謝　歡，周　穎， 楊文香，張　娜，劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 植物病理系，河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 河北保定　071001)

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TcLr24小麥NBS-LRR同源基因的克隆與分析

謝歡，周穎， 楊文香，張娜，劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 植物病理系，河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心, 河北保定071001)

摘要目前已克隆的小麥抗葉銹病基因多數(shù)含有NBS類(lèi)保守結(jié)構(gòu)域，為克隆高抗葉銹病 Lr24基因及其抗病相關(guān)基因，根據(jù)NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)小麥抗葉銹病近等基因系TcLr24 cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到534 bp的抗病基因同源序列。對(duì)該序列進(jìn)行同源性檢索并驗(yàn)證，獲得1 408 bp的電子延伸序列。以此通過(guò)RACE 技術(shù)分別獲取2 797 bp 和3 466 bp的cDNA與gDNA全長(zhǎng)產(chǎn)物，其翻譯的蛋白質(zhì)序列含有NBS保守區(qū)的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守結(jié)構(gòu)，與大麥等單子葉植物NBS類(lèi)蛋白序列同源性較高，生物信息學(xué)分析表明其為穩(wěn)定的親水性蛋白，分子質(zhì)量104.28 ku，理論等電點(diǎn)6.15。半定量RT-PCR表明該片段所在基因序列為組成型表達(dá)。

關(guān)鍵詞小麥；TcLr24；抗病基因同源序列；NBS

小麥(TriticumaestivumL.)葉銹病在世界各產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生，是小麥的主要病害之一，嚴(yán)重時(shí)可造成15%～40%甚至更大的產(chǎn)量損失[1]。合理利用抗病品種是該病害防治中最安全、經(jīng)濟(jì)和有效的方法?？共』蚝涂共∠嚓P(guān)基因的克隆對(duì)病原物與寄主互作研究及抗病品種的培育具有重要意義。

同源序列法是分離克隆基因最經(jīng)濟(jì)、快捷的途徑之一，其中NBS-LRR類(lèi)抗病基因類(lèi)似序列是單子葉植物抗病基因最大的一類(lèi)，目前已經(jīng)從多種經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物中分離獲得大量NBS類(lèi)抗病基因同源序列，并且通過(guò)同源序列法結(jié)合圖位克隆法從小麥中克隆獲得的抗葉銹病基因 Lr1[2]、 Lr10[3]、 Lr21[4]均含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)。因此，NBS類(lèi)抗病相關(guān)基因同源序列的分離對(duì)抗病基因的分離克隆具有重要意義。

小麥抗葉銹病基因 Lr24在生產(chǎn)上已表現(xiàn)出較好的抗葉銹性，具有很大的應(yīng)用潛力。該基因目前獲得多個(gè)相關(guān)的分子標(biāo)記[5]；利用RACE方法獲得編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、受體激酶、LRR-受體激酶的基因，并用基因沉默技術(shù)對(duì)3個(gè)激酶基因進(jìn)行初步的功能分析。分離獲得 Lr24介導(dǎo)抗病性所必需的TaRAR基因[6]。此外，張立榮等[7]從TcLr24中獲得2 822 bp的cDNA全長(zhǎng)RGA1Q，其編碼產(chǎn)物具有NBS、LRR等抗病基因保守結(jié)構(gòu)域，在TcLr24基因組中呈單拷貝、組成型表達(dá)。這些研究對(duì) Lr24基因的輔助選擇及抗病育種、基因分離及其相關(guān)功能研究具有指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。但是，抗病基因及其相關(guān)基因多以基因簇存在，因此要分離克隆抗病基因還需大量工作。本研究根據(jù)NBS類(lèi)抗病基因保守結(jié)構(gòu)合成簡(jiǎn)并性引物，利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)，從葉銹菌誘導(dǎo)的小麥葉片cDNA中擴(kuò)增抗病基因同源序列，以期為克隆抗病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料選擇與處理

