王　龍，郭　瑞，路等學(xué)，秦　鵬，趙玉卉

(甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅省工業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，蘭州　730000)

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羊肚菌物種多樣性研究現(xiàn)狀

王龍，郭瑞，路等學(xué)，秦鵬，趙玉卉

(甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅省工業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，蘭州730000)

摘要羊肚菌Morchella spp.是一類珍稀食藥用真菌，具有重要的經(jīng)濟和科研價值。對羊肚菌的傳統(tǒng)分類研究、生態(tài)位特征、生活史、生活習性及其分子生物學(xué)等方面的研究成果進行綜述，總結(jié)現(xiàn)階段羊肚菌研究取得的主要成績；此外，簡述甘肅甘南藏族自治州有關(guān)野生羊肚菌資源的研究現(xiàn)狀，分析目前當?shù)匾吧蚨蔷Y源研究中存在的問題，并指出解決這些問題的相應(yīng)思路，為甘肅甘南藏族自治州野生羊肚菌的可持續(xù)開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞羊肚菌；物種多樣性；分子生物學(xué)；甘肅省；綜述

羊肚菌Morchellaspp.俗稱羊雀菌、羊肚菜或草笠竹，隸屬子囊菌亞門Ascomycotina，盤菌綱Discomycetes，盤菌目Pezizales，羊肚菌科Morchellacea，羊肚菌屬Morchella，因其菌蓋表面具有棱脊型的網(wǎng)狀體，外觀極似羊肚而得名[1]。羊肚菌富含各類氨基酸和維生素，又因其肉質(zhì)脆嫩，風味獨特，一直被奉為宴席上的美味佳肴，在國內(nèi)外是食(藥)用真菌的珍品之一。該菌最早收錄于李時珍的《本草綱目》，蘑菇蕈條下記載“一種狀如羊肚，有蜂巢眼者，名羊肚菌”。中醫(yī)認為其具有理氣化痰、壯陽補腎、提神醒腦的功效；而西醫(yī)認為此菌可降血脂，調(diào)節(jié)免疫力，具有抗疲勞、抗輻射和抗腫瘤的作用[2-3]。自1897年Boudier首次建立羊肚菌屬以來，菌物學(xué)家們針對羊肚菌的分類、分布、生態(tài)、菌種保育及栽培技術(shù)等開展大量研究工作。20世紀初，主要探討該菌種屬的問題；20世紀50年代，基本掌握羊肚菌營養(yǎng)要求等生理特性；60年代中期，美、法等國成功進行羊肚菌深層發(fā)酵培養(yǎng)，并發(fā)展為大規(guī)模菌絲發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)；80年代初，美國首次報道室內(nèi)人工栽培羊肚菌成功；90年代初，美國報道了羊肚菌生活史的全面運行圖，為羊肚菌生物學(xué)特性的研究，及進一步深入研究羊肚菌生活史提供必要參考[4]。近百年來，在全世界范圍內(nèi)對羊肚菌資源保育及其開發(fā)利用研究依然是國內(nèi)外學(xué)者探討的重要課題之一。

1羊肚菌傳統(tǒng)分類學(xué)研究

傳統(tǒng)的羊肚菌分類學(xué)研究主要基于羊肚菌的生態(tài)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，包括子實體形態(tài)觀察以及子囊、孢子，菌核和側(cè)絲的顯微觀察等。經(jīng)過長期研究，菌物學(xué)家們對羊肚菌的基本形態(tài)有一定的了解和認識，這對今后羊肚菌分類系統(tǒng)學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。羊肚菌科中屬級分類不存在爭議，羊肚菌科包括羊肚菌屬Morchella，鐘菌屬Verpa和皺盤菌屬Disciotis，但羊肚菌屬內(nèi)種間分類一直存在較大爭議，種的劃分較混亂。Emile[5]匯總以往的研究資料，在《Les Morilles》一書中將收集到的羊肚菌劃分為28個分類單元，認為其廣泛分布于北半球的德國、法國、中國和美國等地。Kirk等[6]也采用Emile的觀點，將羊肚菌劃分為28個種。根據(jù)Boudier的分類系統(tǒng)，羊肚菌屬可以分為4個組(真生組、開裂組、假直生組和紙質(zhì)生組)和2個亞組(羊肉質(zhì)亞組和肉質(zhì)亞組)[7]。Hallen等[8]根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，將其劃分為100種以上。在中國，戴芳瀾[9]將前人報道的中國真菌資料進行匯總和整理，編著《中國真菌總匯》一書，其中記載中國羊肚菌有8個種，分別為尖頂羊肚菌Morchellaconica、高羊肚菌Morchellaelata、小頂羊肚菌Morchellaangusticeps、開裂羊肚菌Morchelladistans、粗柄羊肚菌Morchellacrassipes、羊肚菌Morchellaesculenta、小羊肚菌Morchelladeliciosa和硬羊肚菌Morchellarigida。

