王良安，莊旭品,2，晁貴群，徐先林,2，董 鋒

(1.天津工業(yè)大學，天津 300387；2.天津工業(yè)大學先進復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

精氨酸改性殼聚糖納米纖維膜的制備及其BSA親和吸附性能研究

王良安1，莊旭品1,2，晁貴群1，徐先林1,2，董 鋒1

(1.天津工業(yè)大學，天津 300387；2.天津工業(yè)大學先進復合材料教育部重點實驗室，天津 300387)

文章通過改變反應物的摩爾比，合成不同取代度的殼聚糖精氨酸(CS-Arg)產(chǎn)物，應用FTIR、TG及元素分析對其結(jié)構(gòu)及取代度進行表征。進一步將其和聚乳酸混合溶解，利用溶液噴射紡絲法制備CS-Arg納米纖維(CANFs)，以牛血清蛋白為模型蛋白，研究了CANFs對BSA的吸附性能，結(jié)果表明：A4(CANFs-4)親和膜對BSA的吸附能力最好，吸附量達445.19 mg/g。

納米纖維親和膜；蛋白質(zhì)吸附；溶液噴射紡絲；殼聚糖；精氨酸

1 引言

蛋白質(zhì)是生命有機體的主要成分，其產(chǎn)品在醫(yī)藥、催化、醫(yī)學診斷及疾病治療等領(lǐng)域有著廣泛的應用[1]。近年來，隨著生命科學、藥學及醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，對蛋白質(zhì)、酶、抗體等生物大分子的分析、分離純化的要求越來越高。如何有效地分離提純不同蛋白質(zhì)成為現(xiàn)在藥物分析和生物科學的研究熱點之一。

殼聚糖(Chitosan, CS)是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，是一類生物相容性好、可降解、天然無毒的線性多糖生物高分子。殼聚糖分子中含有自由的氨基和多個羥基，易進行羥基化、醚化、?；?、烷基化及季銨化改性[2]。通過接枝改性的方法，在殼聚糖大分子骨架上選擇性地接枝易于加工、強度高的、親水性的、具有特殊功能的小分子，可有效改善殼聚糖的性能。Xu等[3]利用溶膠凝膠反應制備負載二氧化硅殼聚糖多孔有機質(zhì)，其能快速吸附BSA，吸附量達到980 mg/L。Chen等[4]利用殼聚糖/羧甲基纖維膜、殼聚糖/羧甲基殼聚糖層析、吸附、分離卵白蛋白、溶解酵素。Jayakumar等[5]通過EDC做引發(fā)劑成功地將2-羥乙基膦酸接枝到CS上，得到的磷酸化殼聚糖衍生物具有良好的水溶性，也為本論文的殼聚糖衍生物合成方法提供了重要的依據(jù)。EDC是一種小分子交聯(lián)劑，廣泛用于羧基與氨基的交聯(lián)。本實驗方法就是利用接枝聚合反應，使殼聚糖與精氨酸發(fā)生?；磻?，將殼聚糖的氨基與精氨酸的羧基耦合在一起，形成共聚物。反應所得精氨酸修飾的殼聚糖具有更好的親和吸附性能。

親和膜分離技術(shù)是以膜作為基質(zhì)，并對其表面進行改性，在膜的內(nèi)外表面固定特定的配基，再對生物大分子進行分離純化的技術(shù)。與傳統(tǒng)親和色譜相比，親和膜分離技術(shù)具有高選擇性、快速分離、操作條件溫和、無污染和易放大的特點。納米纖維內(nèi)部貫通的孔洞和非常大的比表面積是人們將其應用于親和膜的關(guān)鍵原因[6]。通過合成高分子材料與天然高分子材料混紡成膜，所得的材料具有機械性能好、化學穩(wěn)定性高、可反應官能團豐富等優(yōu)點，非常適合做蛋白質(zhì)分離純化的親和膜基材。

2 實驗

2.1 主要試劑與儀器

酶標分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；氣浴恒溫振蕩器：金壇市科杰儀器廠；真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)實驗儀器有限公司。