選用小麥抗葉銹病單基因系TcLr24盆栽，待幼苗長(zhǎng)至1葉1心時(shí)分別接種對(duì)TcLr24表現(xiàn)低毒力的葉銹菌單孢菌系88-26-12-4(BGQQ)，另設(shè)不接菌對(duì)照，分別于處理0、6、12、24、48、72和96 h取試驗(yàn)材料。

1.2主要方法

1.2.1NBS類(lèi)抗病基因同源片段的分離將接菌處理TcLr24樣品不同時(shí)間點(diǎn)的RNA樣品等量混合成總RNA池，參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)說(shuō)明書(shū)合成反應(yīng)所需的cDNA第1鏈。以根據(jù)NBS類(lèi)保守結(jié)構(gòu)域GGVGKTT和GLPLAL合成的引物，對(duì)cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2NBS類(lèi)抗病基因同源序列的RACE擴(kuò)增以TcLr24 cDNA擴(kuò)增出的534 bp片段為靶序列電子延伸至1 408 bp，并以此分別設(shè)計(jì)3′端正向基因特異引物(5′-CTTGTTCAATCAGGGA- TGGCCTTGGATA-3′)和5′端反向基因特異性引物(5′-GCTCAAGAACAGTTCCCATGAAG-CATCG-3′)，按照RACE 試劑盒(Clontech)使用說(shuō)明進(jìn)行操作，分別對(duì)其進(jìn)行3′RACE和5′RACE擴(kuò)增，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆及測(cè)序。

1.2.3RACE序列的拼接和驗(yàn)證利用DNAMAN軟件將所獲得的5′和3′端的cDNA序列與已知靶序列進(jìn)行拼接，并預(yù)測(cè)拼接序列的開(kāi)放閱讀框，在開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)驗(yàn)證引物Y61QCYZ124和Y61QCYZ2920，以TcLr24的cDNA和gDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序，將獲得的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.4半定量RT-PCR分析選取在小麥中組成型表達(dá)的基因Actin作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)調(diào)整模板質(zhì)量濃度，使內(nèi)標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量一致，用于基因的表達(dá)分析。

2結(jié)果與分析

2.1同源序列的擴(kuò)增及序列分析

用NBS類(lèi)R基因簡(jiǎn)并性引物，以TcLr24的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1條500 bp左右的目的片段(圖1)，與預(yù)期片段大小相同。將目的條帶進(jìn)行回收克隆，片段經(jīng)測(cè)序長(zhǎng)534 bp，全序列與大麥NBS-LRR 抗病蛋白b1部分序列同源性92%。

根據(jù)與534 bp序列同源的大麥1 455 bp(118～1 454 bp為完整的ORF序列)序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)TcLr24的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序拼接后序列長(zhǎng)為1 408 bp，將該序列向3′端延長(zhǎng)874 bp。該序列翻譯后通讀，含有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)。

以1 408 bp為靶序列，使用設(shè)計(jì)的3′端正向基因特異引物和5′端反向基因特異引物，應(yīng)用Touchdown PCR進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)檢測(cè)分別獲得1 528 bp 的3′端產(chǎn)物和1 129 bp的5′端產(chǎn)物。與靶序列拼接后獲得全長(zhǎng)為3 087 bp的片段(命名為Y61)，編碼919個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列。具有148 bp的5′非翻譯區(qū)，150 bp 的3′非翻譯區(qū)和29 bp的多聚腺苷酸尾。該序列翻譯的蛋白質(zhì)序列含有NBS保守區(qū)的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD保守結(jié)構(gòu)和LRR保守結(jié)構(gòu)。

M. DL2000

2.2全長(zhǎng)cDNA和DNA的獲得

在拼接序列的開(kāi)放閱讀框兩端設(shè)計(jì)全長(zhǎng)驗(yàn)證引物QC124和QC2920，并以TcLr24的gDNA、cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在gDNA和cDNA中均獲得1條3.0 kb左右(3 466 bp，2 797 bp)的擴(kuò)增片段 (圖2)，分別克隆測(cè)序，并將序列提交到NCBI比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/)，顯示該基因含1個(gè)長(zhǎng)為669 bp的內(nèi)含子，2個(gè)長(zhǎng)分別為655 bp和2 142 bp的外顯子。