雖然羊肚菌的分類系統(tǒng)學(xué)研究歷史悠久，但其分類體系仍存在較大爭議。因為不同學(xué)者的研究重點和分類依據(jù)有差異，勢必會建立不同的分類系統(tǒng)，當前羊肚菌種的劃分從3個種到32個種不等；針對這種復(fù)雜的分類情況，有學(xué)者提出多態(tài)物種(Polymorphic Species)的概念，將已研究報道的羊肚菌分為3個多態(tài)種，分別為黃羊肚菌(Yellow morels)、黑羊肚菌(Black morels)和開裂羊肚菌(Semifree capped morel)，其中，黃羊肚菌包括M.esculenta、M.deliciosa和M.crasspies，黑羊肚菌包括M.ealat、M.angusticeps和M.conica，開裂羊肚菌包括M.semilibera[10-12]。此外，Gaston等[13]還提出第4個組別，即紅色羊肚菌(Blushing morels)，該組包括危地馬拉羊肚菌M.guatemalensis和紅褐羊肚菌M.rufobrunnea，這2個種僅分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)；同時還提出羊肚菌分類的幾個重要依據(jù)：子囊果的顏色和形狀、脊的位置、囊狀體長、染色反應(yīng)以及子囊、子囊孢子、側(cè)絲特征。

據(jù)現(xiàn)有研究資料統(tǒng)計，中國目前報道的羊肚菌約有15種，這些種類主要分布在西南地區(qū)的云南省、四川省及西北地區(qū)的甘肅省、寧夏回族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)等[14-22]。中國羊肚菌的種類與分布情況見表1。

表1　中國羊肚菌的種類及分布地區(qū)

目前，已針對羊肚菌傳統(tǒng)分類系統(tǒng)學(xué)開展大量研究工作，然而，由于菌物學(xué)家們建立的分類依據(jù)依然存在較大爭議，還要研究者進一步尋求更可靠和更簡便的研究方法，為羊肚菌的分類鑒定工作提供新的和可信的數(shù)據(jù)。

2羊肚菌生態(tài)位特征

羊肚菌Morchellaspp.主要分布在北半球溫帶、寒溫帶地區(qū)，主要出現(xiàn)在冬季寒冷、常有降雪的區(qū)域；南半球發(fā)生較少，主要集中在智利、阿根廷等南美國家；此外，亞熱帶及地中海區(qū)域有少量分布。羊肚菌發(fā)生區(qū)域生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，而且不同種類也有生態(tài)上的分化。

2.1發(fā)生時間

根據(jù)現(xiàn)有文獻統(tǒng)計，大部分學(xué)者普遍認為羊肚菌在每年的春末夏初和秋季雨后常時有發(fā)生。任桂梅等[23]總結(jié)報道，大興安嶺的羊肚菌發(fā)生在5月末至7月初，6月中旬至7月為最適生長期。李峻志等[24]調(diào)查研究秦嶺山區(qū)羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)4月中下旬到5月上旬是野生羊肚菌的多發(fā)期。胡偉等[25]調(diào)查統(tǒng)計顯示，黑龍江省野生羊肚菌的發(fā)生時間一般在5月中旬至月末，全年其他時間未見生長。姜淑霞等[26]統(tǒng)計泰山周圍的野生羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)羊肚菌發(fā)生期主要在春末夏初，通常發(fā)生在每年的5-6月。申進文等[27]調(diào)查河南省欒川縣羊肚菌時得知，該地區(qū)羊肚菌盛產(chǎn)期為4月中旬。李毅等[28]調(diào)查山西省羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，該省的5種野生羊肚菌多發(fā)于每年的4月下旬至5月中旬。申時才等[29]調(diào)查云南香格里拉野生羊肚菌資源時發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)尖頂羊肚菌M.conica的盛產(chǎn)期一般在每年的5月下旬到6月中旬。羊肚菌屬于低溫高濕性真菌，當平均氣溫高于8 ℃，地溫為0～2℃時便有大量菌絲萌發(fā)，此時為萌動期；當氣溫達15～18℃，地溫為6～9 ℃時，菌絲生長迅速并進行組織分化，形成子實體原基，隨溫度升高，羊肚菌破土而出并迅速生長，此時為盛產(chǎn)期；當氣溫超過23 ℃，地溫高于12 ℃時，子實體生長緩慢，進入消失期。羊肚菌生長的最適溫度為6～11 ℃，相對濕度為65%～78%(盛產(chǎn)期要求達到78%)。羊肚菌生長期除需較低的氣溫外，還需較大的溫差刺激菌絲體的分化，其中萌動期和盛產(chǎn)期的日較差要求大(3.3～22 ℃)，日較差大于10～15 ℃的時間需45～60 d；消失期的日較差要求小，日較差大于10～15 ℃的時間需11～20 d。綜上可知，在中國不同地區(qū)、不同省份，因經(jīng)緯度、海拔等的不同，勢必造成各地區(qū)溫度、濕度的明顯差異，這些均會直接影響羊肚菌的發(fā)生時期。

