蔣雨晗，張麗萍，周學(xué)剛，王艷芳

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

ISSR分子標(biāo)記在白芍親緣關(guān)系的應(yīng)用研究＊

蔣雨晗，張麗萍＊＊，周學(xué)剛，王艷芳

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：研究安徽、山東、北京、四川的栽培白芍和山西野生白芍的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，確定不同產(chǎn)區(qū)的白芍種質(zhì)資源的差異，為白芍育種研究提供一定參考。方法：運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，研究14份材料的遺傳多樣性水平。結(jié)果：選擇條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的7條引物進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得56條片段，其中多態(tài)性條帶38條，平均多態(tài)性比率為67.86%；運(yùn)用NTSYS軟件計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS值），得到樣品間遺傳相似系數(shù)矩陣，其中亳州1號(hào)和亳州2號(hào)間相似系數(shù)最大，這說明兩者間親緣關(guān)系較近，遺傳差異小；北京2號(hào)和山西野生白芍相似系數(shù)最小，說明兩者間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異大；利用UPGMA法，根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)各樣品進(jìn)行聚類分析，在GS值為0.72時(shí)把14個(gè)樣品分為兩大類群，北京和安徽栽培白芍為一個(gè)類群，其他品種為另一個(gè)類群。結(jié)論：4個(gè)產(chǎn)區(qū)的栽培白芍和山西野生白芍存在一定的遺傳差異性，可以從基因水平把植株外型相似的栽培品種區(qū)分開，對(duì)新品種的選育有很大的意義。

白芍ISSR分子標(biāo)記親緣關(guān)系

白芍為毛茛科芍藥屬芍藥PaeonialactifloraPall.經(jīng)去皮水煮加工后的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之功效[1]，主治胸脅疼痛、自汗盜汗、陰虛發(fā)熱、月經(jīng)不調(diào)、崩漏帶下等癥[2]。白芍主要化學(xué)成分有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥總苷具有止痛、抗炎、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應(yīng)等作用[4]，在心血管疾病和肝病的治療上已成為未來研究的重點(diǎn)[5]。白芍主產(chǎn)于中國安徽、四川、山東、浙江等地[6]，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所多年來對(duì)各產(chǎn)地白芍種質(zhì)資源進(jìn)行收集，并進(jìn)行了初步品種選育篩選出數(shù)個(gè)品系，本研究把這數(shù)個(gè)品系作為北京產(chǎn)白芍列入研究范圍。

白芍是中國傳統(tǒng)常用大宗中藥材，種植面積大，品種繁多，但其種質(zhì)資源的混亂阻礙了白芍的可持續(xù)發(fā)展。白芍品種的傳統(tǒng)鑒定方法主要從植株外型特征和化學(xué)成分上進(jìn)行區(qū)分，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，從分子水平對(duì)白芍種質(zhì)資源有了更深一步的認(rèn)識(shí)。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于藥用植物品種鑒定、親緣關(guān)系以及遺傳多樣性的研究[7]。其中，于恒秀等[8]運(yùn)用ISSR引物研究栽培芍藥品種間的親緣關(guān)系表明“藍(lán)田碧玉”與其他研究品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；王淼等[9]通過研究優(yōu)化了芍藥ISSRPCR反應(yīng)體系并把所研究的芍藥品種分為3個(gè)類群。目前，藥用白芍的相關(guān)報(bào)道較少，對(duì)各個(gè)產(chǎn)區(qū)栽培的藥用白芍的研究不夠全面。因此，本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)4個(gè)產(chǎn)地的栽培白芍和山西野生白芍的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，分析白芍的遺傳多樣性，以期為白芍的育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北京產(chǎn)白芍原植物種植于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)田，經(jīng)張麗萍研究員鑒定為毛茛科芍藥PaeonialactifloraPall.。樣品采集方法：每間隔5 m左右標(biāo)記采樣單株，每株采集正常生長的新鮮葉片4-5片，放入裝有無水硅膠的自封袋中干燥。樣品情況見表1。

表1 試驗(yàn)樣品情況

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取

取白芍葉片100 mg，采用CTAB法提取葉片基因組總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度。