M. DL2000

2.3生物信息學(xué)分析

2.3.1序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將所獲得cDNA全長(zhǎng)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTx分析，結(jié)果顯示，其所編碼蛋白與大麥(H.vulgare)、山羊草(Aegilopstauschii)、谷子(Setariaitalica)、小麥(T.aestivum)、燕麥(Avenasativa)、玉米(Zeamays)等植物的NBS-LRR抗病蛋白的同源性較高(圖3)。進(jìn)一步采用Mega4構(gòu)建其與其他植物抗病相關(guān)蛋白的進(jìn)化樹(shù)(圖4)，發(fā)現(xiàn)種間距離Y61與山羊草(EMT01263.1)遺傳距離最近。

2.3.2Y61編碼蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)分析利用SMART軟件進(jìn)行保守域預(yù)測(cè)，該序列包含1個(gè)NB-ARC結(jié)構(gòu)域(N端191-450)和2個(gè)富含亮氨酸基序(LRR，562-595)，且含有2段簡(jiǎn)單組分結(jié)構(gòu)，每個(gè)LRR序列含有22～24個(gè)氨基酸。

使用 Neural Networks(NN)和Hide Markov Models( HMM)2種模型對(duì)Y61氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽切割位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，Y61蛋白為非分泌性蛋白，不存在信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。利用TMHMM預(yù)測(cè)Y61蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該序列不存在跨膜信號(hào)。

圖3　Y61蛋白序列與NBS-LRR蛋白序列比較

圖4　Y61蛋白與其他植物NBS-LRR抗病蛋白序列聚類(lèi)分析

利用ProtScale工具對(duì)Y61蛋白的疏水性進(jìn)行分析，除在第800位氨基酸后有1個(gè)較大的親水區(qū)，表明該蛋白是親水性蛋白。ProtParam分析蛋白序列，其中亮氨酸(L)最多，有131個(gè)，占氨基酸總數(shù)的14.3%。該蛋白的分子質(zhì)量為104.28 ku，等電點(diǎn)6.15，平均疏水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.137。不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為40.01，表明該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。

利用ExPaSy中的SOPMA軟件預(yù)測(cè)Y61蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白含約61.48%的α-螺旋(α-helix，H)、2.29%的β-轉(zhuǎn)角(β-turn，T)、27.53%的無(wú)規(guī)則卷曲(random coil，C)和8.71%的延伸鏈(Extended strand，E)。

2.4同源序列的半定量RT-PCR

以Actin為內(nèi)標(biāo)引物對(duì)TcLr24接菌處理0、6、12、24、48、72和96 h后的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，調(diào)整不同時(shí)間點(diǎn)cDNA的質(zhì)量濃度(圖5-A)。用該基因特異性引物對(duì)TcLr24不同時(shí)間點(diǎn)的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，表明不同時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)增量未見(jiàn)明顯差異(圖5-B)，說(shuō)明該片段所在基因序列為組成型表達(dá)。

A.Actin內(nèi)標(biāo)引物　Actin internal control primers；B. NBS特異引物　NBS specific primers