2.2環(huán)境溫度

羊肚菌屬于低溫型真菌，從全球范圍來看，其主要分布于北半球的歐亞大陸和北美洲，羊肚菌的生長適宜溫度因不同地域而異。Ower[30]研究認為，羊肚菌菌絲體在3～28 ℃均能生長，最適溫度為15～18 ℃，低于3 ℃或高于28 ℃時其菌絲體生長停止或死亡；孢子散發(fā)適宜溫度15～18 ℃，孢子萌發(fā)適宜溫度18～22 ℃，子實體在10～18 ℃均能生長，最適溫度12～16 ℃。黃國學(xué)等[31]調(diào)查遼寧省野生羊肚菌發(fā)生期時發(fā)現(xiàn)，平均溫度為12.9 ℃時羊肚菌普遍發(fā)生，而且盛產(chǎn)期晝夜溫差較大。任桂梅等[4]研究四川和陜西2省野生羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，平均氣溫大于15 ℃時羊肚菌子實體停止生長甚至消失。王文房等[32]調(diào)查臨沂市郊羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，當晝夜溫差在10～15℃時有利于其子實體的生成。Winder[33]報道尖頂羊肚菌M.conicaDE10、DE11在低于8 ℃仍可以有效生長，這可能與土壤微生物因素有關(guān)，但菌絲生長的最佳溫度為16～24 ℃。陳易飛等[34]研究蘇州市郊羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，羊肚菌菌絲在2～26 ℃均能生長，超過34 ℃時，菌絲停止生長，甚至死亡。謝占玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌菌絲體可在0～1 ℃的冰箱中生長，說明羊肚菌菌絲體的生長溫度可低于3 ℃。熊春菊等[35]對云南玉龍縣尖頂羊肚菌M.conica的菌絲體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，菌絲在25 ℃時日均生長速度最快。柴林山等[36]對遼寧朝陽河林區(qū)內(nèi)的一株野生羊肚菌研究時發(fā)現(xiàn)， 25 ℃時菌絲長速達到最高值，為7.18 mm/d。 謝放等[37]在實驗室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，變溫條件不利于羊肚菌菌核的形成和菌絲生長；20 ℃時，羊肚菌菌落干質(zhì)量和菌絲生長速度均達到最大值。

2.3環(huán)境濕度

羊肚菌的發(fā)生與發(fā)生區(qū)的降雨量密切相關(guān)，在降雨量較多且土壤容易保濕的環(huán)境中羊肚菌發(fā)生較為普遍。據(jù)有關(guān)資料顯示，土壤相對濕度在50%～60%時，有益于羊肚菌子實體原基形成，土壤相對濕度在75%～95%時，則有益于羊肚菌子實體的發(fā)育[38]。Goldway等[39]首次報道以色列尖頂羊肚菌M.conica的發(fā)生可從當年開春的3月一直持續(xù)到深秋的10月。Obst等[40]研究報道美國西北部地區(qū)黑羊肚菌(Black morel)、黃羊肚菌(Yellow morel)和灰羊肚菌(Gray morel)的生長習性，他們認為，黃羊肚菌和灰羊肚菌多發(fā)于高海拔、較干燥的環(huán)境；而黑羊肚菌多發(fā)在海拔較低、濕度較大的環(huán)境。Mihail等[41]研究美國密蘇里州野生羊肚菌發(fā)生地域的非生物因素時發(fā)現(xiàn)，當?shù)匮蚨蔷漠a(chǎn)生與發(fā)生地域環(huán)境的空氣濕度呈正相關(guān)，若在盛產(chǎn)期前一個月有大于30 mm的降雨量，其發(fā)生概率明顯增高。 杜習慧等[42]在較為系統(tǒng)地研究中國羊肚菌生物地理環(huán)境時發(fā)現(xiàn)，在中國羊肚菌發(fā)生最多的地方是溫帶針闊葉混交林地域，可能是因為這種復(fù)雜的生物地理環(huán)境可滿足羊肚菌發(fā)生時所需的溫度和濕度等條件。

2.4植被與土壤

據(jù)相關(guān)資料記載，野生羊肚菌多發(fā)生在北半球的針闊葉混交林的腐殖質(zhì)層。顧龍云[43]在甘肅甘南藏族自治州境內(nèi)野生羊肚菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，5種羊肚菌有時也發(fā)生在單一的針葉林內(nèi)。劉都才等[44]在湖南考察后則認為，野生羊肚菌沒有明顯的伴生植物。趙永昌等[45]報道稱，羊肚菌發(fā)生區(qū)植被類型大致可以分為4種，分別為果園(尤其舊蘋果園)、草甸、火燒林地和針闊混交林。談峰等[14]在江蘇考察羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，羊肚菌的發(fā)生常伴有泡桐樹的存在，并以此來考慮泡桐樹是否可作為當?shù)匮蚨蔷l(fā)生的指示植物。

