)定的抽穗期，抽穗期差值分別為4.53 d及5.05 d，相比其他3類多態(tài)性而言抽穗期差值均達顯著水平；相比B類多態(tài)性而言，D類及E類抽穗期差值均達極顯著水平。B類、C類、A類多態(tài)性使小麥具有不穩(wěn)定的抽穗期。

2.3 TAPHS1基因序列差異分析

通過NCBI查詢后發(fā)現(xiàn)(圖1)，D類及E類多態(tài)性在第54位堿基處由堿基A突變?yōu)镚，該堿基突變發(fā)生在編碼區(qū)，查詢密碼子后，由A-G的突變導致編碼的賴氨酸(Lys)變?yōu)榫彼?Arg)。在D類多態(tài)性中第115位點發(fā)生5倍TATG的重復插入，在第183～190位點伴隨8個堿基的缺失；E類多態(tài)性在第314～316位點發(fā)生GT-AT導致編碼區(qū)發(fā)生錯誤的剪切并在第334位點發(fā)生A-T的堿基突變，提前產(chǎn)生一個終止密碼子從而縮短非功能性轉錄。其他位點堿基的替換、缺失、插入等均發(fā)生在非編碼區(qū)。

表1　 TAPHS1基因多態(tài)性與抽穗期差值的相關性分析

注：同列數(shù)值后不同的大、小寫字母分別表示多態(tài)性間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

Note：The different capital or lowercase letters in the same column indicate differences in polymorphism significant at the 0.01 and 0.05 levels,respectively.

CK.txt表示中國春的MFT基因序列，(A、B、C、D、E).txt分別為 TAPHS1基因的5種多態(tài)性。圖中相同顏色區(qū)域表示堿基相同，不同顏色區(qū)域表示多態(tài)性位點。

CK.txt represents sequence ofMFTgene in Chinese spring,(A、B、C、D、E).txt represent five kinds of polymorphism in the areas of TAPHS1 gene.The same color area in the figure bases are the same,while different color areas represent polymorphic loci.

圖1 TAPHS1基因序列差異分析

Fig.1 Analysis of TAPHS1 gene sequence difference

2.4 TAPHS1基因D類多態(tài)性的分子檢測及其對小麥生殖發(fā)育功能的驗證

針對D類多態(tài)性設計2對引物用于D類多態(tài)性材料的檢測，第1對引物F-2SJ/R-SRP2605(F-2SJ：AATTCCATAGATCTCCACACA ；R-SRP2605：TGAGAGACACGCAAG AACGAT)，第2對引物F-2242/R-SRP2605(F-2242：TGT- ACTACTACTGCTGCTGCT；R-SRP2605：TG- AGAGACACGCAAGAACGAT)。如圖2所示，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，均能夠將D類多態(tài)性和其他4類多態(tài)性區(qū)分開，其中使用第1對引物擴增的結果是：D類多態(tài)性材料的目的片段比其他多態(tài)性材料的目的片段小8 bp或10 bp；第2對引物擴增的結果是：在D類材料中目的片段比其他多態(tài)性材料的目的片段大8 bp或10 bp或14 bp。

M表示梯度為100 bp的MakerM represented 100 bp DNA ladder；使用第1對引物：1～4表示在D類多態(tài)性材料中擴增片段大小為278 bp，5～8表示在其他4種多態(tài)性材料(A類、B類、C類、E類)中擴增的片段Using the first pair of primers: 1-4 represented amplified fragment size of 278 bp in polymorphism of type D,5-8 represented amplified fragment size in polymorphism of type A,type B,type C and type E；使用第2對引物：9～12表示在D類多態(tài)性材料中擴增片段大小為374 bp，13～16表示在其他4種多態(tài)性材料(A類、B類、C類、E類)中擴增的片段Using the second pair of primers: 9-12 represented amplified fragment size of 374 bp in polymorphism of type D,13-16 represented amplified fragment size in polymorphism of type A,type B,type C and type E