1.2.2 ISSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件

ISSR反應(yīng)體系共20 μL：ddH2O 7.8 μL，（藍(lán)）MIX 10 μL，引物（100 μm）0.2 μL，DNA模板2 μL。ISSR-PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min，共33個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在紫外成像儀上觀察、拍照。

1.2.3 引物的篩選

通過查閱芍藥及其近緣科屬ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)，從中初步篩選出常用擴(kuò)增的ISSR引物20條[10，11]（見表2）。選擇編號(hào)為1、3、5、8、9的5個(gè)樣本對(duì)這20條引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物以期為所有樣品的擴(kuò)增。

表2 引物信息表

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上，有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣，NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)，并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

從20條ISSR引物中篩選出了7條能夠擴(kuò)增出清晰條帶且具多態(tài)性的引物，篩選出的引物編號(hào)：0531-018、UBC881、UBC808、UBC811、UBC835、UBC836、UBC842。

2.2 ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)14份白芍樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，從20條引物中篩選出7條能夠擴(kuò)增出清晰條帶且具多態(tài)性的引物，共獲得56條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶 38條，平均多態(tài)性比率為67.86%，擴(kuò)增的DNA片段集中在200-2 000 bp上下。平均每對(duì)引物擴(kuò)增出8條條帶，其中5.429條具有多態(tài)性。其中，多態(tài)性最高的為87.50%，低的只有57.14%。其中引物0531-018對(duì)14份白芍種質(zhì)資源擴(kuò)增圖（圖1）。7條引物總體擴(kuò)增情況見表3。

2.3 樣本親緣關(guān)系的分析

2.3.1 遺傳相似系數(shù)

利用7條引物在14份白芍葉片獲得的56條擴(kuò)增片段，在NTSYS軟件中計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS值），得到供試材料遺傳相似矩陣（見表4）。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由表3可知14份樣品的GS值范圍為：0.625 0-1.000 0，變幅為0.375。其中，亳州1號(hào)、亳州2號(hào)樣品之間的遺傳相似系數(shù)最大為1.000 0，表明兩者之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異性小。北京1號(hào)、北京2號(hào)和山西野生品種，北京2號(hào)和山東昆山霞光樣品之間的遺傳相似系數(shù)最小為0.625 0，表明這幾個(gè)樣品之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異性較大。由遺傳相似系數(shù)可知，供試樣品之間有較大的遺傳差異性。

2.3.2 聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，聚類圖見圖2。

圖1 引物 0531-018 對(duì) 14 份白芍種質(zhì)資源擴(kuò)增圖譜

表3 7對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 14個(gè)樣本遺傳相似系數(shù)矩陣

圖2 14份白芍種質(zhì)材料的UPGMA聚類圖

由以上聚類分析圖可以看出，在GS值為0.72時(shí)把14份樣本分為兩大類：①北京品種和安徽品種；②其他品種。其中，北京和安徽品種均為單瓣花型，四川和山東品種為重瓣花型。這也與實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果基本一致，說明單瓣型白芍和重瓣型白芍具有明顯的差異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)山西野生單瓣型白芍和重瓣的栽培品種遺傳差異性較小。從遺傳相似系數(shù)和聚類分析圖可知，亳州1號(hào)和亳州2號(hào)基本沒有遺傳差異，而北京品種和安徽品種具有一定的遺傳差異，從分子水平可以把兩者區(qū)分開。

根據(jù)以上遺傳差異性分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)區(qū)的白芍具有一定的遺傳差異性，而同一產(chǎn)區(qū)不同品種之間也存在差異。本次研究結(jié)果表明，北京和安徽兩個(gè)產(chǎn)區(qū)栽培白芍親緣關(guān)系較近，山西野生品種和四川、山東產(chǎn)區(qū)栽培白芍親緣關(guān)系較近，而北京、安徽產(chǎn)區(qū)的白芍和山東、四川以及山西野生品種的白芍親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)安徽、北京、山東及四川栽培品種白芍和山西野生白芍進(jìn)行研究，安徽和北京栽培品種在植株外型上都屬于單瓣花型，山東和四川栽培品種植株外形上屬于重瓣花型，從基因水平上對(duì)栽培白芍進(jìn)行研究，更具體的確定栽培白芍品種間的遺傳距離和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