羊肚菌是一種土生菌，菌絲分布于土壤，從野外觀察結(jié)果分析，羊肚菌發(fā)生與土壤類型有密切關(guān)系。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多發(fā)生的土壤類型有黑壤土、山地灰褐森林土、沙壤土和黃壤土等。侯振彪等[46]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌在被火燒過的松、樺等樹樁旁也有發(fā)生，而且火燒次年是發(fā)生的高峰期，進入第3年則明顯減少或基本不發(fā)生。說明，羊肚菌除在常見的土壤類型中生長外，還能在短時間內(nèi)耐受高溫并吸取火燒后土壤中可能留下的特殊營養(yǎng)源。

2.5根際微生物

張宗舟[47]對黑脈羊肚菌M.angusticepsPeek.，羊肚菌M.esculenta(L.) Pers.和尖頂羊肚菌M.conicaPers.的根際和根外微生物進行研究，結(jié)果顯示，3種羊肚菌根外的微生物數(shù)量明顯高于根際，根際放線菌的數(shù)量(4 700個)明顯高于根外(3 700個)，羊肚菌根際細菌數(shù)量明顯低于一般土樣。趙永昌等[45]調(diào)查研究時發(fā)現(xiàn)，羊肚菌發(fā)生區(qū)的微生物環(huán)境與張宗舟[47]的研究結(jié)果極為相似，細菌、放線菌數(shù)量較多，而酵母菌差別較大。同時，在實驗室內(nèi)對收集到的117株羊肚菌分離時發(fā)現(xiàn)，菌絲體很容易被降解木質(zhì)素和纖維素的真菌污染，可能是因為這些雜菌具有協(xié)同降解纖維素和木質(zhì)素的作用，以利于日后羊肚菌子實體的形成。

2.6酸堿度

羊肚菌適宜生長在中性或微堿性的環(huán)境，pH略高于一般真菌，通常為6.5～7.9，若pH低于4.5或高于9，菌絲則停止生長或死亡。Robbins等[48]研究粗腿羊肚菌M.crasspies(Vent.) Pers.時發(fā)現(xiàn)，pH為7.7的富含Ca2+的培養(yǎng)基最適于羊肚菌菌絲生長。林杰[49]測定黑脈羊肚菌M.angusticepsPeek.的pH生長曲線時發(fā)現(xiàn)，羊肚菌pH生長曲線為鍋齒形的雙峰曲線，二峰值分別為7.0、8.4及7.3、8.3。車進等[50]研究陜西地區(qū)采集到的野生羊肚菌得知，酸堿度對羊肚菌菌絲體長勢影響較大，pH為7.0左右時，菌絲日均生長速度達到最大。綜合以上分析可知，羊肚菌生長的最佳pH與各地區(qū)的自然環(huán)境、微量元素等多種因素有關(guān)。

2.7光照和空氣

據(jù)有關(guān)文獻報道，在黑暗或微光條件下羊肚菌菌絲體生長較快，而在強光條件下對其子實體的生長發(fā)育可起到一定的促進作用[51-53]。董愛榮等[54]研究發(fā)現(xiàn)，小羊肚菌M.deliciosaFr.在原基形成及子實體發(fā)育時需要的照度為200～800 lx；同時，子實體的色澤在某種程度上易受散射光強弱的影響。董雪[55]研究黑脈羊肚菌M.angusticepsPeek.在4種光照條件下(黑暗、弱光、散射光和強光)的菌絲生長情況發(fā)現(xiàn)，各條件下試驗菌株均能較好生長，但黑暗條件下菌絲體長勢最好，強光則抑制菌絲體的生長。趙琪等[56]研究顯示，尖頂羊肚菌M.conicaPers.在腐殖質(zhì)土PDA培養(yǎng)基中菌絲生長階段不需光照，但子囊果原基形成時需要600～1 000 lx的散射光。

羊肚菌也是好氧真菌，足夠的氧氣和良好的通風場所是保證羊肚菌正常生長發(fā)育的必要條件。菌絲生長階段對空氣沒有明顯要求，在子囊果形成和生長發(fā)育階段對空氣十分敏感，CO2體積分數(shù)超過0.3%時，子囊果瘦小、畸形，甚至腐爛。

2.8營養(yǎng)元素

菌物學(xué)家們普遍認為，羊肚菌Morchellaspp.可以在大多數(shù)真菌培養(yǎng)基上生長發(fā)育，但不同培養(yǎng)基因所含營養(yǎng)成分的不同勢必造成羊肚菌菌絲生長速度及長勢的差異。因此，探索羊肚菌菌絲體對碳、氮源及其他營養(yǎng)元素的利用仍十分重要。