圖2 TAPHS1基因D類多態(tài)性的分子檢測

Fig.2Molecular detection of TAPHS1 gene polymorphism of type D

利用開發(fā)的2對標記檢測288份國內(nèi)各大麥區(qū)主栽小麥品種，檢測到53份D類多態(tài)性材料，非D類多態(tài)性材料235份。將D類和非D類材料與抽穗期差值進行相關性分析，抽穗期差值均值分別為4.51 d 、6.08 d，D類多態(tài)性與非D類多態(tài)性材料之間差異顯著(P=0.040 7)，D類多態(tài)性能夠使小麥具有穩(wěn)定的生殖發(fā)育特性。由圖3可知，對D類和非D類材料抽穗期差值分布進行統(tǒng)計，D類多態(tài)性的小麥品種抽穗期差值較小且比較集中，非D類多態(tài)性材料抽穗期差值總體較大且較分散，針對D類多態(tài)性材料抽穗期差值較大的小麥品種進行分析，發(fā)現(xiàn)這些品種為春性或者偏春性，可能春化基因影響這些小麥的生殖發(fā)育特性。

圖3　 TAPHS1基因D類多態(tài)性對

3討 論

小麥由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變受春化基因、光周期基因、早熟性基因及其他開花相關基因的調(diào)控。春化基因、光周期基因及早熟性基因對小麥發(fā)育的影響均有較深的研究[23-25]。MFT基因在不同植物中與抽穗及開花相關，在小麥中MFT基因的同源基因 TAPHS1基因具有調(diào)控穗發(fā)芽的功能。本試驗探索 TAPHS1基因的序列多態(tài)性并研究這些多態(tài)性和小麥生殖發(fā)育的相關性。完成測序的86份國內(nèi)小麥品種中發(fā)現(xiàn)5類多態(tài)性，D類和E類多態(tài)性能夠使小麥具有穩(wěn)定的生殖發(fā)育特性。D類和E類多態(tài)性在編碼區(qū)發(fā)生堿基A-G的突變導致編碼賴氨酸變?yōu)榫彼?，編碼區(qū)單個堿基的突變造成編碼氨基酸的改變，可能影響蛋白質(zhì)結構的變化，這是否影響小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性還需進一步探究；D類多態(tài)性相比E類多態(tài)性而言能夠在較大程度上維持小麥生殖發(fā)育的穩(wěn)定性，相比E類多態(tài)性而言D類多態(tài)性非編碼區(qū)發(fā)生5倍TATG的堿基插入并伴隨連續(xù)8個堿基的缺失，非編碼區(qū)對編碼區(qū)的調(diào)控作用可能是該類多態(tài)性維持生殖發(fā)育穩(wěn)定性的原因。通過NCBI對設計的2對引物進行查詢并比對發(fā)現(xiàn)，D類多態(tài)性序列和小麥 MFT-A1a基因序列一致(登錄號：KF311059.1)，有研究表明該基因的轉錄水平受到高溫的上調(diào)作用，該基因可能對小麥種子休眠機制具有一定的調(diào)控作用，E類多態(tài)性序列和 TAPHS1基因序列一致，該類多態(tài)性可能對種子休眠、穗發(fā)芽、生殖發(fā)育穩(wěn)定性等均有一定的功能。

