鮑長(zhǎng)磊，何亞鵬，張　琪，許信剛，張彥明，付明哲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌　712100)

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山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

鮑長(zhǎng)磊，何亞鵬，張琪，許信剛，張彥明，付明哲

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要根據(jù)GenBank已登錄的GTPV基因組序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物，以GTPV疫苗株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得 ORF103基因片段并進(jìn)行序列分析，再將該基因片段亞克隆于原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET- ORF103，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。成功克隆GTPV疫苗株 ORF103基因片段。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)分子質(zhì)量約為35 ku的重組蛋白，該蛋白能與山羊痘陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。研究結(jié)果為GTPV的分子生物學(xué)特性研究提供資料，并為進(jìn)一步研制GTPV抗體檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞山羊痘病毒； ORF103基因；基因克隆；序列分析；原核表達(dá)

山羊痘(Goatpox)是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)引起山羊的一種高度接觸性傳染病，主要以發(fā)熱、呼吸困難、流黏液性或膿性鼻液及在皮膚黏膜出現(xiàn)痘疹為特征，病死率較高，能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[1-3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病，中國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。GTPV屬痘病毒科(Poxiridae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，是在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙股DNA病毒，共有147個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其序號(hào)按照1條單鏈5′到3′的順序依次編號(hào)為001～156[4-5]。該基因組結(jié)構(gòu)在功能上分為2部分，其中心區(qū)( ORF024～ORF123)構(gòu)成1部分，包含與其他痘病毒同源的保守序列，編碼病毒復(fù)制所需的蛋白，主要在病毒的轉(zhuǎn)錄、RNA修飾、DNA復(fù)制以及病毒粒子組裝等過(guò)程中發(fā)揮作用[6]。另1部分則由2個(gè)末端基因組區(qū)組成( ORF1～ORF23和 ORF124～ORF156)，由一些推測(cè)可能具有毒力和宿主范圍的基因組成[7]。 ORF103分布在基因組的保守區(qū)，為病毒粒子核心蛋白，在病毒顆粒組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。本試驗(yàn)對(duì)山羊痘 ORF103基因進(jìn)行克隆，并應(yīng)用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)ORF103蛋白氨基酸序列的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性，以期了解ORF103蛋白的分子結(jié)構(gòu)特征，為探究山羊痘病毒分子生物學(xué)及其裝配機(jī)制奠定基礎(chǔ);其次構(gòu)建GTPV ORF103基因的原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，為下一步研究GTPV血清學(xué)診斷抗原奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1病毒、菌種和質(zhì)粒山羊痘病毒(GTPV)弱毒疫苗株AV41為山東綠都生物科技有限公司產(chǎn)品；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態(tài)細(xì)胞Trans5a、BL21為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET-28a質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑各種內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)于NEB公司；2×EsTaqMasterMix、DL2 000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、廣譜蛋白Marker購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Blue plus Ⅱ Protein Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；IPTG購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3血清GTPV陽(yáng)性血清為采自臨床免疫過(guò)GTPV弱毒疫苗株AV41的羊血清。

1.2方 法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的山羊痘病毒基因組序列(AY077835.1)，通過(guò)NCBI ORF Finder工具查詢 ORF103基因序列，利用Premier 5.0設(shè)計(jì) ORF103的特異性引物(ORF103-F/ORF103-R)，上游引物:5′-CGCGGATCCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物:5′-CCGCTCGAGATCCATACCATCGTCGATAG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為570 bp，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2病毒基因組DNA的提取取200 μL稀釋的弱毒疫苗，根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組DNA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 ORF103基因的擴(kuò)增以提取的GTPV基因組DNA為模板，50 μL PCR反應(yīng)體系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。膠回收 ORF103目的片段，連接至pEASY-T1載體并轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并PCR鑒定，提取陽(yáng)性質(zhì)粒并命名為pEASY-T1-ORF103。

1.2.4原核表達(dá)載體pET- ORF103的構(gòu)建BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pEASY-T1-ORF103及pET-28a空質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切產(chǎn)物。T4連接酶將回收的 ORF103目的片段與線性化pET-28a質(zhì)粒于4 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α中。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定后送華大基因(北京)測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET- ORF103。

1.2.5 ORF103的序列分析及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用NCBI BLAST功能將 ORF103 測(cè)序結(jié)果與GenBank已收錄的羊痘病毒基因組DNA序列( KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)進(jìn)行比對(duì)。利用Internet在線軟件預(yù)測(cè) ORF103編碼蛋白的信號(hào)肽 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star軟件預(yù)測(cè)分析蛋白的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性。

1.2.6重組蛋白ORF103的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET- ORF103和pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取單克隆，37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按φ=1% 轉(zhuǎn)接5 mL新鮮LB培養(yǎng)基后，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(約3～3.5 h)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)5 h后收集1.5 mL菌液的菌體，100 μL PBS洗滌1次后用100 μL PBS重懸，超聲裂解30 min。加入100 μL 2×Loading Buffer混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取5 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE。