2.8.1碳、氮源尤國信等[57]研究認為，羊肚菌M.esculenta利用的最佳碳、氮源分別是蔗糖和硝酸鉀。楊紹彬等[58]試驗發(fā)現(xiàn)，羊肚菌M.esculenta菌絲生長對培養(yǎng)基質(zhì)中氮源含量的需求比較高，培養(yǎng)基質(zhì)中的m(C)∶m(N)<20∶1。肖鋒等[59]研究認為，羊肚菌M.esculenta最優(yōu)的碳、氮組合應(yīng)是蔗糖-尿素[m(C)∶m(N)=18∶1]。董愛榮等[54]研究認為，羊肚菌M.esculenta的最佳碳源是蔗糖，較好的氮源是尿素。趙春燕等[60]報道羊肚菌M.esculenta在以葡萄糖為碳源、硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長最好。陳芝蘭等[61]研究發(fā)現(xiàn)，黑脈羊肚菌M.angusticeps的最適碳、氮源分別為蔗糖和尿素，并且無機氮源不利于羊肚菌菌絲體的生長發(fā)育，菌絲在復(fù)合腐質(zhì)土PDA培養(yǎng)基上的長勢最好。高成華等[62]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌M.esculenta在固、液2種培養(yǎng)基上均能有效生長，但固體PDA培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。Winder[33]研究羊肚菌M.esculenta的生長特點時發(fā)現(xiàn)，甘露糖和蔗糖均為最佳碳源，在以麥芽糖和乳糖為碳源的培養(yǎng)基上，羊肚菌M.esculenta菌絲生長均非常緩慢，甚至停止，菌落形態(tài)差異較大。努爾古麗[63]研究新疆3種羊肚菌生長特性時得知，尖頂羊肚菌M.conica、黑脈羊肚菌M.angusticeps和羊肚菌M.esculenta對碳源、氮源的利用程度分別為：甘油<葡萄糖<蔗糖，硝酸銨<硫酸銨<硝酸鉀，蛋白胨則是3種羊肚菌均不能利用的氮源。陶熱等[64]研究九江地區(qū)小羊肚菌M.deliciosa時發(fā)現(xiàn)，羊肚菌菌絲體對碳源具有一定的選擇性利用，單糖的利用程度明顯要高于對二糖和多糖的利用程度；從氮源的利用程度來看，無機氮不利于小羊肚菌M.deliciosa菌絲的生長。由上述研究來看，多數(shù)學(xué)者認為葡萄糖和蔗糖可以作為適宜羊肚菌生長的碳源；硝酸鉀、尿素和蛋白胨則為適宜羊肚菌生長的氮源，研究結(jié)果的差異可能與各學(xué)者采用的試驗方法和研究對象不同有關(guān)，還有待進一步探討。

2.8.2微量元素及維生素刁治民等[65]試驗報道稱，羊肚菌M.esculenta菌絲體的生長發(fā)育受Mn元素的影響較大，當Mn元素質(zhì)量濃度為5 mg/L 時具有明顯的促進作用。彭璐等[66]研究發(fā)現(xiàn)，K、Zn元素能有效地促進羊肚菌M.esculenta菌絲體的生長，而Mn元素的促進作用不明顯，但Fe、Cu、Ca元素對菌絲體的生長則有抑制作用。Gursoy等[67]測定羊肚菌M.esculenta生理活性時發(fā)現(xiàn)，樣品中均含有Cu、Mn、Zn、Fe、Ca、Mg、Co 7種元素。這些試驗結(jié)果均反映不同羊肚菌生理特性的多樣性。龍正海[68]研究發(fā)現(xiàn)，維生素B1、B2、B6、H和葉酸類物質(zhì)對尖頂羊肚菌M.conica的生長有微弱的促進作用。刁治民等[65]研究發(fā)現(xiàn)，維生素B1、B2、B6、H和葉酸對羊肚菌M.esculenta菌絲生長也有明顯的促進作用，而維生素B12和維生素C有抑制作用。朱永真[69]研究維生素(維生素B1、B2、B6、B12、煙酸及葉酸)對羊肚菌M.esculenta菌絲生長的影響時發(fā)現(xiàn)，煙酸對菌絲生長有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨著煙酸濃度的增加而增強，其他維生素效果則不明顯。從以上研究報道可見，不同維生素對羊肚菌的生長到底起何種作用，至今尚未形成統(tǒng)一的定論。

3羊肚菌生活史及其生活習性

3.1羊肚菌生活史

羊肚菌的生活史(Life Cycle)即從孢子到孢子的發(fā)育全過程(含有性生殖、無性生殖和菌核形成)。圖1描述羊肚菌生活史的全過程，羊肚菌有性生殖成熟的表現(xiàn)是子囊果的形成，成熟子囊果是一個周期的終點，其明顯特征是2個單倍體核配對后形成雙倍體核，再經(jīng)減數(shù)分裂形成新的單倍體子囊孢子，進而繼續(xù)萌發(fā)形成菌絲。羊肚菌無性繁殖是由菌絲形成孢子囊梗，在頂端發(fā)育孢子囊，產(chǎn)生分生孢子，進而萌發(fā)產(chǎn)生單倍體核新菌絲的過程。此外，在環(huán)境因素不利的情況下，營養(yǎng)菌絲或異核菌絲都可直接形成菌核并使其處于休眠狀態(tài)，當環(huán)境適宜時，菌核便會萌發(fā)成新的初生菌絲或次生菌絲，最終形成子實體[70]。