3討 論

NBS-LRR類(lèi)R基因在已知的抗病基因中占很大一部分。NBS結(jié)構(gòu)域由3個(gè)區(qū)域組成，其中，第1區(qū)域?yàn)榱姿峤Y(jié)合環(huán)(P-Loop)，又稱(chēng)激酶(Kinase)la， 主要與ATP或GTP的磷酸結(jié)合；第2區(qū)域?yàn)榧っ?Kinase)2a；第3區(qū)域?yàn)榧っ?Kinase)3a，與核糖或DNA的嘌呤結(jié)合有關(guān)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)分析，抗病基因在行使抗病功能時(shí)需要結(jié)合ATP或GTP。擬南芥RPM1基因的NBS區(qū)的點(diǎn)突變使其在轉(zhuǎn)基因植株中不能誘導(dǎo)過(guò)敏性反應(yīng)[8]，而煙草N基因中20多個(gè)NBS區(qū)的氨基酸的代換，一些代換使N基因喪失部分抗性，而另一些則使抗病性完全喪失[9]。因此，抗病基因的NBS保守結(jié)構(gòu)域可能與病原誘發(fā)子或激發(fā)子(elicitor)及抗病基因信號(hào)傳導(dǎo)的下游蛋白的相互作用的特異性有關(guān)[10]。LRR中單一氨基酸的變化都會(huì)導(dǎo)致抗病反應(yīng)消失或減弱[11]。

本研究從TcLr24中獲得全長(zhǎng)3 087 bp的NBS類(lèi)小麥抗病基因同源序列，包含完整NBS結(jié)構(gòu)域，且含有NBS-LRR類(lèi)抗病基因的高度保守區(qū)，LRR區(qū)域與大麥LRR僅有1個(gè)氨基酸差異(第359位氨基酸)，可能在該位點(diǎn)存在堿基替換，但二者功能是否一致尚未知。此外，通過(guò)與粗山羊草、玉米、大麥、燕麥、谷子及前人從小麥中獲得的NBS-LRR類(lèi)蛋白進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，該研究獲得序列與粗山羊草和谷子的序列較近，而與其他幾個(gè)單子葉植物的抗病蛋白類(lèi)似物同源性較低。任曉娣等[12]、張楠等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，即使從同一材料(TcLr19)分離得到的不同抗病基因類(lèi)似物，其同源性高低也不完全相同；另外，不同抗葉銹病基因NBS-LRR結(jié)構(gòu)的同源性也比較低[12]。因此，其與 Lr24抗病基因的關(guān)系還需進(jìn)一步連鎖分析、功能鑒定等才能確定。該目的基因的獲得及其生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究該基因功能提供理論參考。

參考文獻(xiàn)Reference：

[1]KOLMER J,CHEN X,JIN Y.Diseases which challenge global wheat production-the wheat rusts[M]//Carver B F.Wheat Science and Trade.Wiley-Blackwell,USA:Oklahoma State University,2009:89-124.

[2]CLOUTIER S,McCALLUM B D,LOUTRE C,etal.Leaf rust resistance gene Lr1,isolated from bread wheat (TriticumaestivumL.) is a member of the large psr567 gene family[J].PlantMolecularBiology,2007,65(1-2):93-106.

[3]FEUILLET C,TRAVELLA S,STEIN N,etal.Map-based isolation of the leaf rust disease resistance gene Lr10 from the hexaploid wheat (TriticumaestivumL.) genome[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2003,100(25):15253-15258.

[4]HUANG L,STEVEN A B,LI W L,etal.Map-based cloning of leaf rust resistance gene Lr21 from the large and polyploid genome of bread wheat[J].Genetics,2003,164(2):655-664.

[5]ZHANG N,YANG W X,LIU D Q.Identification and molecular tagging of leaf rust resistance gene ( Lr24) in wheat[J].AgriculturalScienceinChina,2011,10(12):1898-1905.

[6]ZHANG L R,YANG W X,LIU D Q.TaRAR1 is required for Lr24-mediated wheat leaf rust resistance[J].AgriculturalScienceinChina,2011,10(11):1732-1738.

[7]張立榮,楊文香,劉大群.小麥NBS-LRR類(lèi)抗病基因同源cDNA序列的分離與鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2011,12(3):431-436.

ZHANG L R,YANG W X,LIU D Q.Cloning and character of resistsnce homologenes contained NBS-LRR in wheat TcLr24[J].JournelofPlantGeneticsResources,2011,12(3):431-436 (in Chinese with English abstract).