其他條件不變，摸索不同IPTG終濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)時(shí)間(3～6 h)對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響，優(yōu)化重組蛋白表達(dá)的條件。

1.2.7重組蛋白ORF103表達(dá)形式分析在最佳誘導(dǎo)條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.2.8ORF103蛋白的Western blot分析將重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE后，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h。以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h后，以1∶500倍稀釋的山羊痘陽(yáng)性血清4 ℃孵育PVDF膜過(guò)夜。TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。將PVDF膜以1∶5 000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體室溫孵育2 h，TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。ECL反應(yīng)液孵育PVDF膜，暗室壓片曝光。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

以GTPV弱毒疫苗株AV41提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到570 bp的 ORF103基因片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。

2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET- ORF103經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，同時(shí)雙酶切pET-28a載體作陰性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)570 bp的目的條帶和5 369 bp的載體條帶，載體條帶與陰性對(duì)照大小相同，目的條帶與PCR鑒定相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2)。

2.3 ORF103的序列分析及編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

NCBI BLAST后發(fā)現(xiàn) ORF103測(cè)序結(jié)果與GenBank已收錄的羊痘病毒基因組DNA序列(KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)相似性在97%以上，表明GTPV的 ORF103基因較為保守。利用Internet在線軟件預(yù)測(cè)ORF103氨基酸序列，結(jié)果表明該氨基酸序列沒(méi)有信號(hào)肽(圖3)和跨膜區(qū)(圖4)。利用DNA Star分析ORF103多肽氨基酸序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

M. DNA marker DL2000；1. ORF103擴(kuò)增產(chǎn)物Amplification of ORF103

圖1 ORF103基因的擴(kuò)增

Fig.1Amplification of ORF103 gene by PCR

M. DNA marker DL10000；1. pET-28a 經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a digested usingBamH ⅠandXhoⅠ；2. pET- ORF103經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET- ORF103 digested usingBamHⅠandXhoⅠ；3.PET- ORF103 PCR鑒定 Identification of pET- ORF103 by PCR

圖2重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.2Digestion identifications of recombinant plasmid

圖3　信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4　跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

圖5　ORF103蛋白序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性分析

2.4重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

其他條件不變，使用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示當(dāng)IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，重組蛋白ORF103表達(dá)量最大(圖6)；在不同誘導(dǎo)時(shí)間(3～6 h)下，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)6 h后，重組蛋白ORF103表達(dá)量顯著增加(圖7)。pET-28a空質(zhì)粒對(duì)照組和pET- ORF103未誘導(dǎo)對(duì)照組均沒(méi)有重組蛋白的表達(dá)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker；1. 誘導(dǎo)pET-28aInduced cells containing pET-28a；2. 未誘導(dǎo)pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分別用終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG, respectively

圖6不同濃度IPTG對(duì)ORF103重組

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.6Effects of different IPTG concebtration on

expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker；1. 誘導(dǎo)pET-28a Induced cells containing pET-28a；2. 未誘導(dǎo)pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分別誘導(dǎo)3，4，5，6 h的pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced for 3, 4, 5 and 6 h，respectively

圖7不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)ORF103

重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.7Effects of different induction time on

expression of ORF103 fusion protein

2.5重組蛋白ORF103表達(dá)形式的分析

在最佳誘導(dǎo)條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示重組蛋白ORF103以包涵體的形式存在(圖8)。

2.6重組蛋白的Western blot分析

Western blot結(jié)果顯示，ORF103重組蛋白能與山羊痘陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶，而與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染空載體pET-28a的重組菌不反應(yīng)(圖9)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker；1. 菌液上清Supernatant of lysogeny broth；2. 菌體裂解上清Soluble lysates；3. 菌體裂解沉Insoluble lysates

圖8ORF103重組蛋白表達(dá)形式分析

Fig.8Form of expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Protein marker；1. ORF103重組蛋白ORF103 fusion protein；2. pET-28a對(duì)照菌pET-28a control

圖9ORF103重組蛋白的Western blot結(jié)果

Fig.9Western blot analysis of ORF103 fusion protein

3討 論

本研究成功克隆GTPV疫苗株AV41 ORF103的全長(zhǎng)基因，并將其與NCBI上登錄的其他GTPV毒株的 ORF103基因進(jìn)行核苷酸序列比較分析。結(jié)果表明，該疫苗株與其他GTPV毒株的核苷酸序列相似性超過(guò)97%，其中與中國(guó)福建分離株FZ毒株同源性最高，核苷酸同源達(dá)100%，表明GTPV的 ORF103基因較為保守。利用在線生物軟件預(yù)測(cè)ORF103蛋白序列，分析表明ORF103蛋白沒(méi)有信號(hào)肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸抗原性和親水性分析表明，ORF103具有較強(qiáng)的抗原性和親水性。且抗原性峰值和親水性峰值基本同步。 ORF103基因編碼的蛋白具有良好的抗原性，成為臨床上診斷GTPV感染的理想抗原，必將在GTPV的診斷及血清學(xué)調(diào)查中發(fā)揮巨大作用。