本研究結(jié)果表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能有效檢測栽培白芍種質(zhì)材料的遺傳多樣性，揭示白芍遺傳背景，從聚類分析圖可以判別栽培白芍遺傳距離的大小和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對(duì)選育新品種具有重要的意義。

另外，本次實(shí)驗(yàn)所選引物多是從哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)并所公布的100條引物中選取，共性大?？梢詫?duì)芍藥屬引物進(jìn)一步開發(fā)，使引物更具有各自的特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更明確。

1 國 家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 105.

2 李 雪蓮,來平凡.白芍品種的本草學(xué)研究及現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥. 2008, 4(5): 36-38.

3 Z hu S,Yu X, Wu Y. Genetic and chemical characterization of white and red peony root derived from Paeonia lactiflora.J Nat Med-Tokyo, 2015, 69(1): 35-45.

4 李 文艷,黃山君,王瑞.中藥白芍的藥理作用和質(zhì)量控制研究進(jìn)展.藥學(xué)服務(wù)與研究. 2012, 12(2): 118-122.

5 王 秋玲,馬運(yùn)運(yùn),孫云波,等. 藥用芍藥發(fā)明專利格局與發(fā)展分析.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化. 2014, 16(7): 1476-1481.

6 查 良平,楊俊,彭華勝,等.四大產(chǎn)地白芍的種質(zhì)調(diào)查. 中藥材. 2011, 34(7): 1037-1040.

7 孫 稚穎,姚輝,王振中,等.金銀花種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化. 2013, 15(9): 1890-1895.

8 于 恒秀,王淼,梁國華,等. ISSR引物鑒定芍藥栽培品種之間親緣關(guān)系的初步研究. 植物生理學(xué)通訊. 2006, 42(2): 271-274.

9 王 淼,于恒秀,龔志云.芍藥栽培品種ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化和應(yīng)用.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2007, 28(2): 78-82.

10 周 佐斌. 白芍原植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析.南昌:南昌大學(xué), 2007, 59.

11 索 立志.利用DNAISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)芍藥屬植物栽培品種的分類鑒定方法.生物技術(shù)通報(bào). 2008,增刊: 109-112.

Application Research on Relationship of Paeonialactiflora Pall. by ISSR

Jiang Yuhan, Zhang Liping, Zhou Xuegang, Wang Yanfang
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

The purpose of this experiment was to study the genetic diversity and phylogenetic relationship ofPaeonialactifloraPall. from Anhui, Shandong, Beijing, Sichuan and Shanxi, and to provide guidance for the germplasm and breeding research inPaeonialactifloraPall. Inter-simple sequence repeat (ISSR) was conducted to assess the genetic diversity of 14PaeonialactifloraPall. cultivars. The results showed that 7 ISSR primers with clear and stable polymorphic bands were selected. In the 56 fragments obtained, 38 were polymorphisms, and the percentage of polymorphic fragment was up to 67.86%. The GS was calculated by NTSYS, among the coefficient matrix of 14PaeonialactifloraPall. The GS between Bozhou 1 and Bozhou 2 were the highest, which indicated they had lower genetic diversity level, while Beijing 2 and Shanxi were opposite. Based on UPGMA and ISSR molecular markers, the 14PaeonialactifloraPall. cultivars were divided into two groups at the GS of 0.72. Beijing and Anhui were in one group, others were in the other group. It was concluded that a higher genetic diversity level among the 14PaeonialactifloraPall. cultivars and they can be distinguished on genetic level. The result was significant for the breeding.

PaeonialactifloraPall., ISSR molecular markers, phylogenetic relationship

10.11842/wst.2016.03.015

R931.2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-11-10

修回日期：2016-01-07

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)新”項(xiàng)目（2012ZX09304006-056）：中藥材種子種苗和種植（養(yǎng)殖）標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：張麗萍。

＊＊ 通訊作者：張麗萍，研究員，主要研究方向：藥用植物規(guī)范化種植。