3.2羊肚菌的生活習性

對于羊肚菌的生活習性，學(xué)術(shù)界一直未有明確定論，目前普遍存在2種觀點：一是認為羊肚菌屬于單一的腐生型真菌；二是認為羊肚菌與某種高等植物可能存在菌根關(guān)系[11,71-73]。

自20世紀80年代以來，有關(guān)野生羊肚菌發(fā)生基質(zhì)的調(diào)查研究報告均顯示，此類菌為單一的腐生型真菌，與其他任何植物均未建立所謂的共生關(guān)系，因為無論羊肚菌孢子還是組織塊都可以在簡單的培養(yǎng)基上很快萌發(fā)并且生長迅速，即使完全沒有植物存在也可能誘導(dǎo)出羊肚菌子實體[74-75]。Moser[76]研究認為，羊肚菌同時具有共生和腐生能力。Trappe等[77]討論羊肚菌菌根性質(zhì)，指出雖然羊肚菌具有腐生菌所具有的一系列特征，然而仍然有不同羊肚菌種類能與幾種較大的樹根形成不同的聯(lián)系。而且就羊肚菌為腐生型真菌的各類文獻報道可以看出，不同學(xué)者的觀點也各異。曾榮鑒[78]調(diào)查后認為，羊肚菌應(yīng)該是一種土生腐生型真菌；楊紹斌等[51]則根據(jù)不同的生長基質(zhì)，將其認為是腐生型真菌的羊肚菌劃分為腐朽木腐生型、腐殖質(zhì)土腐生型、細沙質(zhì)土腐生型3種。近幾年，關(guān)于羊肚菌是腐生菌還是菌根菌爭議依然存在，李能樹等[79]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，羊肚菌可與某種高等植物建立共生關(guān)系形成外生菌根；但張維瑞等[80]持相反態(tài)度，他們認為羊肚菌與木林、竹林等無任何關(guān)聯(lián)，應(yīng)為腐生菌；王伯徹[81]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，羊肚菌是一種純以地表腐殖質(zhì)和土壤為基質(zhì)生長的真菌。由此可見，關(guān)于羊肚菌的生活習性還有待菌物學(xué)家們深入研究。

圖1　羊肚菌生活史示意圖(引自Thomas, 1990)

4羊肚菌遺傳多樣性研究

4.1菌物遺傳多樣性概述

菌物遺傳多樣性(Fungal genetic diversity)是指在分子水平上對菌物多樣性及其演化規(guī)律進行描述的科學(xué)，亦稱為菌物基因多樣性。早期的菌物系統(tǒng)發(fā)育研究主要依據(jù)個體的形態(tài)學(xué)和發(fā)育學(xué)等數(shù)據(jù)來進行分析和判斷，21世紀以來，Kimura’s分子進化的中性理論(NTME)對生物進化與遺傳學(xué)的研究產(chǎn)生巨大影響，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在菌物分類鑒定及遺傳多樣性研究中起著至關(guān)重要的作用。例如：聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction，PCR)、核酸分子雜交技術(shù)(Nucleic acid hybridization)、隨機擴增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、同工酶分析(Isoenzymes analysis)、電泳核型分析(Electrophoretic karyotype analysis)、蛋白質(zhì)免疫技術(shù)(Protein immune technology)、核酸序列分析(Nucleic acid sequence analysis)、限制性長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphsm，RFLP)、擴增核糖體 DNA 限制性分析(Amplified ribosomoal DNA restriction analysis，ARDRA)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single strand conformational polymorphisms，SSCP)、16S末端標記限制片段長度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等。查閱近10 a的有關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外學(xué)者在羊肚菌遺傳多樣性研究中主要應(yīng)用核酸序列分析(Nucleic acid sequence analysis)、同工酶分析(Isoenzymes analysis)和蛋白質(zhì)免疫技術(shù)分析(Protein immune technology)3種方法，現(xiàn)將逐一闡述。

4.2羊肚菌核糖體DNA分析

遺傳多樣性的本質(zhì)是遺傳物質(zhì)DNA分子的多態(tài)性表現(xiàn)，是DNA分子水平上遺傳多樣性的直接反映，由于核糖體DNA(rDNA)分子進化信息量大，可比性強，現(xiàn)已廣泛用作生物發(fā)育系統(tǒng)學(xué)的分子指標。