[8]BOYES D C,NAM J,DANGL J,etal.TheArabidopsisthalianaRPMIdisease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degrade coincident with the hypersensitive response[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1998,95(26):15849-15854.

[9]BENT A F.Plant disease resistance genes:function meets structure[J].PlantCell,1996,8(10):1757-1771.

[10]MEYERS B C,ALLAN W,RICHARD W.Plant disease resistance gene encode members of an ancient and diverse protein family within the nucleotide binding superfamily[J].ThePlantJournal,1999,20(3):317-332.

[11]WARREN R F,HENK A,MOWERY P,etal.A mutation within the leucine-rich repeat domain of theArabidopsisdisease resistance geneRPS2 partially suppresses multiple bacterial and downy midew resistance genes[J].PlantCell,1998,10:1439-1450.

[12]任曉娣,劉彥慧,李建嫄,等.小麥NBS-LRR類(lèi)抗病基因同源cDNA序列的克隆與表達(dá)分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(2):69-74,79.

REN X D,LIU Y H,LI J Y,etal.Cloning and expression analysis of a NBS-LRR resistance gene homology cDNA sequence from wheat[J].JournelofAgriculturalUniversityofHebei,2013,36(2):69-74,79 (in Chinese with English abstract).

[13]張楠,王海燕,劉大群.小麥NBS類(lèi)抗病基因同源cDNA序列的克隆與特征分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(5):605-610,615.

ZHANG N,WANG H Y,LIU D Q.Cloning and characterization of a NBS resistance gene homology cDNA sequence from wheat[J].JournalofPlantGeneticResources,2010,11(5):605-610,615 (in Chinese with English abstract).

Received 2015-07-01Returned2015-10-08

Foundation itemNational Program on Key Basic Research Project (973 Program) (No.2013CB127700); Doctoral Foundation of Ministry of Education of China (No.20101302120005); Science and Technology Research Projects of Hebei Educational Committee (No.Q2012010).

First authorXIE Huan, female, master student. Research area: molecular plant pathology. E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

LIU Daqun,male,professor,Ph.D.Research area:molecular plant pathology and bio-control of plant disease.E-mail:ldq@hebau.edu.cn

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation and Characterization of NBS-LRR Homologue from TcLr24

XIE Huan, ZHOU Ying, YANG Wenxiang, ZHANG Na and LIU Daqun

(Department of Plant Pathology, Agricultural University of Hebei, Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province, National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding Heibei071001,China)

AbstractConserved domain of NBS is mostly contained in the cloned wheat leaf rust resistance (Lr) genes. In order to clone high resistant gene Lr24 and its related genes, NBS like conserved primers were designed and 534 bp target fragment was isolated from cDNA of TcLr24,1 408 bp electronic extended sequence was acquired and verified. Then full-length products with 2 797 bp and 3 466 bp were isolated from cDNA and gDNA of TcLr24, respectively. It showed high homology to some NBS type resistance protein like Hordeum vulgare. Conserved domain of P-loop,Kinase 2a,Kinase 3a, and HD of NBS, and LRR domain were contained in this sequence. Bioinformatics analysis showed it was a hydrophilic protein with good stability, and with molecular weight 104.28 ku and theoretical isoelectric point 6.15. It implied the constitute expression model of this gene by semi-quantitative RT-PCR. The results provide basis for further study on cloning the leaf rust resistance genes in wheat.

Key wordsWheat; TcLr24; Resistance genes homologous sequences; NBS

收稿日期：2015-07-01修回日期：2015-10-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2013CB127700)；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)基金(20101302120005)；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃(Q2012010)。

通信作者：張娜，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)。E-mail: zn0318@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)S435

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)04-0518-05

Corresponding authorZHANG Na, female, associate professor, Ph.D.Research area:molecular plant pathology.E-mail:zn0318@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.012.html

第一作者：謝歡，女，碩士，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)。E-mail: xiehuan1020@foxmail.com

劉大群，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锊『ι锓乐魏头肿又参锊±韺W(xué)。E-mail: ldq@hebau.edu.cn