2.2 精氨酸殼聚糖(CS-Arg)的制備

將上述1 g殼聚糖溶于100 mL 1%的冰醋酸中，用磁力攪拌器攪拌至殼聚糖完全溶解。稱取0.71 g NHS加入殼聚糖溶液攪拌半小時，再稱取0.96 g EDC加入到上述溶液繼續(xù)攪拌至溶解[7]。后將精氨酸加入溶液中，繼續(xù)攪拌24 h使反應充分完全。精氨酸與殼聚糖的摩爾比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1五組，依次編號為1、2、3、4、5。精氨酸改性殼聚糖合成路線如圖1所示。

圖1 精氨酸改性殼聚糖合成路線

將透析袋侵入蒸餾水中10 min使其充分吸水，將已反應好的五組溶液裝入透析袋中用蒸餾水透析1～2天，期間每隔6 h換一次蒸餾水。然后換用聚乙二醇(PEG)作透析液，把透析袋再放入18%的PEG溶液中濃縮，濃縮一天，更換一次透析液。最后將溶液倒入培養(yǎng)皿中，放入冰箱中冷藏預冷凍30 min，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍12 h，得到改性好的殼聚糖。

2.3 CS-Arg/PLA納米纖維膜的制備

稱取相同質(zhì)量的CS-Arg固體和PLA顆粒溶解在三氟乙酸溶液中，配制成總濃度為4 wt%的CS-Arg/PLA溶液，先用玻璃棒攪拌均勻，再在磁力攪拌器上攪拌過夜備用。

采用溶液噴射紡絲技術(shù)制備CS-Arg/PLA納米纖維(CANFs)[8～12](如圖2所示)，其基本紡絲流程如下：將配制好的混合溶液裝入到一個容積為10 mL的注射器中，用膠皮管連接注射器和針頭，針頭直徑為0.3 mm，進液速度為10 mL/h，壓力為0.05 MPa。紡絲完成后，將得到纖網(wǎng)放入60℃的熱鼓風干燥箱中烘燥3 h，去除殘留的三氟乙酸。然后把干燥好的纖網(wǎng)用熱壓機熱壓，溫度設(shè)為100℃，壓力為5 MPa，得到平整和有一定機械強度的納米纖維親和膜。CANFs不同取代度的纖維膜CANFs-(1，2，3，4，5)，依次編號為A1、A2、A3、A4、A5。

圖2 溶液噴射紡絲實驗裝置示意圖

2.4 CS-Arg樣品的結(jié)構(gòu)與性能表征

采用TENSOR37型紅外光譜儀對CS-Arg樣品試樣進行紅外測試，粉末測試方法采用KBr壓片法；用熱分析儀測定樣品的熱穩(wěn)定性能，在固定氮氣氣氛下以10℃/min的加熱速率從環(huán)境溫度加熱到800℃；使用VARI0EL3型元素分析儀測定樣品(確定樣品已烘干至恒重)的碳、氮、氫三種元素的含量，并計算精氨酸的接枝率。

2.5 CANFs納米纖維膜的測試

2.5.1 掃描電鏡(SEM)測試

取少許納米纖維樣品噴金后在掃描電鏡(SEM)下觀察其微觀形貌，采用隨機抽樣的方法。

2.5.2 BSA的吸附量測試

利用酶標分析儀測定562 nm處每個試樣的吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算剩余蛋白濃度，由式(1)得到BSA 的吸附量。

q=[(Ci-Ct)V]/m

(1)

試中：q—BSA的吸附量(mg/g)；

V—蛋白質(zhì)溶液體積，取10mL；

Ci—BSA溶液的初始濃度(mg/mL)；

Ct—BSA溶液的平衡濃度(mg/mL)；

m—膜的干重(g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 CS-Arg的結(jié)構(gòu)表征

CS-Arg的進行紅外光譜圖如圖3所示。在殼聚糖的紅外光譜中，2867 cm-1的弱吸收峰對應著-CH-的伸縮振動，伯氨(-NH2)彎曲特征振動峰和吡喃環(huán)上C-O-C的非對稱伸縮振動分別在1590 cm-1、1151 cm-1。對于精氨酸：1614 cm-1對應精氨酸特有基團胍基(-CH4N2)的吸收峰[13]，1419 cm-1和1130 cm-1的吸收峰分別是由于COO-的對稱彎曲、C-C-N 的不對稱彎曲。

