王紅梅，呂耀中，劉莉娜，周建明，許治良，周 軍，王振中，蕭 偉

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

不同組方加味藿香正氣軟膠囊對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響＊

王紅梅1,2＊＊，呂耀中1,2＊＊，劉莉娜1,2，周建明1,2，許治良1,2，周 軍1,2，王振中1,2，蕭 偉1＊＊＊

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

本研究考察不同組方加味藿香正氣軟膠囊對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。采用原代小鼠骨髓單核細(xì)胞用M-CSF誘導(dǎo)成骨髓巨噬細(xì)胞，經(jīng)鑒定后，用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)其產(chǎn)生各種炎癥因子（TNF-a、IL-6、IL-12p40，NO），加入不同組方的加味藿香正氣軟膠囊，收集上清檢測(cè)各種炎癥因子含量。結(jié)果顯示，原代小鼠骨髓細(xì)胞單核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)成成熟巨噬細(xì)胞，LPS（1 μg·mL-1）能刺激其產(chǎn)生炎癥因子，不同組方加味藿香正氣軟膠囊均能一定程度降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放，尤其是蒼術(shù)代替白術(shù)后效果更明顯。不同組方藿香正氣軟膠囊均可降低LPS刺激的炎癥因子的產(chǎn)生，減輕其炎癥反應(yīng)，可能是加味藿香正氣軟膠囊治療腸道炎癥的重要機(jī)制之一。

加味藿香正氣軟膠囊 脂多糖 巨噬細(xì)胞

炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s Disease，CD），是一種病因尚不明確的非特異性腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液血便，甚至出現(xiàn)一些全身并發(fā)癥。目前西藥治療IBD的主要藥物，如氨基水楊酸類和糖皮質(zhì)激素類藥物，以緩解癥狀為主，毒副作用大、容易復(fù)發(fā)；而中藥治療IBD具有標(biāo)本兼治，不易產(chǎn)生耐藥和毒副作用的特點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找IBD治療藥物具有十分重要的意義。加味藿香正氣軟膠囊源于宋代官方太醫(yī)局主持編寫的《太平惠民合劑局方》卷之二治傷寒，是由藿香正氣散改劑型而來，具有解表化濕、理氣和中等功用，主治外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯證、頭痛、惡寒、發(fā)熱、胸脘滿悶、脘腹疼痛、霍亂、嘔惡瀉痢、舌苔白膩，以及山嵐瘴瘧。研究表明，藿香正氣方具有鎮(zhèn)痛、止瀉、抗菌和調(diào)節(jié)免疫功能等多方面的作用[1-4]。另有研究顯示，感染性腹瀉都會(huì)伴隨細(xì)胞炎癥因子的升高[5]，但是藿香正氣類藥物組方中對(duì)于白術(shù)（蒼術(shù)）、制半夏（生半夏）、生姜（干姜）的用藥不統(tǒng)一，本文以藿香正氣軟膠囊為基方，對(duì)其中三味藥材進(jìn)行改變組合后考察不同組方對(duì)LPS刺激原代骨髓巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響，以期找到對(duì)炎癥抑制較好的組方，并為其在胃腸道疾病治療中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

組分1是以加味藿香正氣軟膠囊為基方，組方為白術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、半夏（制）、生姜、甘草、桔梗、大棗，其中桔梗和大棗為新加入，組分2是以蒼術(shù)代替白術(shù)，組方3是以生半夏、干姜代替半夏（制）、生姜，組方4是以蒼術(shù)、生半夏、干姜代替白術(shù)、半夏（制）、生姜組合方。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰公司），Thermo 3100二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），CKX41SF倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Costar公司），75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Costar公司），Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），移液槍（德國(guó)Eppendorf公司），BXM-30R立式壓力蒸氣滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），LD4-2A離心機(jī)（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司），c1028細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Invitrogen公司）；Bio-Plex 200系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Millipore公司）；FlexStation 3多功能鈣流工作站（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8113041）、進(jìn)口胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：608759）；紅細(xì)胞裂解液（自制，8.29 g NH4CL，1.00 g KHCO3，37.2mg Na2EDTA溶于1 000 mL蒸餾水中，pH=7.2-7.4，過濾除菌后備用）；重組小鼠M-CSF、內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysacchrides，LPS）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別是：0809AFC245、L2880）、瑞氏染液（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：BCBH7694V）；抗小鼠CD11b（APC）、F4/80（Alexa Fluor 488）（美國(guó)Life Technologies公司，批號(hào)分別是：729130B、1386817A）；CCK-8試劑盒（上海貝博生物公司，批號(hào)：BB130041）；NO檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號(hào)：S0021）；多因子檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BIO-RAD公司，批號(hào)：5036298）。