以特定的引物可以對羊肚菌特定的核糖體DNA進行PCR擴增，并可進行進一步的測序與分析。Buscot[72]對多種羊肚菌Morchellaspp.的ITS和IGS序列進行PCR/RFLP分析，發(fā)現(xiàn)ITS區(qū)可以清楚地區(qū)分研究組群區(qū)，而IGS區(qū)只能區(qū)分親緣關(guān)系非常接近的2個種區(qū)，這表明ITS區(qū)的應(yīng)用范圍要大得多，IGS區(qū)只能用于遺傳距離較近種的親緣關(guān)系鑒定。Bunyard等[82]對羊肚菌屬Morchella和鹿花菌屬Gyromitra的28 S rDNA進行PCR-RFLP分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬Morchella與鹿花菌屬Gyromitra的差異約為6.2%。Wipf等[83]對尖頂羊肚菌M.conica和羊肚菌M.esculenta的完整ITS序列進行測序分析，發(fā)現(xiàn)尖頂羊肚菌M.conica和羊肚菌M.esculenta的ITS序列存在長度差異，還發(fā)現(xiàn)二者的ITS1和ITS2片斷間存在很高的多態(tài)性。隨后，Wipf等[84]采用 PCR-RFLP技術(shù)分析羊肚菌屬Morchella的11個種的ITS序列，通過最大簡約法(Maximum pasimony)和鄰接法(Neighbour joining)可以很明確區(qū)分黃羊肚菌類群和黑羊肚菌類群。杜習慧等[42]對在中國21個省收集的361株羊肚菌標本進行ITS區(qū)序列分析，并采用最大似然法(Maximum likelihood)和最大簡約法(Maximum pasimony)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，中國共有30種羊肚菌，其中有11種是新發(fā)現(xiàn)尚未命名的種類，該研究成果為中國第一部羊肚菌詳細的分子系統(tǒng)發(fā)育評估報告。

4.3羊肚菌同工酶分析

生物進化歷程中，變異基因經(jīng)復(fù)制和分離形成不同位點，進而編碼同工酶的不同亞基，使同工酶也可作為識別遺傳基因的標記。龍正海等[85]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌M.esculenta在不同生長時期，菌絲體內(nèi)酯酶同工酶活性變化與其氨基酸含量變化存在一定的相關(guān)性；研究還發(fā)現(xiàn)，羊肚菌M.esculenta子實體與其菌絲體酯酶同工酶酶譜基本相同。Wipf等[83]對來自歐洲、美洲等地的不同羊肚菌的8種脫氫酶進行同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，通過對8種酶遷移率的分析可以得到不同羊肚菌的系統(tǒng)發(fā)生信息。王新宇等[86]研究發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)液及相同培養(yǎng)條件下，羊肚菌M.esculenta、尖頂羊肚菌M.conica和黑脈羊肚菌M.angusticeps，菌絲體的生物量及可溶性蛋白質(zhì)含量無顯著差異，但同一個種在含不同濃度的麥芽糖、VB1和蛋白胨培養(yǎng)基上生長時，菌絲體生物量差異較大，同時酯酶同工酶的組分也有差異。

4.4羊肚菌蛋白質(zhì)免疫分析

自1989年Futhrmann等研究發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme- linked immuno sorbent assay，ELISA)方法可以準確進行種類鑒定以來，真菌抗原的免疫學(xué)研究已經(jīng)在該領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[87-88]。Jung等[89]將酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)應(yīng)用于羊肚菌的系統(tǒng)學(xué)研究，結(jié)果顯示，半開羊肚菌M.semilibera與羊肚菌M.esculenta間的免疫學(xué)差異為27%；同時，兩位學(xué)者認為，為更好揭示羊肚菌各種群間的免疫學(xué)關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可以利用蛋白質(zhì)純化物替代菌絲細胞提取物作為抗體對羊肚菌屬Morchella進行免疫學(xué)研究。