與精氨酸和殼聚糖的紅外圖譜對比，新合成的精氨酸改性殼聚糖衍生物的紅外圖譜有明顯的變化。胍基基團的吸收峰在1636 cm-1和C-C-N 的不對稱彎曲的吸收峰在1150 cm-1，也可以看到殼聚糖吡喃環(huán)C-O骨架伸縮振動帶出現(xiàn)在1068 cm-1～1027 cm-1，另外在1557 cm-1附近為仲氨彎曲振動特征吸收峰，伯氨(-NH2)彎曲特征振動峰在精氨酸改性殼聚糖之后消失，是由于殼聚糖分子的中的氨基與精氨酸的α-羧基脫水形成肽鍵，生成仲胺[14]，初步說明了殼聚糖精氨酸改性成功。

圖3 精氨酸、殼聚糖以及CS-Arg產(chǎn)物的紅外圖譜

CS-Arg的TG曲線如圖4所示，可以看出CS-Arg的熱分析圖分為三個失重階段：第一個階段溫度在20℃～150℃之間，是由于附屬和結(jié)合水的蒸發(fā)；第二個階段溫度在150℃～375℃之間，是失重最大的階段。當溫度達到270℃時失重達到最大，是由于CA中的酰胺鍵斷裂，碳鏈斷裂，CA逐步降解；第三個階段溫度在375℃～800℃之間，在這個階段，小分子基團繼續(xù)斷裂，進一步降解直至重量穩(wěn)定。曲線(A5)不同于曲線(A1)、(A2)、(A3)、(A4)所變現(xiàn)出來的規(guī)律，是由于精氨酸是過量的，精氨酸發(fā)生了自交聯(lián)。從表1中可以看出，這五個不同摩爾比CS-Arg的失重率大致相當。

表1 CS-Arg三個階段的失重率

樣品第一階段(%)第二階段(%)第三階段(%)A113.0940.5419.83A211.8143.8614.65A311.6643.9513.29A411.1645.1712.44A511.6345.6313.41

圖4 不同摩爾比CS-Arg的TG曲線

根據(jù)碳氮的比例來計算產(chǎn)物CS-Arg的取代度。假設(shè)原料殼聚糖中，脫乙酰度為DD，取代度為DS，則CS-Arg中碳和氮的百分比C%/N%為：

其中DD為殼聚糖的脫乙酰度(DD=0.92)，DS為取代度。

不同摩爾比的CS-Arg的元素分析結(jié)果見表2。由表2可見，殼聚糖的接枝率在16%～44%之間，有較高的接枝率。由表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著精氨酸的量增加，精氨酸殼聚糖的取代度也隨之增大，這是因為精氨酸的量增加，則殼聚糖單元的氨基被接枝的幾率增加，從而產(chǎn)物的取代度增大，但當精氨酸增加一定程度(精氨酸與殼聚糖的摩爾比為3∶1)時，接枝率不再增加，這是因為精氨酸過量了，沒有多余的殼聚糖與之結(jié)合，造成部分精氨酸與精氨酸之間的自組合。

表2 殼聚糖以及CS-Arg產(chǎn)物的C、N、H元素含量

3.2 CANFs納米纖維膜的測試

3.2.1 CANFs納米纖維膜的形貌分析

圖5(A1-A5)為不同取代度CANFs電鏡形貌圖，其中A1、A2、A3、A 4、A5依次為精氨酸取代度為16.6 %、22.9 %、34.2 %、43.7 %和8.3 %的纖維形貌圖。