小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性可能受多個基因的影響，盡管D類多態(tài)性能使小麥具有穩(wěn)定的生殖發(fā)育特性，但D類多態(tài)性中也有個別生殖發(fā)育不穩(wěn)定的品種，針對D類多態(tài)性中生殖發(fā)育不穩(wěn)定的品種進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些品種均為春性或者偏春性，可能陜西楊凌和河南滎陽并不是春性及偏春性品種最佳種植區(qū)域，此外這些生殖發(fā)育不穩(wěn)定的品種還可能受到春化及光周期基因的影響。本試驗材料種植地陜西楊凌及河南滎陽均為黃淮麥區(qū)，2個種植地具有不同的降水、光照等環(huán)境因子，對于本試驗的研究具有代表性，然而本研究所用材料有限，所得結論的科學性尚需在更多材料中去驗證?？傊?，小麥生殖發(fā)育穩(wěn)定性受春化基因、光周期基因、早熟性基因、抽穗及開花其他相關基因的調(diào)控，生殖發(fā)育穩(wěn)定性相關基因的發(fā)掘對生殖發(fā)育穩(wěn)定性品種的選育非常重要。選育生殖發(fā)育穩(wěn)定性的品種能夠應對當前及今后氣候的變暖導致的連陰雨、干旱、暖冬、倒春寒的危害，不因環(huán)境的變化而導致抽穗期及開花期提前或延后從而減少病蟲害的發(fā)生或加重幾率，生殖發(fā)育穩(wěn)定性的品種在不同年度間維持穩(wěn)定的抽穗期能夠使小麥保證完整的生育期并獲得豐收。

4結 論

小麥 TAPHS1基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)在不同品種間具有序列多態(tài)性；在編碼區(qū)發(fā)生的單個堿基突變導致編碼氨基酸的改變可能影響該基因對生殖發(fā)育穩(wěn)定性的功能，非編碼區(qū)堿基的插入及缺失可能對編碼區(qū)具有一定的調(diào)控作用，從而影響生殖發(fā)育特性；除該基因外，春化基因、光周期基因、早熟基因及其他抽穗開花相關基因也可能調(diào)控小麥的生殖發(fā)育特性。

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Received 2015-03-31Returned2015-04-29

Foundation itemNational Program of China (No.2014CB138100,No.2012AA101105); Projects of International Cooperation(No.2012DFA32290); Shaanxi Innovative Research Team for Key Science and Technology (No.2014KCT-25) .

First authorJIAN Juntao,male,master.Research area:crop genetic breeding.E-mail：jjt312024501@163.com

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Correlation Analysis between Polymorphism of TAPHS1 Gene Sequence and Reproductive Stability of Wheat

JIAN Juntao1,WANG Yujuan2,SONG Xiaopeng1,LIAN Junfang1,ZHOU Limin1,AN Xuyao1and SUN Daojie1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China；2.Yangling Seed Station,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractTAPHS1 gene,also called MFT-like gene,which could regulate and control wheat grain dormancy,affected harvest sprouting resistance,and was also related to flowering developmental control,existed in the short arm of 3A chromosome in the wheat.In order to explore the correlation between polymorphism of TAPHS1 gene sequence and reproductive stability of wheat,this study,by designing PCR primers to amplify two hypermutation areas of TAPHS1 gene,obtained DNA sequence information of corresponding gene segments in 86 varieties of wheat.Number of day discrepancy of heading stage,which was based on different sowing periods,was adopted as the index to survey and assess reproductive stability of different varieties.The results showed that,there are five kinds of polymorphism in the hypermutation areas of TAPHS1 gene,named as type A,type B,type C,type D,and type E.Type A,B,and C belong to noncoding region polymorphism,while type D and E involve both coding and noncoding region polymorphism.Polymorphism of type D and E is closely related to reproductive stability.The molecular markers were made based on sequence information of type D.

Key wordsTAPHS1 genes; Wheat; Polymorphism of gene sequence; Reproductive stability

收稿日期：2015-03-31修回日期：2015-04-29

基金項目：國家計劃項目(2014CB138100，2012AA101105)；國際科技合作專項(2012DFA32290)；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊(2014KCT-25)。

通信作者：孫道杰,男,副研究員,博士,主要從事作物遺傳育種研究。 E-mail：chinawheat@hotmail.com

中圖分類號S512.1；S330

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0523-07

Corresponding authorSUN Daojie,male,associate researcher,Ph.D.Research area:crop genetic breeding.E-mail：chinawheat@hotmail.com

網(wǎng)絡出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.014.html

第一作者：簡俊濤,男,在讀碩士,從事作物遺傳育種研究。E-mail：jjt312024501@163.com