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有方便、高效、簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。雖然表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法進(jìn)行正確的糖基化修飾及容易形成不溶性包涵體，但應(yīng)用于與功能活性無(wú)關(guān)的免疫學(xué)研究仍然十分理想[9]。本試驗(yàn)將 ORF103基因克隆于pET-28a原核表達(dá)載體T7啟動(dòng)子的下游，與His-tag同框融合，構(gòu)建pET- ORF103原核表達(dá)載體，并在宿主菌BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)GTPV ORF103蛋白。表達(dá)的分子質(zhì)量約為35 ku，與預(yù)期結(jié)果相符，這也與李慧霞等[10]原核表達(dá)的ORF103蛋白大小一致。

羊痘分布范圍很廣，主要分布于非洲、亞洲、印度次大陸、歐洲部分地區(qū)。該病在中國(guó)的廣東、廣西、江蘇、貴州、甘肅、山東、浙江、黑龍江等地均有發(fā)生，部分地區(qū)呈暴發(fā)性流行[11]。羊痘對(duì)流行區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成很大危害，但目前尚沒(méi)有方便、有效的檢測(cè)方法用于畜產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易和羊痘的流行病學(xué)檢測(cè)。雖然山羊痘血清學(xué)診斷技術(shù)很多，比如瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、對(duì)流免疫電泳技術(shù)(CIE)、熒光抗體技術(shù)(FAT)、反向間接血凝試驗(yàn)(RPHA)和正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)[12]。但是這些方法都存在一定局限性，或操作不方便，或特異性不強(qiáng)，或敏感性不高。近年來(lái)，ELISA 方法因其操作方便、快速、敏感、特異性強(qiáng)、便于自動(dòng)化，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各種病原抗原或抗體的檢測(cè)。本試驗(yàn)利用大腸埃希菌成功表達(dá)ORF103蛋白，Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的ORF103蛋白能與羊痘陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，表明表達(dá)的ORF103蛋白具有很好的反應(yīng)原性，可以作為ELISA診斷試劑盒的候選抗原，為后續(xù)ELISA診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

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Received 2015-12-06Returned2015-12-21

Foundation itemScientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2015NY162)；Technology Achievement Project of Demonstration Station (Base) of Northwest A&F University(No.TGZX2015-32).

First authorBAO Changlei,male,master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:1250038797@qq.com

ZHANG Yanming,male,Ph.D,professor.Research area:microbiology and immunology. E-mail: zhangym@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Cloning, Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of ORF103 Gene of Goatpox Virus Vaccine Strain

BAO Changlei,HE Yapeng,ZHANG Qi,XU Xingang,ZHANG Yanming and FU Mingzhe

(College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractAccording to the published sequence of ORF103 gene of GTPV, a pair of specific primers were designed and synthesized. The ORF103 gene was amplified by PCR from goatpox virus vaccine strain. ORF103 gene sequence was analyzed and cloned into pET-28a vector. The prokaryotic expression plasmid pET- ORF103 containing ORF103 gene was successfully constructed. The expression of recombinant plasmid pET- ORF103 in BL21 was induced and detected by SDS-PACE and Western blot analysis. ORF103 gene was successfully obtained. SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein had molecular weight of about 35 ku by IPTG induction. Western blot analysis showed that the fusion protein had well reactiongenicity. These results provide basic information of ORF103 gene and protein in goatpox virus vaccine strain. Further more, the ORF103 protein can be used to prepare GTPV antibody detection kit.

Key wordsGoatpox virus； ORF103 gene；Gene clone；Sequence analysis；Prokaryotic expression

收稿日期：2015-12-06修回日期：2015-12-21

基金項(xiàng)目：陜西省科技攻關(guān)(2015NY162)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

通信作者：付明哲，男，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向?yàn)檠虿W(xué)。E-mail：286567031@qq.com

中圖分類(lèi)號(hào)S852. 61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)04-0502-06

Corresponding authorFU Mingzhe, male,master,senior veterinary officer.Research area: sheep disease. Email:286567031@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.008.html

第一作者：鮑長(zhǎng)磊，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿硬≡瓕W(xué)與免疫學(xué)。E-mail：1250038797@qq.com

張彥明，男，博士，教授，研究方向?yàn)榉肿硬≡瓕W(xué)與免疫學(xué)。E-mail：zhangym@nwsuaf.edu.cn