圖5 不同取代度的CANFs電鏡圖及直徑分布

由圖可以看出，纖維整體形態(tài)良好，蓬松多孔，呈現(xiàn)三維卷曲形態(tài)；纖維平均直徑分布在100 nm～200 nm之間，但隨著取代度的不同纖維直徑稍微發(fā)生細微的變化，隨著取代度的增加，纖維直徑稍微變大。從圖(A5)中明顯看出有少許液滴，圖(A1、A2、A3、A4)中則基本沒有出現(xiàn)液滴的情況，這是因為圖(A5)中含過量的小分子精氨酸再加上本身CS-Arg材料不易成纖維，聚乳酸的輔助成纖作用削弱，導致表面張力過大不易拉伸成纖，出現(xiàn)液滴的情況，而其他四個則相反，無小分子干擾，CS-Arg和聚乳酸混合溶液具有可紡條件所具備的粘度和分子量，在紡絲拉伸過程中完全呈纖維狀，則會形成無液滴形貌良好的纖維。由纖維形貌可以看出，這種雜亂無章平鋪形成的三維卷曲結(jié)構(gòu)有較大的比表面積和更高的孔隙率，這種結(jié)構(gòu)會降低液體的流動阻力，同時其卷曲微孔延長了流體穿行路徑，增加與纖維表面接觸碰撞的幾率，提高了截留效率，也提高了纖維表面親和配基的利用率，以上都會增加對蛋白質(zhì)的吸附能力。

3.2.2 CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響

配基數(shù)量是影響吸附研究的重要因素之一，精氨酸作為配基接枝到殼聚糖上由于其取代度的不同，最終吸附量也會不同，一般是取代度越大其吸附量越大呈正相關(guān)關(guān)系。取代度不同的CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響見圖6。

圖6 取代度不同的CANFs親和膜對蛋白質(zhì)吸附的影響

由圖6可知，吸附量隨著取代度的增加而增加。配基存在的情況下，最低吸附量達到了295.36 mg/g，也具備良好的吸附性能；A4試樣制備的CANFs-4親和膜精氨酸的取代度最高，蛋白質(zhì)的吸附量最大，吸附量達到445.19 mg/g。由此可以得出，CANFs親和膜具有良好的吸附性能，且與精氨酸的取代度存在正相關(guān)關(guān)系，殼聚糖本身對蛋白質(zhì)就有良好的親和吸附性，再加上配基的固載使吸附性能得到進一步提高。精氨酸的存在提供了胍基基團，胍基上氮原子和氫原子很多，對肽有高度的親和性，容易形成氫鍵作用，胍基含有正電荷基團能與蛋白質(zhì)形成靜電作用，所以制備的CANFs親和膜的吸附性能比較好，具有很好的應用前景。

4 結(jié)語

納米纖維親和膜對蛋白質(zhì)吸附性能的研究越來越受關(guān)注，納米纖維內(nèi)部貫通的孔洞和大的比表面積是其應用于親和膜的關(guān)鍵。本文基于溶液噴射紡絲技術(shù)，制備CANFs親和膜進行蛋白質(zhì)吸附性能測試。五種CANFs親和膜(A1、A2、A3、A4、A5)中A4(CANFs-4)親和膜對BSA的吸附能力最好，吸附量達445.19 mg/g。隨著生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，生物大分子的分離純化越來越重要，該研究具有廣闊的應用前景。

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Preparation of Chitosan Modified L-arginine Nanofibers Membrane and its Application in Affinity Sorption for BSA

WangLiangan1,ZhuangXupin1，2,ChaoGuiqun1,XuXianlin1，2,DongFeng1

(1.Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China；2.Key Laboratory of Advanced Textile Composite Materials of Ministry of Education of Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China)

In this paper, a series of chitosan-arginine(CS-Arg) with different substitution degrees were prepared by changing the molar ratio of arginine to chitosan. Chemical structure and morphology of CS-Arg were characterized through FTIR, TG and elemental analysis. CS-Arg nanofibers(CANFs) were successfully fabricated via solution blowing of CS-Arg and polylactic acid mixed. It was evaluated the adsorption characteristic of CANFs for bovine serum albumin(BSA). The adsorption capacity of A4(CANFs-4)affinity membrane for BSA was the best, which reached to 379.43 mg/g.

nanofiber affinity membrane; protein adsorption; solution blowing; chitosan; arginine

2016-11-06

國家自然科學基金資助項目(51473121)

王良安(1990—)，男，山東菏澤人，碩士研究生。

TQ342+.86

B

1009-3028(2016)06-0001-05