5甘肅甘南藏族自治州野生羊肚菌資源研究現(xiàn)狀及展望

甘南藏族自治州位于甘肅省西南部，地處青藏高原東北邊緣向黃土高原和隴南山地的過渡地帶，全區(qū)北緯33°20′～35°40′，東經(jīng)100°52′～104°45′，海拔最低僅有800 m，而最高可達4 000 m，地勢落差極大，地貌特征復(fù)雜多樣，自然條件極端；境內(nèi)有白龍江、黃河、洮河和大夏河，這“一江三河”是黃河、長江干流的重要水源涵養(yǎng)區(qū)，是維系黃河、長江中下游地區(qū)生態(tài)安全的天然屏障[90]。該地區(qū)屬青藏高原氣候帶，高寒濕潤氣候區(qū)，年均氣溫4.5 ℃，年均降水量610.4 mm，年均蒸發(fā)量1 185.3 mm，年總?cè)照諘r數(shù)2 396.0 h，日照率為54%[91]。由于自治州內(nèi)部分地區(qū)的生物地理氣候條件以及水文狀況與諾爾蓋濕地十分相似，從生物學(xué)多樣性角度來看，可視其為諾爾蓋濕地生態(tài)系統(tǒng)的一部分，是中國少有的集森林山地、高原濕地和高寒草甸三重功能為一體的自然生態(tài)環(huán)境區(qū)，在保護生物多樣性方面具有全球戰(zhàn)略意義[92]。該地區(qū)植被覆蓋率高，生物群落穩(wěn)定，其獨特的氣候特點造就豐富的生物資源，其中也為食(藥)用真菌的發(fā)生提供優(yōu)越的多樣性生態(tài)條件，這其中就包括羊肚菌Morchellaspp.。目前，有關(guān)該地區(qū)羊肚菌資源研究的情況鮮有報道，早期顧龍云[43]開展甘肅甘南藏族自治州野生羊肚菌的考察工作，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)有羊肚菌M.esculenta、尖頂羊肚菌M.conica、黑脈羊肚菌M.angusticeps、粗腿羊肚菌M.crasspies和小羊肚菌M.deliciosa5種，報道稱后3種為甘肅省新紀錄種，并發(fā)現(xiàn)其中有些黑脈羊肚菌M.angusticeps是生長在云杉林里枯枝落葉層下腐殖質(zhì)中的腐木上。這一事實說明過去許多真菌學(xué)者籠統(tǒng)地認為“羊肚菌是以土壤有機質(zhì)為營養(yǎng)的腐生菌”的說法是不確切的。羅植柚[93]研究報道甘南藏族自治州野生羊肚菌生態(tài)特征，初步發(fā)現(xiàn)當?shù)匾吧蚨蔷L發(fā)育的生態(tài)因子?？敌』⒌萚94]對甘南藏族自治州尖頂羊肚菌M.conica進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以干菌絲體得率為指標，設(shè)計正交試驗優(yōu)化其液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳培養(yǎng)基組合為白砂糖30 g/L、豆粕粉15 g/L、KH2PO40.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、維生素B 10.03 g/L；最優(yōu)液體發(fā)酵條件為溫度25 ℃，培養(yǎng)液初始pH 7.0，接種量10 mL，轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)時間8 d。

到目前為止，有關(guān)甘肅甘南藏族自治州野生羊肚菌分子系統(tǒng)學(xué)方面的研究尚未見報道。因此，今后應(yīng)從以下3個方面開展相關(guān)工作：(1)對甘肅甘南藏族自治州境內(nèi)收集到的野生羊肚菌進行形態(tài)學(xué)初步分類，分別從子實體、菌絲體、菌核、菌落、孢子等方面進行形態(tài)和顯微觀察；(2)運用分子生物學(xué)技術(shù)對甘肅甘南藏族自治州境內(nèi)收集到的野生羊肚菌進行分子鑒定，并對其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行分析研究；(3)以甘肅甘南藏族自治州境內(nèi)已鑒定出的羊肚菌菌株為研究對象，運用生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)的研究方法擬合其液體菌種生長動力學(xué)模型，為今后羊肚菌的發(fā)酵培養(yǎng)及人工栽培數(shù)據(jù)圖形化實現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。通過上述研究，可以明確甘南藏族自治州野生羊肚菌的種質(zhì)資源及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為羊肚菌篩選雜交親本，早期預(yù)測雜種優(yōu)勢，減少育種中的盲目性等方面提供理論與實踐基礎(chǔ)，同時也為甘南藏族自治州大型經(jīng)濟真菌的利用與開發(fā)提供一定的依據(jù)。

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Received 2015-08-05Returned2015-11-12

Foundation itemThe Youth Science and Technology Innovation Foundation of Gansu Academy of Science (No.2013QN-05).

First authorWANG Long, male, associate research fellow. Research area: the microbial diversity and resource utilization from grassland. E-mail: wanglong-0106@163.com

(責任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Research Progress of Species Diversity inMorchellaspp.

WANG Long, GUO Rui, LU Dengxue, QIN Peng and ZHAO Yuhui

(Key Laboratory of Microbial Resources Development and Utilization of Gansu Province, Industrial Microbial Engineering Technology Research Center of Gansu Province, Institute of Biology,Gansu Academy of Science, Lanzhou 730000, China)

AbstractAs a valuable and rare edible and medicinal fungus, Morchella spp. has very important economic and scientific values. In this paper, the recent achievement of Morchella spp. on traditional classification, ecological characteristic, life cycle, life habit and molecular biology etc. were summarized. In addition, the research development of wild Morchella spp. from Tibetan autonomous prefecture of Gannan in Gansu province were sketched. The potential issues which remained in the current research were pointed out, and some suggestions were given for future study.It will make a reference to sustainable development of wild Morchella spp. from Tibetan buddhism of Gannan in Gansu province.

Key wordsMorchella spp.; Species diversity; Molecular biology; Gansu province; Summary

收稿日期：2015-08-05修回日期：2015-11-12

基金項目：甘肅省科學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金(2013QN-05)。

中圖分類號S646.9

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0477-13

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.002.html

第一作者：王龍，男，副研究員，從事草地微生物多樣性及其資源利用研究工作。E-mail:wanglong-0106@163.com