1.3 動(dòng)物

Balb/c小鼠，雌雄不限，體重18-20 g，6-8周齡。

2 方法

2.1 藥物提取制備

各味藥材分別進(jìn)行前處理、粉碎成粗粉，按各自處方用量稱取處方用藥材，混合均勻，用8倍量95%乙醇提取2次，第一次2 h，第二次1 h，過濾合并乙醇提取液，備用；藥渣用8倍量水提取2次，第一次2 h，第二次1 h，過濾合并水提取液，備用，乙醇提取液70℃減壓回收溶劑至適量（無醇味），合并水提取液；80℃減壓濃縮、干燥、粉碎，即得各組方粗提物，備用。

2.2 小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞獲取

據(jù)文獻(xiàn)方法[6]略作改進(jìn)，以頸椎脫臼法處死小鼠，經(jīng)75%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）消毒后解剖，取出股骨及脛骨，去凈肌肉及結(jié)締組織，乙醇消毒一次，剪掉骨兩端，用1 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，直至骨發(fā)白，重復(fù)以上步驟至收集足夠量的骨髓，輕輕吹散細(xì)胞，以250g離心5 min收集細(xì)胞，用2 mL紅細(xì)胞裂解液重懸以裂解紅細(xì)胞，1 min 后立即加入20 mL DMEM，充分混勻，過200目細(xì)胞篩，再以250 g離心5 min，棄上清，沉淀用PBS重懸清洗細(xì)胞兩次，用10% FBS DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)2 h后收集懸浮細(xì)胞，用1 mL含M-CSF（20 μg·L-1）的DMEM 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗和10% FBS）重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。按1×106個(gè)/mL細(xì)胞接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板，每孔2 mL。以含M-CSF的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，隔天半量換液一次。

2.3 骨髓巨噬細(xì)胞收集及鑒定

2.3.1 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

獲取小鼠骨髓細(xì)胞并用M-CSF誘導(dǎo)后，分別于第3、5、7天光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3.2 骨髓巨噬細(xì)胞瑞氏染色鑒定

收集骨髓巨噬細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞接種至加有無菌蓋玻片的6孔板，以含M-CSF的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，隔天半量換液一次，7天后取出蓋玻片晾干，加入瑞氏染液染色30 min后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并拍照。

2.3.3 骨髓巨噬細(xì)胞表面細(xì)胞標(biāo)記鑒定

收集誘導(dǎo)后骨髓巨噬細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，按1×106個(gè)/mL分裝至EP管中，分成正常組、CD11b組、F4/80組、CD11b+F4/80組，各組250g離心5 min，棄上清，用PBS（含1%BSA）洗細(xì)胞一次，分別按分組加入流式抗體室溫避光染色20 min，離心棄上清，用PBS（含1%BSA）洗細(xì)胞一次去除多余抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各種巨噬細(xì)胞的比例。

2.4 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)

調(diào)整收集誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞懸液密度為4×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種至96孔培養(yǎng)板，置37℃，5 % CO2，飽和濕度孵箱培養(yǎng)24 h，吸除舊培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白組、組方1組、組方2組、組方3組、組方4組共5組，除空白組外，每組加入終濃度為50 μg·mL-1的相應(yīng)組方藥物，每組均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提前4 h加入10 μL/孔 CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2.5 NO、TNF-α、IL-6、IL-12p40的檢測(cè)

調(diào)整收集誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞懸液密度為4×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種至96孔培養(yǎng)板，置37℃，5% CO2，飽和濕度孵箱培養(yǎng)24 h，吸除舊培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白組、LPS組、LPS+組方1組、LPS+組方2組、LPS+組方3組、LPS+組方4組，每組使LPS終濃度為1 μg·mL-1，藥物終濃度50 μg·mL-1，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用NO檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽（NO2-）水平，吸取上清50 μL加入到96孔板，按照NO試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，540 nm處用鈣流工作站測(cè)定各孔吸光度，根據(jù)所獲吸光度值在其標(biāo)準(zhǔn)曲線上查取NO；采用多因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-12p40分泌量，取細(xì)胞培養(yǎng)上清參照試劑盒說明書，Bio-Plex 200系統(tǒng)檢測(cè)各孔數(shù)值；其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-12p40、IL-6的相應(yīng)濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 誘導(dǎo)小鼠骨髓單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化

圖1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)7天形態(tài)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

獲取小鼠骨髓細(xì)胞并用M-CSF誘導(dǎo)后，第3天細(xì)胞開始出現(xiàn)聚集，5天時(shí)聚集增多，細(xì)胞出現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)特征，7天時(shí)光鏡和瑞氏染色均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞的典型形態(tài)（圖1、2）。并于誘導(dǎo)后第7天流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的分化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞分化具有CD11b和F4/80雙陽性的特征（圖3）。綜上所述，小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。

3.2 HXZQ藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

各藥物在50 μg·mL-1時(shí)對(duì)原代誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)無影響，各組與正常對(duì)照相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖2）。

圖2 4種組方藥物對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響

3.3 HXZQ藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)原代骨髓巨噬細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α、IL-12p40的影響

經(jīng)LPS刺激后各種炎癥因子均有顯著升高，炎癥模型復(fù)制成功；加藥后各組方對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子中IL-6和IL-12p40有顯著的抑制作用，與LPS組有顯著性差異，而組方1并能抑制TNF-α含量升高，但對(duì)于NO釋放無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；組方2能抑制TNF-α、NO含量升高與LPS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；組方3對(duì)TNF-α含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但可以抑制NO含量升高，與LPS有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而組方4對(duì)TNF-α、NO含量升高均能抑制，與LPS組有顯著性差異。綜上所述，各組方對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放均有一定程度的抑制，其中以組方4效果最佳（見圖3）。

圖3 4種組方藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響

4 討論

脂多糖是介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的主要啟動(dòng)因子。它可激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，引起細(xì)胞因子的合成和釋放，導(dǎo)致機(jī)體的一系列炎癥反應(yīng)。在正常情況下，靜止的巨噬細(xì)胞僅產(chǎn)生極少量的NO、TNF-α、IL-6，當(dāng)巨噬細(xì)胞受炎癥等激活后會(huì)產(chǎn)生大量的NO和TNF-α，并進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6等炎性因子的產(chǎn)生[7]，LPS刺激細(xì)胞后，各種炎癥因子均有較高表達(dá)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果相符。

本文采用LPS誘導(dǎo)骨髓原代巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子作為體外研究模型，針對(duì)不同組方的藿香正氣軟膠囊對(duì)LPS誘導(dǎo)骨髓原代巨噬細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α、IL-12p40等炎癥因子的抑制作用進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，不同組方藿香正氣軟膠囊均能不同程度抑制LPS誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，其中組方2以蒼術(shù)代替白術(shù)后，提高了對(duì)炎癥因子的抑制作用。蒼術(shù)和白術(shù)中均含有白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，為其抗炎的主要有效成分[8-9]，該類成分能調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，可能與它們作用于TLR4受體有關(guān)[10]。但是，蒼術(shù)代替白術(shù)后提高抗炎作用的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。組方3以生半夏、干姜代替半夏（制）、生姜后除抑制TNF-α含量作用稍有不同外，其余指標(biāo)未見明顯改善，文獻(xiàn)報(bào)道中制半夏較生半夏除保留了其抗炎作用，且化痰作用增強(qiáng)并降低了其部分刺激性毒性[11]；組方4效果略優(yōu)于其他組方，能顯著抑制各種炎癥因子的分泌，是因?yàn)樯n術(shù)、生半夏、干姜3種藥材聯(lián)合作用的效果。本文中樣品采用不同批次相同方法提取后用于實(shí)驗(yàn)，并實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次以降低中成藥粗制劑雜質(zhì)所帶來的樣品成分的不穩(wěn)定性，本課題組對(duì)不同組方加味藿香正氣軟膠囊共多個(gè)類方進(jìn)行了其對(duì)DSS致小鼠潰瘍性腸炎的影響實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果顯示不同組方對(duì)疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度及病理指標(biāo)上有不同程度的改善作用，由此可以證明加味藿香正氣軟膠囊有一定程度的抗炎作用，但加味藿香正氣軟膠囊在通路中具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Different Formulas of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule on Expression of Inflammatory Factors Induced by Lipopolysaccharide in Primary Murine Bone Marrow Macrophages

Wang Hongmei1,2, Lv Yaozhong1,2, Liu Lina1,2, Zhou Jianming1,2, Xu Zhiliang1,2, Zhou Jun1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical, Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001 China)

This study was aimed to investigate the effects of different formulas ofJiawei Huoxiang Zhengqi(JWHXZQ) soft capsule on expression of inflammatory factors induced by lipopolysaccharide (LPS) in the primary murine bone marrow macrophages. Murine bone marrow PBMCs were induced into macrophages by M-CSF. The bone marrow macrophages were confirmed and induced by LPS to release inflammatory cytokines (TNF-a, IL-6, IL-12p40 and NO). Extracts from different formulas of JWHXZQ soft capsule were added. The cell culture supernatants were collected to detect the contents of inflammatory cytokines. The results showed that LPS (1 μg·mL-1) stimulated the releasing of inflammatory cytokines from the mature monocyte macrophages. The levels of inflammatory cytokines were significantly reduced in the LPS induced cell treated with the extracts from different formulas of JWHXZQ soft capsule, especially in the formula whichBaishuwas replaced byCangshu.The formulas of different HXZQ soft capsule could reduce the release of inflammatory cytokines stimulated by LPS, which may be one of the important mechanisms of JWHXZQ soft capsule in treatment of inflammatory bowel diseases.

Jiawei Huoxiang Zhengqisoft capsule, lipopolysaccharide, macrophage

10.11842/wst.2016.03.023

R283

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2014-12-25

修回日期：2015-04-02

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2013DFA31090）：中藥治療胃腸道炎性疾病藥效評(píng)價(jià)體系建立，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 王紅梅和呂耀中為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。